Method Article

בדיקת SARS-CoV-2 בקנה מידה גדול תוך שימוש באיגום דגימות רוק וטרנספוזיציה

DOI:

10.3791/64008

⸱

June 23rd, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Neuroscience, Michigan State University, 2College of Human Medicine, Michigan State University, 3COVID-19 Early Detection Program, Michigan State University, 4Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 5Biomedical Laboratory Diagnostics Program, Michigan State University, 6Department of Plant, Soil, and Microbial Sciences, Michigan State University, 7Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University, 8Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 9College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, 10College of Veterinary Medicine, Michigan State University, 11School of Packaging, Michigan State University, 12Department of Epidemiology and Biostatistics, Michigan State University, 13Department of Biosystems Engineering, Michigan State University, 14Enterprise Services, Michigan State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול נועד לשמש כתוכנית לאוניברסיטאות וארגונים אחרים השוקלים בדיקות בקנה מידה גדול ל-SARS-CoV-2 או לפתח תוכניות מוכנות להתפרצויות נגיפיות עתידיות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי ובידוד של אנשים מדבקים יחד עם בידוד של מגעים קרובים, הם קריטיים להאטת התפשטות COVID-19. בדיקות בקנה מידה גדול ביכולת מעקב או סינון לנשאים א-סימפטומטיים של COVID-19 מספקות הן נתונים על התפשטות הנגיף והן את יכולת המעקב לבדוק במהירות אנשים במהלך חשד להתפרצויות. תוכנית הגילוי המוקדם של COVID-19 באוניברסיטת מישיגן סטייט משתמשת בבדיקות בקנה מידה גדול ביכולת מעקב או סינון מאז סתיו 2020. השיטות המותאמות כאן מנצלות את האמינות, נפח הדגימה הגדול ויתרונות האיסוף העצמי של הרוק, בשילוב עם תוכנית איגום דו-ממדית חסכונית המשמרת ריאגנטים. התהליך תוכנן להיות מותאם למחסור באספקה, כאשר רכיבים רבים של הערכות והבדיקה מוחלפים בקלות. ניתן להתאים את התהליכים המתוארים לאיסוף ועיבוד דגימות SARS-CoV-2 כדי לבדוק פתוגנים נגיפיים עתידיים המתבטאים באופן אמין ברוק. על ידי מתן תוכנית זו לאוניברסיטאות או לארגונים אחרים, ניתן לפתח תוכניות מוכנות להתפרצויות ויראליות עתידיות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מגיפת COVID-19, הנגרמת על ידי נגיף SARS-CoV-2, גרמה למותם של למעלה מ-6.2 מיליון בני אדם עד כה, כאשר המספרים עולים מדי יום1. תקן הזהב לבדיקת SARS-CoV-2 הוא PCR כמותי בזמן אמת (RT-q), עם פריימרים שנועדו למקד את הגנום הנגיפי, כגון נוקלאוקפסיד, מעטפת, ספייק וגנים RNA פולימראז תלויי RNA2. בתחילת המגיפה, הייתה מחסור חמור ביכולת מספקת לבדיקות SARS-CoV-2. זה נבע מהיעדר בדיקות מאומתות, רכיבי בדיקה, כוח אדם קליני ותשתית שאינה מוכנה להתרחב במהירות כדי להתאים לבדיקות המוניות ברמת המגיפה. בשל מחסור, מרכזי בדיקה דרשו לעתים קרובות הפניית רופא כדי להיות כשירים לבדיקה. מחסור זה הביא לעיכובים באישור הבדיק....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים שבוצעו כדי לייעל את השיטות לתוכנית הגילוי המוקדם אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת מישיגן. כל הנתונים שוחזרו עם דגימות מומצאות ומייצגים את התוצאות האנושיות שנצפו. שום נתונים, מידע או תוצאות המוצגים בכתב היד אינם מאף משתתף בתוכנית הגילוי המוקדם של אוניברסיטת מישיגן.

1. ייצור ערכות

הערה: במהלך הרכבת הערכה, יש ללבוש מסכות, כפפות, מגן עיניים ומעילי מעבדה בכל עת כדי למנוע זיהום ברכיבי הערכה.

  1. הכנת רכיבי הערכה
    1. בעזרת טוש קבוע, צייר קו המציין 1 מ"ל על הצינור החרוטי של 25 מ"ל. בעזרת טוש קבוע, צייר קו המציין 1 מ"ל על צינור ההעברה.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרוב המכריע של הדגימות שהתקבלו במעבדה עד כה התקבלו ועברו את שלב בקרת האיכות החזותי. הצורך לדחות דגימה מוגבל לסיבות שיכולות להשפיע לרעה על עיבוד הדגימה ו/או על התוצאות הכוללות של הדגימה. באופן ספציפי, נפח שגוי בשפופרת, עקביות או צבע שאינם טבעיים לרוק, היעדר חרוזי קרמיקה המשמשים לסיוע בהומוגניזציה של הדגימה וברקודים חסרים הם כולם סיבות לדחיית דגימה (איור 1).

תנאי הדגימה נבדקו גם כדי לקחת בחשבון דגימות שנחשפו לאלמנטים חיצוניים בזמן שהיו בפחי האיסוף. פתרון ייצוב ה-RNA.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך עיבוד הדגימה, ישנם שלבים הדורשים תשומת לב מדוקדקת. שלב בקרת האיכות הראשוני הבוחן את נפח הדגימה, העקביות, הצבע והנוכחות של חרוזים נוספים הוא קריטי להצלחה הכוללת של התהליך. שפופרות עם דגימות שאינן מכילות את הכמות הנכונה של רוק עלולות לייצר תוצאה שלילית כוזבת, מכיוון שמעט מדי רוק יגרום לכך שלא יהיה מספיק חומר גנטי; לעומת זאת, יותר מדי רוק לא יהיה ביחס הנכון עם מאגר ה-RNA ופירוק RNA עלול להתרחש. במקרים נדירים, נוזל יהיה נוכח בשקיות הביולוגיות הבודדות, מה שמצביע על כך שצינור הדגימה נסגר.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין גילויים כספיים לגבי השיטות, האספקה, הציוד או הריאגנטים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות למשתתפים במחקרים שאושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת מישיגן סטייט ששימשו לאופטימיזציה של השיטות (STUDY00004265, STUDY00004383, STUDY00005109), כמו גם לאלה שיצאו לאסוף דגימות ששימשו לבדיקת השיטות (ד"ר קייטי מילר, אנה סטול, בריאן דיילי, ד"ר קלאודיה פינקלשטיין). מאמץ זה נתמך על ידי אוניברסיטת מישיגן סטייט.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 שלב מ"מ, ללא ROXThermo FisherA28523
1.2 מ"ל צלחות באר עמוקותFisherAB0564
100 מ"ל מאגרי ריאגנטיםקורנינג4872
2.8 מ"מ חרוזי קרמיקהOMNI19-646
25 מ"ל חרוטי עם מכסה בורגVWR76338-496
50 מ"ל V מאגרים תחתונים Costar4870
5430-צנטריפוגה מהירהEppendorf22620601
5 מ"ל צינור EppendorfFisher14282300
8 צינורות רצועהלטכנולוגיות חיים4316567
בטא מרקפטואתנולפישרAC125472500
אתנול 200 הוכחה, ביולוגיה מולקולרית כיתהפישרBP28184
Microamp Endura אופטי 96-well מהיר צלחת תגובה ברורה עםברקוד חיים טכנולוגיות4483485
מיקרואמפר מהיר אופטי 96 באר צלחתפישר4346906
מיני מיקרוצנטריפוגהקורנינג רפואי6770
כובעים אופטיים עבור רצועהצינורות טכנולוגיות חייםAB-1820
אופטי סרטתרמו פישר
4311971 PCR צלחת איטום סרט לא אופטיפישרAB-0558
PCR צלחת חצי חצאיתפישר14230244
QuantStudio 3 מערכת PCR בזמן אמת, 96 בארות, 0.1 מ"לתרמו פישרA28136
אישור ערכת RNA ויראלית מהירהZymoR1035
מאגר ריאגנטים, 100 מ"לDOT229298
RNA ShieldZymoR1200-1L
שקיות ביולוגיות קטנותפישר180000
Taqpath RTPCR ערכת COVID19תרמו פישרA47814
תרמו מדעי סורוול ST4R פלוס צנטריפוגהתרמו פישר75009525
העברת פיפטפישר22170404
ויראלי 96 ערכתZymoR1041
מערבולת מיקסרפישר2215414
של QuantStudio

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , Available from: https://covid19.who.int/ (2022).
  2. John Hopkins Center for Health Security. Center for Health Security. Comparison of National RT-PCR primers, probes, and protocols for SARS-CoV-2 diagnostics. John Hopkins Center for Health Security. , Centerforhealthsecurity.Org 5(2020).
  3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SARS CoV 2 TestingSaliva TestingSample PoolingCOVID 19 SurveillanceAsymptomatic ScreeningTwo Dimensional PoolingViral DetectionSelf Collection SalivaLarge Scale TestingViral Pathogen Preparedness
Video Coming Soon

Related Articles