מוטות מיקרוג'ל עם קבוצות תגובתיות משלימות מיוצרים באמצעות מיקרופלואידיקה עם היכולת להתחבר בתמיסה מימית. המיקרוג'לים האניזומטריים נתקעים ומתחברים למבנים יציבים עם נקבוביות גדולות יותר בהשוואה למערכות מבוססות כדוריות. מיקרו-ג'לים שעברו שינוי עם GRGDS-PC יוצרים מבנים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים שיכולים לשמש לתרבית תאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פיגומים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים משולבים ממוטות מיקרוג'ל
במאמר זה
סיכום
תקציר
מערכת דו-רכיבית של מיקרוג'לים פונקציונליים ממיקרופלואידיקה מאפשרת קישור מהיר למבנים מקרו-נקבוביים תלת-ממדיים בתמיסות מימיות ללא תוספים נוספים. ג'לציה רציפה על השבב מאפשרת וריאציה של יחס הגובה-רוחב של המיקרוג'ל, הקובע את תכונות אבני הבניין עבור המבנים המתקבלים. מונומרים של גליצידיל מתקרילט (GMA) או 2-אמינואתיל מתקרילט (AMA) עוברים קופולימריזציה לרשת המיקרו-ג'ל על בסיס פולימרים של פוליאתילן גליקול (PEG) כדי להשיג פונקציונליות של אפוקסי או אמין. זרימת שמן ממוקדת מוחדרת למבנה השקע המיקרופלואידי כדי להבטיח איסוף רציף של מוטות המיקרוג'ל הפונקציונליים. בהתבסס על פרסום שפורסם לאחרונה, מבנים מבוססי מוטות מיקרוג'ל גורמים לנקבוביות גדולות יותר של כמה מאות מיקרומטרים, ובמקביל מובילים ליציבות פיגומים גבוהה יותר באופן כללי בהשוואה למודל מבוסס כדוריות. בדרך זו, ניתן לייצר מבנים בנפח גבוה יותר עם נפח חופשי יותר תוך הפחתת כמות החומר הנדרשת. הפיגומים המקרו-נקבוביים המחוברים זה לזה ניתנים לאיסוף ולהובלה ללא נזק או התפוררות. קבוצות אמין ואפוקסי שאינן מעורבות בקישור הדדי נשארות פעילות וניתן להשתמש בהן באופן עצמאי לאחר השינוי. פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית לייצור מוטות מיקרוג'ל ליצירת פיגומים מקרו-נקבוביים מקושרים שיכולים לשמש לניסויים הבאים בתאים.
מבוא
כדי לחקור התנהגות מורכבת של תאים שיתופיים במבנים תלת-ממדיים, פלטפורמות פיגומים צריכות להראות ביצועים עקביים ביכולת השחזור, להיות בעלות גיאומטריה מתאימה לנדידת תאים, ובמקביל לאפשר גמישות מסוימת במונחים של שינוי פרמטרים כדי לחקור את השפעתם על הרקמה החיה1. בשנים האחרונות, הרעיון של חלקיקים מקרו-נקבוביים (MAP), שתואר לראשונה על ידי Segura et al., התפתח לפלטפורמה יעילה ורב-תכליתית לייצור פיגומים תלת-ממדיים2. ההרכב המותאם של המיקרו-ג'לים, שהם אבני הבניין של הפיגום התלת-ממדי הסופי, מגדיר מראש תכונות כגון קשיחות המבנה, התגובתיות הכימית הסלקטיבית של רשת הג'ל וגודל הנקבוביות הסופי של הפיגום 2,3,4,5,6.<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. חומר נדרש והכנות למיקרופלואידיקה
- עבור ההליך microfluidic המתואר, להשתמש 1 מ"ל ו 5 מ"ל מזרקי זכוכית משאבות מזרק. היווצרות טיפות על השבב נצפתה באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמה במהירות גבוהה.
- צור את תכנון השבב המיקרופלואידי (איור 1B) באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב והפק תבנית אב כפי שכבר דווח12.
- השג קרינת UV מבוקרת באמצעות UV-LED שנבנה בעצמו (λ = 365 ננומטר, קוטר ספוט ~ 4.7 מ"מ) המספק הקרנה במהירות של 957 mW / cm2 דרך זכוכית כיסוי בעובי 0.13 מ"מ.
הערה: קח בחשבון ייצור חום מקומי אפשרי על ידי ה- UV-LED במהלך הקרנה. אם זה המקרה, ודא קירור מספיק ע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 2: מבנה פיגומים מקרו-נקבוביים מוצלבים . (A) הקרנה תלת-ממדית של ערימת Z של מיקרוסקופיה קונפוקלית בגודל 500 מיקרומטר של הפיגום המקרו-נקבובי המקושר. סרגל האבנית מייצג 500 מיקרומטר. (B) פיגום מקושר המורכב מ~10,000 מוטות מיקרו-ג'ל על כיסוי שנלקחה ישירות מהמים. סרגל קנה המידה מייצג 5 מ"מ.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אחד השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הוא האיכות של 2-אמינואתיל מתקרילט (AMA) המשמש כקומונומר לתפקוד אמין ראשוני. ה-AMA צריכה להיות אבקה עדינה ועדיף חסרת צבע המועברת במיכל זכוכית חום אטום לגז. יש להימנע משימוש בחומר ירקרק וגבשושי, שכן הוא פוגע באופן משמעותי בתגובת הג'לציה ומשפיע לרעה על יכולת השחזור של התוצאות. במקרה של ג'לציה לקויה ומוטות מיקרוג'ל לא יציבים, ניתן לשקול לשנות את הספק.
אם הערבוב של מוטות מיקרוג'ל אמין ואפוקסי מוביל לאשכולות מקושרים מרובים ולא למבנה יציב אחד, בדוק את מספר המוטות בכל .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מבטיחים כי אין ניגודי עניינים.
תודות
אנו מביעים את תודתנו למחברים השותפים של עבודתנו הקודמת שמתודולוגיה זו מבוססת עליהם, סלין ממזר, לואיס פ. ב. גרזוני, יונקה קיטל, רוסטיסלב וינוקור, ניקולאי בורן ותמאס הרסטי. אנו מודים על מימון מ- Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) במסגרת הפרויקט B5 ו- C3 SFB 985 "מיקרוג'לים פונקציונליים ומערכות מיקרוג'ל". אנו מכירים במימון מוועדת התחרות של הסנאט של לייבניץ (SAW) במסגרת תוכנית Professorinnenprogram (SAW-2017-PB62: BioMat). אנו מכירים בכנות במימון מהנציבות האירופית (EUSMI, 731019). עבודה זו בוצעה בחלקה במרכז לטכנולוגיית פולימרים כימיים (CPT), אשר נתמך על ידי האיחוד האירופי והמדינה הפדרלית של נורדריין-וסטפאליה (מענק EFRE 30 00 883 02).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | פעילי שטח לא יוניים |
| 2-אמינואתיל מתאקרילט הידרוכלוריד | TCI Chemicals | A3413 | >98.0% (T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | תוכנת Autodesk לעיצוב בעזרת מחשב (CAD); מידול של עיצובים מיקרופלואידיים | ||
| מסנן מזרק CHROMAFIL MV A-20/25 | XH49.1 | גודל נקבוביות 0.20 ומיקרו; m; אסטרים מעורבים תאית (MV) | |
| כיסוי זכוכית | Marienfeld-Superior | סוג מס' 1 | |
| EMS כלי דגימת ליבת קו שוויצרי 0.75 מ"מ | אלקטרונים מדעי | 0.77 מ"מ קוטר פנימי, קוטר חיצוני 1.07 מ"מ | |
| אתנול אבסולוט | VWR כימיקלים | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS מצלמה מהירה | מערכות | ||
| FLIRאיזומר פלואורססינאמין I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8' ’ מחטים 0,50 x 16 מ"מ | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥ 97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| מזרקים אטומים לגז מסדרת המילטון 1000 | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| ליתיום פניל-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥ 95 |
| מוטיק AE2000 מיקרוסקופ משולש | טד פלה, בע"מ | 22443-12 | |
| Novec 7100 | סיגמא-אולדריץ' | SHH0002 | |
| שמן אדום O | סיגמא-אולדריץ' | O9755 | |
| פרפין | VWR כימיקלים | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | אופטיקה11Life | ||
| פוספט חוצץ מלח | תרמו פישר מדעי | AM9624 | |
| פוליאתילן צינורות 0.38 פעמים; 1.09 מ"מ דרגה | רפואית טיפה ID 0.38 מ"מ OD 1.09 מ"מ | ||
| 2-פרופנול | סיגמא-אולדריץ' | 190764 | מגיב ACS, ≥ 99.5% |
| חלבון LoBind צינורות | אפנדורף | 30108132 | |
| משאבת 11 פיקו פלוס עלית משאבת מזרק ניתנת לתכנות | הרווארד מכשיר | ||
| RPMI 1640 בינוני | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 ערכת אלסטומר סיליקון | Dow SYLGARD | 634165S | |
| טריכלורו-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-סילאן | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED תיבת עיקור | UVLED אופטית ושות 'בע"מ | 9S SZH8-S2 |
מקורות
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound heal....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
