מאמר שיטה

שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות של Caenorhabditis elegans-Bacterial

DOI:

10.3791/64027

⸱

22 ביולי 2022

 ,  , 
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיבוש של 96 קידוחים של קאנורהבדיטיס אלגאן (Caenorhabditis elegans ) המיושבים בחיידקים בעקבות שיתוק קר והלבנת פני השטח כדי לסלק חיידקים חיצוניים. התרחיף המתקבל מצופה על לוחות אגר כדי לאפשר כימות מדויק בתפוקה בינונית של עומס חיידקים במספר גדול של תולעים בודדות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנמטודה Caenorhabditis elegans היא מערכת מודל לאינטראקציות בין פונדקאי למיקרוב ולמיקרוביום מארח-מיקרוביום. מחקרים רבים עד כה משתמשים בתקצירי אצווה ולא בדגימות תולעים בודדות כדי לכמת את עומס החיידקים באורגניזם זה. כאן נטען כי השונות הבין-אישית הגדולה הנראית בהתיישבות חיידקית במעי C. elegans היא אינפורמטיבית, וכי שיטות העיכול של האצווה משליכות מידע החשוב להשוואה מדויקת בין תנאים. מכיוון שתיאור השונות הטבועה בדגימות אלה דורש מספר רב של פרטים, נקבע פרוטוקול נוח של לוחות 96 בארות לשיבוש וציפוי מושבה של תולעים בודדות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטרוגניות באסוציאציות בין חיידקים מארחים נצפית בכל מקום, ושונות בין פרטים מוכרת יותר ויותר כגורם תורם בתהליכים ברמת האוכלוסייה מתחרות ודו-קיום1 ועד העברת מחלות 2,3,4. ב- C. elegans, "הטרוגניות נסתרת" בתוך אוכלוסיות איזוגניות נצפתה שוב ושוב, כאשר תת-אוכלוסיות של פרטים הראו פנוטיפים שונים בתגובת הלם חום 5,6, הזדקנות ותוחלת חיים 7,8,9,10,11, והיבטים רבים אחרים של פיזיולוגיה ופיתוח12 . רוב הניתוחים המנסים לזהות מבנה תת-אוכלוסייה מספקים ראיות לשתי תת-אוכלוסיות באוכלוסיות ניסיוניות של תולעים איזוגניות ומסונכרנות 5,7,8, אם כי נתונים אחרים מצביעים על האפשרות של התפלגות בתוך האוכלוסייה של תכונות ולא קבוצות מובחנות 7,12,13 . רלוונטי כאן, הטרוגניות משמעותית באוכלוסיות מעיים נצפית אפילו בתוך אוכלוסיות איזוגניות של תולעים המיושבות ממקור משותף של מיקרובים 13,14,15,16, והטרוגניות זו יכולה להיות מוסתרת על ידי מדידות תקציר אצווה הנמצאות בשימוש נרחב 17,18,19,20 לכימות חיידקים בתולעת.

עבודה זו מציגה נתונים המצביעים על צורך בהסתמכות רבה יותר על מדידות של תולעים בודדות בקשר בין מיקרובים מארחים, כמו גם פרוטוקולים להגברת הדיוק והתפוקה בהפרעה לתולעת בודדת. פרוטוקולים אלה נועדו להקל על הפרעה מכנית של מספר גדול של C. elegans בודדים לכימות של עומס חיידקי בר-קיימא, תוך מתן יכולת חזרה טובה יותר ומאמץ נמוך יותר לכל דגימה מאשר הפרעה מבוססת מזיקים של תולעים בודדות. שלב מומלץ לטיהור המעיים, שבו תולעים מורשות להיזון מאי קולי מומת בחום לפני ההכנה לשיבוש, נכלל כדי למזער את התרומות של חיידקים ארעיים (שאינם דבקים) שנבלעו לאחרונה ואחרים (שאינם דבקים). פרוטוקולים אלה כוללים שיטת שיתוק קר לניקוי הציפורן עם טיפול באקונומיקה משטח בריכוז נמוך; הלבנת פני השטח יכולה לשמש כשלב הכנה בהפרעה לתולעת בודדת או כשיטה להכנת תולעים חיות, נטולות חיידקים מבחוץ. שיטת הלבנת פני השטח הזו מספיקה כדי להסיר מגוון רחב של חיידקים חיצוניים, וטיפול בקור מספק אלטרנטיבה לשיתוק קונבנציונלי מבוסס לבאמיזול; בעוד ש-levamisole יהיה מועדף לניסויים רגישים לקור, שיתוק קר ממזער את התרומות לזרמי פסולת מסוכנים ומאפשר חידוש מהיר של פעילות תקינה. בעוד שהפרוטוקול המלא מתאר ניסוי מעבדה שבו תולעים מתיישבות עם חיידקים ידועים, ההליכים לניקוי תולעים ושיבוש תולעים בודדות יכולים להיות מיושמים בקלות על תולעים שבודדו מדגימות בר או התיישבו בניסויי מיקרוקוסמוס. הפרוטוקולים המתוארים כאן מייצרים חיידקים חיים המופקים ממעי התולעת, המתאימים לציפוי ולכימות של יחידות יוצרות מושבה (CME) בתולעים בודדות; לצורך ניתוח קהילת המעיים המבוסס על ריצוף, יש להוסיף לפרוטוקולים אלה את שלבי התזה התאית ומיצוי חומצות הגרעין הבאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תולעים ששימשו בניסויים אלה התקבלו מהמרכז הגנטי Caenorhabditis , הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440). בריסטול N2 הוא הסוג הפראי. המוטנטים DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) ו-daf-2(e1370) III (CGC CB1370) משמשים להמחשת הבדלים בעומס חיידקי במעיים.

HT115(DE3) E. coli הנושא את וקטור RNAi pos-1 הוא מספריית אהרינגר21. אוסף MYb של חיידקי מעיים מקומיים מסוג C. elegans 22 התקבל במעבדת שולנבורג. סלמונלה אנטריקה LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR הוא ממעבדה זו23. Pseudomonas mosselii היה מבודד במעבדה זו. סטפילוקוקוס אאורוס MSSA Newman pTRKH3-mGFP התקבל ממעבדת LaRock באוניברסיטת אמורי.

כל מאגרי התולעים והמדיה מוכנים על פי ספרות24 שפורסמה בעבר עם שינויים קלים (ראו קובץ משלים 1).

1. הכנת C. elegans סטריליים מסונכרנים

הערה: בסעיף זה מתוארים נהלים שלב אחר שלב ליצירת אוכלוסייה מסונכרנת של תולעים בוגרות סטריליות מבחינה רבייתית. האכלה על צלחות pos-1 RNAi משמשת כאן כדי למנוע ייצור של צאצאים כי הפרעה זו היא קטלנית עוברית; זחלי L1 שגדלו לבגרות ב-pos-1 RNAi מתפתחים להרמפרודיטים מטילים ביצים, אך ביצים אלה הןבלתי ניתנות לערעור 25. פרוטוקול ההזנה של RNAi הוא כמו בפרק "גנטיקה הפוכה" של Wormbook26.

  1. לפני סנכרון התולעים, ודא כי צלחות NGM + pos-1 RNAi טריות בגודל 10 ס"מ + pos-1 זמינות. ניתן להכין צלחות טריות מתרבית נוזלית מושרית מרוכזת (+Amp +IPTG) או לחסן אותן כמדשאות על NGM + 100 מיקרוגרם /מ"ל אמפיצילין + 1 mM IPTG ולאפשר להן לצמוח בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך במשך יוםאחד 27.
    הערה: קרבניצילין (25 מיקרוגרם/מ"ל) משמש לעתים קרובות במקום אמפיצילין על צלחות RNAi. אמפיצילין הוא פחות יקר אבל פחות יציב; אם משתמשים באמפיצילין, יש לזרוע צלחות מיד לאחר הייבוש ולהשתמש בהן בהקדם האפשרי (ניתן לאחסן במשך <שבוע ב-4 מעלות צלזיוס)27. הריכוז האנטיביוטי הגבוה המומלץ כאן יסייע להבטיח בחירה נאותה.
  2. התחילו עם מספר (בדרך כלל שתיים עד ארבע) לוחות NGM עם אוכלוסיות גדולות של הרמפרודיטים גרבידיים. בודדו ביצים באמצעות סנכרון אקונומיקה-NaOH24.
    1. לשטוף תולעים מצלחות אגר באמצעות 2 מ"ל של ddH2 O סטרילילכל צלחת. מפזרים את הנוזל באופן שווה לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל (צינור אחד לכל צלחת או הרמפרודיטים).
    2. סובבו כלפי מטה במשך כ-5 שניות במיני-סנטריפוגה (2,000 x גרם) כדי למשוך את המבוגרים לתחתית הצינורות. פיפטה מחוץ לסופרנטנט ולהשליך.
    3. לשטוף עם 1 מ"ל של ddHסטרילי 2O; סובבו למטה כמו קודם והשליכו את הסופרנאטנט.
    4. חזור על השלב הקודם כדי להפחית את פסולת החיידקים שנותרה.
    5. יש להחיות את התכולה של כל צינור ב-1 מ"ל של ddH2O. יש להוסיף לכל צינור 130 μL של אקונומיקה מסחרית (8.25% נתרן היפוכלוריט) ו-130 μL של 5 N נתרן הידרוקסיד (NaOH, ריכוז סופי 0.5 N).
    6. צינורות וורטקס נמרצים במשך 10-15 שניות לפחות כל 2 דקות עד שגופים בוגרים מתפרקים. אל תאפשרו לטיפול באקונומיקה-NaOH להימשך יותר מ-5 דקות כדי להימנע מהריגת ביצים.
    7. סובבו במיני-סנטריפוג' במשך 30-60 שניות ב-2,000 x גרם כדי להפיל את הביצים. פיפטה מחוץ לסופרנטנט ולהשליך. יכול להיות או לא יכול להיות כדור גלוי, זה נורמלי.
    8. הוסף 1 מ"ל של מאגר תולעת M9 וסובב במשך 30-60 שניות ב 2000 x g. השליכו את הסופרנאטנט.
    9. חזרו על שלב השטיפה (1.2.8) פי 5 כדי להסיר ביסודיות את תערובת האקונומיקה-NaOH, תוך הסרת חלק גדול ככל האפשר של חומר העל מבלי להפריע לכדור הביצה.
    10. מעבירים ביצים ל-10 מ"ל של חיץ תולעי M9 בצינור חרוטי של 50 מ"ל או בצינור תרבית של 30 מ"ל עם מכסה. אם אתם משתמשים בצינורות חרוטיים, השאירו את המכסה לא מעוגל מעט והשתמשו במעט נייר דבק כדי לשמור עליו מאובטח. דגירה עם רעידות למשך הלילה (16 שעות) ב-25 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד כדי לאפשר לזחלים לבקוע.
  3. העבר זחלי L1 מסונכרנים לצלחות RNAi כדי לגדול לבגרות.
    1. הוסף 2 מ"ל של חיץ M9 סטרילי + 0.01% Triton X-100 (מעתה M9TX-01) לכל צינור L1 והעבר את כל הנפח (12 מ"ל) לצינור חרוטי בורגי 15 מ"ל.
    2. הניחו צינורות של 15 מ"ל עם תולעי L1 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להאט את תנועת הזחל.
    3. סובב כלפי מטה צינורות חרוטיים של 15 מ"ל בצנטריפוגה שולחנית גדולה (1,500 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; ההאצה וההאטה צריכות להיות לא יותר מ-80% מהמקסימום).
    4. פיפטה בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור L1. השליכו את הסופרנאטנט.
    5. הוסף 12 מ"ל של M9TX-01 קר לכל צינור. חזור על הצנטריפוגה. בזהירות פיפטה להשליך את supernatant. כל צינור צריך להכיל כ-200 μL שנותרו.
    6. יש לשטוף קצה פיפטה של 200 μL ב-M9TX-01 כדי למנוע מהתולעים להידבק לפלסטיק, ולאחר מכן השתמשו בקצה זה כדי להחיות את גלולת התולעת. מעבירים את התולעים המחודשות לצלחות קופה-1 מוכנות על ידי צנרת טיפות של נוזל על מדשאת החיידקים.
    7. דגירה של הצלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עד ליום הראשון לבגרות.
      הערה: אם מגדלים תולעים על צלחות RNAi pos-1 , התולעים חייבות להזין את ad libitum על חיידקי RNAi עד שהן עברו באופן מלא לבגרות כדי להבטיח חדירה גבוהה של הפנוטיפ העוברי-קטלני. בדוק את הצלחות ב 24 ו 48 שעות. אם הצלחות נראות מורעבות או כמעט מורעבות, יהיה צורך להעביר את התולעים לצלחות טריות כדי לסיים לגדול למבוגרים בגודל מלא. כדי למנוע הידלדלות של צלחות לפני גידול התולעים, שאפו להוסיף זחלי 250-500 L1 לכל צלחת RNAi בגודל 10 ס"מ.
  4. קוצרים מבוגרים ומנקים את ה-E. coli במעיים כדי ליצור תולעים נטולות חיידקים.
    1. יש לשטוף תולעים בוגרות מצלחות באמצעות 5 מ"ל של M9TX-01 לכל צלחת. מעבירים חיץ + תולעים לצינור חרוטי של 15 מ"ל ומאפשרים למבוגרים להתיישב בתחתית הצינור.
    2. יש לשטוף את המבוגרים בשינויים של 10 מ"ל של מאגר M9TX-01 טרי עד שלא נותרה עכירות חיידקית נראית לעין (בדרך כלל פי 1-2). צינורות יכולים להיות צנטריפוגות ב 700 x g עבור 30 s כדי תולעים גלולה, או מבוגרים יכולים להיות מורשים להתיישב על ידי כוח הכבידה.
    3. בצע שטיפה אחת נוספת עם 10 מ"ל של M9TX-01 כדי להפחית את החיידקים החיצוניים.
    4. העברת תולעים לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל או צינורות תרבית של 30 מ"ל המכילים 5 מ"ל S Medium + 2x E. coli OP50 מומת בחום (~5 x 109 תאים מומתים/מ"ל) + 200 מיקרוגרם/מ"ל של גנטמיצין + 50 מיקרוגרם/מ"ל של כלורמפניקול. אם אתם משתמשים בצינורות חרוטיים, השאירו את המכסה לא מעוגל מעט והשתמשו במעט נייר דבק כדי לשמור עליו מאובטח. השתמשו בפיפטות זכוכית או שטפו פיפטות פלסטיק ב-M9TX-01 כדי למנוע מהתולעים להידבק.
    5. הדגירו מבוגרים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200 סל"ד למשך 24-48 שעות כדי לייצר מבוגרים ללא חיידקים.
      הערה: אם התולעים יישארו באנטיביוטיקה במשך >24 שעות, ייתכן שיהיה צורך להוסיף יותר OP50 מומת חום כדי להבטיח שלתולעים יש מקור מזון הולם. בדקו את הצינורות ב-24 שעות והוסיפו ל-OP50 מוכה חום אם העכירות מצטמצמת בעליל.
  5. סוכרוז לשטוף מבוגרים על פי פרוטוקולי Wormbook24 כדי להשיג מלאי נקי, סטרילי מבחינה רבייתית ומסונכרן למבוגרים בלבד להתיישבות חיידקים.
    1. ודא שנפחים קרים של 60% סוכרוז, מאגר תולעים M9 ו- M9TX-01 מוכנים לשימוש. לשם הפשטות, ניתן להשאיר אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בלילה הקודם.
    2. כדי שכל דגימה תישטף, צרו צינור חרוטי מסומן של 15 מ"ל המכיל 8 מ"ל של M9TX-01 והניחו בצד את הקרח. אלה יידרשו בשלב 1.5.10.
    3. הוסף 5 מ"ל של M9TX-01 לכל צינור 50 מ"ל המכיל זחלי L1. העבר את כל הנפח (כיום 10 מ"ל) לצינור חרוטי ראשון ריק של 15 מ"ל ואפשר למבוגרים להתיישב בתחתית הצינור.
    4. בזהירות לטפטף את supernatant להשליך.
    5. הוסף 10 מ"ל M9TX-01 לכל צינור והעביר צינורות לדלי קרח למשך 5-10 דקות.
      הערה: החל מנקודה זו, תולעים וכל המאגרים צריכים להישמר על קרח.
    6. השתמש בהגדרת "טמפ' מהירה" כדי לקרר צנטריפוגת שולחן גדולה ל-4 מעלות צלזיוס.
    7. הוסיפו 10 מ"ל של M9TX-01 קר לכל צינור כדי לשטוף את כל הפסולת שנותרה. תנו לתולעים להתיישב על קרח; להסיר את supernatant ולהשליך.
    8. Sucrose לצוף: להוסיף 5 מ"ל של חיץ M9 קר ו 5 מ"ל של תמיסת סוכרוז קר 60% לכל צינור, ערבוב יסודי. לאחר מכן, צפו בזהירות 1 מ"ל של חיץ M9 קר על גבי תערובת סוכרוז-חיץ בכל צינור. אין לערבב לאחר הוספת המצוף.
      אזהרה: לנוע במהירות לקראת הצעדים הבאים - תולעים יכולות להתייבש אם הן נחשפות לריכוזים גבוהים של סוכרוז במשך זמן רב מדי!
    9. צנטריפוגה ב 1500 x g במשך 3 דקות ב 4 ° C. תולעים בוגרות חיות יהיו בממשק של M9 והסוכרוז, כ-1 מ"ל מראש הצינור.
    10. השתמש בפיפטה סרולוגית זכוכית 5 מ"ל כדי להעביר את שכבת התולעת לצינורות חרוטיים מוכנים של 15 מ"ל עם M9TX-01 קר (משלב 1.5.2). היזהרו מאוד לקבל את שכבת התולעים החיות מבלי לטפטף יותר מדי מהסוכרוז.
    11. במידת הצורך, הוסף M9TX-01 כדי לקבל נפחים שווים של 10-12 מ"ל / שפופרת. צנטריפוגה ב 1500 x g ב 4 ° C במשך 1 דקה, ולאחר מכן pipette את supernatant. ניתן להחזיר תולעים לטמפרטורת החדר בשלב זה.
    12. חזור על שלב הכביסה 1.5.11 פעמיים, והפחית את המהירות ל-700 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס ואת הזמן ל-30 שניות.

2. האכלת תולעים בחיידקים חיים בתרבית נוזלית

הערה: פרוטוקול זה משמש ליישוב תולעים עם חיידקים שגודלו במעבדה בתנאים מעורבים היטב בתרבית נוזלית (איור משלים 1). ניתן ליישב תולעים עם מבודדים בודדים מתרבית טהורה (למשל, פתוגנים כגון אנטרוקוקוס פקסיום28,29) או תערובות של מבודדים (למשל, קהילות מיקרוביום מינימליות14).

  1. התחילו עם תולעים בוגרות מסונכרנות של סוכרוז משלב הפרוטוקול 1.5 בצינור חרוטי של 15 מ"ל. לשטוף את התולעים פעם אחת ב 12 מ"ל של S buffer ולהשליך את supernatant.
  2. החייא את התולעים השטופות בנפח של מדיום S הדרוש לניסוי. קחו בחשבון את נפח תנאי הניסוי, את מספר התנאים שבהם יתפצלו התולעים ואת הריכוזים הסופיים של תולעים וחיידקים.
    הערה: האכלה בתולעים משתנה בהתאם לזמינות החיידקים30 ותולעים יכולות להיות לחוצות על ידי צפיפותשל 31. עבור קולוניזציה בתרבית נוזלית, מומלץ <1000 תולעים /מ"ל ו- >107 CFU / mL; 1011 CFU/mL נחשב לצפיפות האכלה "ad libitum" ב-E. coli32.
  3. סובבו את תרביות החיידקים. לשפוך את supernatant; ניתן להשתמש בשאיפה או בצנרת כדי להסיר את ה-supernatant עבור חיידקים שיוצרים כדורים רופפים.
    הערה: עבור תרביות >5 מ"ל, העבר לצינורות 15 מ"ל וסובב ב~ 2800 x g בצנטריפוגה שולחנית גדולה למשך 8-10 דקות. ניתן להעביר תרביות <5 מ"ל לצינורות 1.5 מ"ל ולצנטריפוגה ב-9000 x g למשך 1-2 דקות בצנטריפוגה שולחנית קטנה. ייתכן שיהיה צורך לצנן חיידקים תנועתיים מאוד (למשל, מינים רבים של Pseudomonas) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות כדי להקל על היווצרות כדור יציב, וייתכן שעדיף לצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. החייאת תרביות חיידקים בכרך אחד של חיץ S וצנטריפוגה שוב לכדור. הסר והשליכו את ה-supernatant כבעבר.
  5. בצעו החייאה בתרביות חיידקים במדיום S בצפיפות הרצויה לניסוי, בתוספת כל אנטיביוטיקה לבחירה. האנטיביוטיקה שתשמש, אם בכלל, תהיה תלויה בפרופיל העמידות של החיידקים המשמשים להתיישבות.
  6. באמצעות קצה פיפטה המצופה ב-M9TX-01, תולעי פיפטה עולות ויורדות בעדינות עד שהתולעים עוברות החייאה יסודית במדיום S, ואז מועברות לצינורות או לבארות צלחות להתיישבות חיידקית.
  7. הוסיפו תרחיף חיידקי לכל תרבית תולעים כדי להגיע לריכוז החיידקים הרצוי ולנפח הסופי הרצוי.
  8. אם אתם משתמשים בצלחת מרובת בארות להתיישבות, מכסים את הצלחת בקרום איטום סטרילי של 96 בארות חדירות לגז.
  9. דגירה עם רעידות ב-200 סל"ד כדי למנוע מחיידקים להתיישב במהלך הדגירה.

3. הפרעה מכנית של תולעים בודדות בפורמט של 96 בארות

הערה: סעיף זה מתאר פרוטוקול בפורמט של צלחת 96 בארות לשיבוש מכני של C. elegans בודדים המיושבים בחיידקים. הצעדים הראשונים בפרוטוקול (3.1-3.8) מתארים שיטה לטיהור חיידקים שאינם דבוקים ממעי התולעת ולנקות את החלק החיצוני של התולעים באמצעות שיתוק קר והלבנת פני השטח. שלבים אלה ייצרו תולעים בוגרות נקיות וחיות, שניתן לשבש אותן באופן מכני לצורך כימות תכולת החיידקים (3.8 קצוות) או להשתמש בהן לניסויים נוספים (איור משלים 1). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לכימות חיידקים בתולעים המיושבות בתרבית נוזלית (סעיף 2), על צלחות אגר, או מאדמה טבעית או מיקרוקוסמוסית.

  1. מניחים אליקוט של M9TX-01 על קרח כדי לצנן (פי 4-5 ממספר הדגימות במ"ל).
  2. מכינים אליקוט של M9TX-01 + אקונומיקה (6% נתרן היפוכלוריט, 1:1000 או 1:2000 v/v, 1 מ"ל לדגימה + 1 מ"ל תוספת) ומניחים על קרח לקירור. ציטוט זה ישמש בשלב 3.8.
  3. הכינו צלחות של 96 בארות לדילול סדרתי של דגימות תולעים משובשות.
    1. להשיג לוחות סטריליים 300 μL קיבולת 96-well עם מכסים; פרוטוקול זה משתמש בצלחת דילול אחת לכל 12 תולעים שהתעכלו.
    2. השתמש בצינור רב-ערוצי בן 96 בארות כדי למלא שורות B-D של כל לוחית 96 באר (קיבולת של 300 μL) עם 180 μL של מאגר PBS 1x. השאר את השורה העליונה ריקה. שורות B-D יהפכו לדילולים סדרתיים פי 10 של תקצירי התולעת [0.1x, 0.01x, 0.01x].
    3. הניחו צלחות בצד. לוחות דילול ישמשו בשלב 3.13.
  4. בצעו החייאה של כל דגימת תולעת ב-1 מ"ל של M9TX-01 בצינור מיקרו-סנטריפוג' של 1.5 מ"ל.
  5. סובבו צינורות לזמן קצר (2-3 שניות) במיני-סנטריפוג' במהירות נמוכה (2,000 x גרם) ב-25 מעלות צלזיוס כדי להפיל מבוגרים. פיפטה את הסופרנטנט ולהשליך, להיות בטוח לא להפריע לכדור התולעת.
  6. באמצעות הגדרות הצנטריפוגה בשלב 3.5, יש לשטוף את התולעים פעמיים עם 1 מ"ל של M9TX-01, ולאחר מכן פעם אחת עם 1 מ"ל של מאגר תולעים M9, כדי להפחית את החיידקים החיצוניים.
  7. לטהר חיידקים שאינם דבקים ממעי התולעת.
    1. בצעו החייאה של כל דגימה של תולעים ב-1 מ"ל של S בינוני + 2x OP50 מומת חום בצינור תרבית.
    2. דגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות כדי לאפשר מעבר של חיידקים שאינם דבוקים מהמעיים.
      הערה: זה גם ינקה כל חלבון פלואורסצנטי חוץ-תאי מהלומן ויאפשר הדמיה ברורה יותר של חיידקים מסומנים שנדבקו לאפיתל המעיים, במיוחד כאשר נעשה שימוש בפלואורופורים מהירים בחומצה (למשל, mCherry, dsRed).
  8. פני השטח אקונומיקה תולעים כדי לנקות חיידקים חיצוניים.
    1. יש לשטוף את התולעים המטוהרות פעמיים עם 1 מ"ל של M9TX-01 קר ולהשליך את ה-supernatant.
    2. אפשרו לצינורות להתקרר במשך 10 דקות על קרח (מועדף) או ב-4 מעלות צלזיוס. זה ישתק את התולעים וימנע בליעה של אקונומיקה.
      הערה: פרוטוקולים אחרים משתמשים בחומר שיתוק כימי כגון levamisole; זוהי גישה מבוססת33 הדורשת תוספת של זרם פסולת מסוכן.
    3. הוסף 1 מ"ל של חיץ תולעת M9 קר כקרח + אקונומיקה ללא בישום (8.25% נתרן הידרוקסיד, 1:1000 או 1:2000 v/v) לכל צינור. אפשרו לצינורות לשבת על קרח (מועדף) או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות כדי להרוג חיידקים חיצוניים.
      הערה: אין לחרוג מריכוז אקונומיקה של 1:1000. אפילו אצל תולעים משותקות, התמותה עלולה לגרום לכך.
    4. פיפטה מחוץ למאגר אקונומיקה ולהשליך; מחזירים צינורות לקרח כדי להבטיח שהתולעים לא יחזרו לשאוב עד לפינוי אקונומיקה.
    5. הוסף 1 מ"ל של M9TX-01 קר לכל צינור. ספין במשך כ-5 שניות במיני-סנטריפוג' (2,000 x גרם ב-25 מעלות צלזיוס); להחזיר צינורות לקרח. הסר את ה-supernatant והשליך.
    6. חזור על שלב שטיפה זה עם עוד 1 מ"ל של M9TX-01 קר, תוך השלכת כמה שיותר מהסופרנטנט.
      הערה: אם אתם משתמשים בתולעים לניסויים נוספים, דלגו על שלב ה-permeabilization (פרוטוקול 3.9) ובמקום זאת העבירו את הבוגרים הטריים שהלבינו את פני השטח למאגר קר כקרח בצלחת פטרי באורך 6 ס"מ והפרידו את התולעים לתנאי ניסוי כמו בפרוטוקול 3.10. שמור על התולעים קרות כדי למנוע את חידוש התנועתיות, אך עבוד במהירות - שמירה על תולעים במשך >30 דקות על קרח עלולה לגרום לחידוש <100% של הפעילות הרגילה34.
  9. חדירה כימית של קוטיקולה של תולעת עם נתרן דודציל סולפט ודיתיותריאטול (0.25% SDS + 300 mM DTT) (מבוסס על35)
    אזהרה: DTT הוא סוכן מפחית ומגרה. לבשו PPE ועבדו במכסה אדים כשאתם מטפלים במלאי או בפתרונות יבשים. נדרש זרם פסולת מסוכן.
    1. במכסה האדים, הכינו מספיק תמיסת SDS/DTT כדי לאפשר 100 μL לכל דגימה. עבור 1 מ"ל, עד 965 μL של מאגר תולעת M9 או M9TX-01 בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, הוסף 5 μL של 5% (w/v) SDS ו- 30 μL של 1M DTT.
      הערה: יש להכין תמיסת M DTT 1 (מימית) טרייה או לאחסן אותה באליקוטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס כדי להבטיח עוצמה. יש להגדיל את גודלם של Aliquots כך שישמשו בשניים עד שלושה ניסויים כדי למנוע הפשרה מוגזמת של הקפאה.
    2. העבר צינורות microcentrifuge המכילים תולעים מולבנות על פני השטח אל מתלה צינורות בטמפרטורת החדר. כל צינור צריך להכיל תולעים בכ-20 μL של כ-20 μL של חיץ.
    3. הוסף 100 μL של תמיסת SDS/DTT לכל דגימת תולעת. השליכו כל פתרון SDS/DTT שנותר בזרם הפסולת המסוכנת המתאים.
    4. אפשרו לטיפול להמשיך עד 8 דקות על הספסל כדי לפרק חלקית את הציפורן העמידה של התולעים הבוגרות. תולעים ימותו וישקעו לתחתית הצינור בתקופה זו.
    5. לאחר שזמן ההחללה תם, פשטו בזהירות את הסופרנטנט SDS/DTT והשליכו אותו לזרם פסולת מסוכנת מתאים של SDS/DTT.
    6. הוסף 1 מ"ל של M9TX-01 לכל צינור. סובבו לזמן קצר בצנטריפוגה שולחנית כדי להדוף את התולעים או לאפשר לתולעים להתיישב בכוח הכבידה לתחתית הצינורות, ואז למשוך את הסופרנטנט ולהשליך לזרם פסולת מסוכנת SDS/DTT.
    7. תולעי החייאה ב-1 מ"ל M9 חיץ תולעים + 0.1% טריטון X-100 עד שהן מוכנות לשימוש.
  10. הפרד תולעים לתוך צלחת עמוקה של 96 בארות עם חצץ סיליקון קרביד לשיבוש מכני. הכינו את לוחית ההפרעה בת 96 הבאר כמו מתחת.
    1. השג צלחת 96 באר עמוקה סטרילית של 2 מ"ל וכיסוי צלחת סיליקון 96-באר תואם.
      הערה: חשוב להשתמש בצלחות התואמות את המתאמים של 96 בארות עבור משבש הרקמות. הבדלים זעירים בממדים החיצוניים עושים את ההבדל בין צלחת שניתן להסיר מהמתאמים לבין כזו שלא יכולה.
    2. באמצעות מרית סקופ סטרילית, מוסיפים כמות קטנה של סיליקון קרביד סטרילי 36-גרניט לכל באר של הצלחת שתקבל תולעת. השתמשו במספיק חצץ כדי לכסות בקושי את החלק התחתון של הבאר (כ-0.2 גרם לבאר). חומר מוגזם יקשה על קבלת קצה פיפטה לתחתית הבאר בעת אחזור התוכן.
    3. הוסף 180 μL של מאגר תולעת M9 לכל באר.
    4. סמן את העמודות או השורות כדי לציין לאן כל דגימה תלך, ולאחר מכן כיסה את הצלחת באופן רופף עם כיסוי לוחית הסיליקון 96-באר.
  11. מעבירים תולעים בודדות לצלחת של 96 בארות לשיבוש.
    1. העבירו את התולעים החודרות בזהירות לצלחת פטרי קטנה (35 או 60 מ"מ) המכילה מספיק M9TX-01 כדי למלא את המנה לעומק של כ-1 ס"מ.
      הערה: אם יש מספר רב של תולעים, ייתכן שלא ניתן יהיה להעביר את הדגימה כולה מכיוון שהנוזל יהפוך צפוף ויהיה קשה לטפטף תולעים בודדות.
    2. באמצעות מיקרוסקופ ניתוח או מכשיר אחר בעל הגדלה נמוכה, פיפטה את התולעים הבודדות בנפחים של 20 μL, והעבירה את התולעים הללו לבארות בודדות של צלחת 96 הבארות.
      הערה: עדיף לקצור רק תולעים שזה עתה נהרגו. הימנעו מתולעים בעלות צורה ליניארית נוקשה, שכן ייתכן שהתולעים הללו מתות במשך זמן מה. נסו לקחת תולעים שהן מעוקלות או בצורת S, עם פיזיולוגיה גסה רגילה ומעיים שלמים.
    3. לאחר העברת כל כרך, ודא שהתולעת שנבחרה אכן נפלטה לתוך הבאר. כדי לעשות זאת, פיפט מעלה 20 μL של M9TX-01 מאזור ברור של צלחת פטרי ומשחרר את מלוא הנפח בחזרה לתוך המנה; זה בדרך כלל יפלוט את התולעת אם היא דבוקה לפיפטה. אם התולעת הייתה תקועה, הסר 20 μL מהבאר ונסה שוב את ההעברה.
    4. לאחר שכל התולעים הועברו, כסו את הצלחת בת 96 הבארות בגיליון של סרט איטום גמיש מגובה נייר זמין מסחרית (2 x 2 ריבועים), וודאו שהצד המגובה בנייר של סרט האיטום פונה כלפי מטה אל בארות הדגימה. היזהרו לא למתוח את סרט האיטום דק מדי, אחרת יהיה קשה מאוד להסיר אותו מאוחר יותר.
    5. מניחים את משטח איטום הסיליקון בקלילות על גבי סרט האיטום הגמיש; אל תלחץ את הכיסוי לתוך הבארות בשלב זה.
    6. הזז את הצלחת ל 4 מעלות צלזיוס כדי לצנן במשך 30-60 דקות. זה ימנע חימום יתר במהלך הפרעה, מה שעלול לפגוע בדגימות.
      הערה: זוהי נקודת שבירה בפרוטוקול. ברוב המקרים, ניתן להשאיר את הצלחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שעות לפני הטחינה. אל תשאירו את התולעים בן לילה, שכן זה ישנה את ספירת החיידקים.
  12. העמיסו צלחות של 96 בארות על משבש רקמות כדי לפרק רקמות תולעים ולשחרר חיידקי מעיים.
    הערה: (אופציונלי) אם משתמשים במספר אי-זוגי של לוחות 96-well לעיכולים, יש צורך להכין משקל נגד לפני שתמשיך. השתמשו בצלחת ריקה של 96 בארות ומלאו בארות במים עד שהיא שוקלת כמו הצלחת הראשונה.
    1. לחצו את משטח איטום הסיליקון בחוזקה לתוך הבארות כדי ליצור אטימה, וודאו שהמכסה שטוח על פני כל פני השטח של הצלחת.
      הערה: אם סרט האיטום הגמיש עבה מדי לאחר המתיחה, יהיה קשה לאבטח את מכסה הסיליקון כך שהוא שוכב שטוח בכל הבארות. התוצאה תהיה איטום לא מספיק וזיהום עד טוב במהלך הרעידות.
    2. אבטחו צלחות במשבש הרקמות באמצעות מתאמי לוחות 96 הבאר. יש לנער צלחות למשך דקה אחת ב-30 הרץ, ואז לסובב צלחות ב-180° ולנער שוב למשך דקה אחת. זה יעזור להבטיח אפילו הפרעה בכל בארות של הצלחת.
    3. הקש על לוחות בחוזקה על הספסל פעמיים או שלוש כדי לעקור כל חצץ מסרט האיטום הגמיש.
    4. באמצעות צנטריפוגה גדולה עם שני מתאמי לוחות של 96 בארות, סובבו את הלוחות כלפי מטה ב-2400 x g למשך 2 דקות כדי לאסוף את כל החומר לתחתית הבארות.
    5. הסר את מכסה הסיליקון ומשך בזהירות את סרט האיטום הגמיש.
      הערה: אם סרט האיטום הגמיש נדבק לאחת הבארות, השתמש בקצה פיפטה של 200 μL כדי להסיר אותו. זה נפוץ כאשר סרט האיטום הגמיש נמתח דק מדי.
  13. דילול סדרתי של דגימות עיכול תולעים ב-300 μL בלוחות של 96 בארות.
    1. באמצעות פיפטטור מרובה בארות המוגדר ל-200 μL, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים לאט ובזהירות כדי לערבב מחדש את תכולת הבארות, ולאחר מכן למשוך כמה שיותר מהנוזל. העבירו את הנוזל הזה לשורות העליונות של לוחות 96 הבאר שהוכנו בשלב 3.3.
    2. באמצעות פיפטטור של 96 בארות המוגדר ל-20 μL, הסר נפח זה של נוזל מהשורה העליונה וחלוק לשורה B. פיפטה למעלה ולמטה 8-10x כדי לערבב. השליכו טיפים.
    3. חזור על שלב 3.13.2, החל מדגימות 0.1x בשורה B כדי ליצור דגימות דילול של 0.01x בשורה C.
    4. חזור שוב על שלב 3.13.2, ועבר משורה C לשורה D.
    5. צלחת על אגר מוצק לכימות חיידקי. עבור תולעים חד-מושביות, זה בדרך כלל מספיק כדי לצלוח טיפות 10-20 μL של כל דילול [1x-0.001x] על צלחות אגר. עבור קולוניזציה מרובת מינים, צלחת כל דילול בנפרד על ידי צנרת 100 μL על צלחת אגר 10 ס"מ; להתפשט מיד באמצעות חרוזי ציפוי זכוכית.

4. ניקוי חצץ סיליקון קרביד לשימוש חוזר

הערה: הליך זה משמש לניקוי ועיקור חומר הטחינה, חצץ סיליקון קרביד, לשימוש חוזר לאחר ניסויים. יש לעקוב אחר פרוטוקול זה בשלמותו לפני השימוש הראשון, שכן חצץ סיליקון קרביד הוא מוצר תעשייתי ואינו מגיע מעוקר מראש. חצץ Si-carbide (3.2 גרם/סמ"ק) הוא חומר צפוף בעל קצוות מחוספסים הפועל ביעילות כדי לשבש דגימות קשות. עם זאת, החלקיקים יכולים להתבלות על פני שימוש חוזר ויש להחליפם כאשר מתגלה בלאי. למרבה המזל, החומר זול, והגדלים שנמכרים בדרך כלל (כ-1 ליברות) מספיקים לניסויים רבים.

  1. לאחר הסרת דגימות לציפוי, הוסיפו תמיסת אקונומיקה של 10% לכל הבארות של צלחת 96 הקידוחים ותנו לשבת לפחות 10 דקות.
  2. הסר את עיקר החצץ על-ידי היפוך מהיר של לוחית 96 הבארות מעל מגש קטן בעל צד גבוה או מיכל קצה פיפטה ריק P1000 גדול מספיק כדי לתפוס את כל התכולה. החצץ ישקע מיד לתחתית המגש. שפכו את תמיסת האקונומיקה לכיור.
  3. מלאו מחדש את צלחת 96 הבאר במי ברז והפכו לאותו מגש כדי לשטוף את החצץ שנותר. שפכו את המים לכיור.
  4. חוזרים על הפעולה עוד פעם עד שלוש פעמים עם מי ברז עד שהצלחת נקייה לחלוטין מחצץ.
  5. יש לשטוף את החצץ פי 2 במי ברז ולמלא את המגש בכל פעם.
    הערה: ניתן לשטוף את צלחת הבאר העמוקה בת 96 הבאר במדיח כלים במעבדה, לכסות אותה היטב בנייר כסף, ולעטוף אותה בפלסטיק רב-פעמי אחר. אין צורך לשטוף את הנחרצות באופן מיידי וניתן להניח אותה בצד בשלב זה. חצץ משומש נצבר בדרך כלל מניסויים מרובים לפני שטיפה ואוטוקלבינג.
  6. לשטוף חצץ בתמיסה של חומר ניקוי מעבדה במשך 30 דקות, תוך תסיסה מדי פעם על ידי מערבולת או ערבוב עם מרית מתכת.
  7. יש לשטוף את כל עקבות חומרי הניקוי במספר שינויים (8-10) במי ברז, ולאחר מכן לשטוף פי 2 במים מזוקקים.
  8. מורחים חצץ במגש פתוח, כגון מגש אוטוקלאב פוליפרופילן רדוד, ומייבשים בטמפרטורה של 40-70 מעלות צלזיוס במשך מספר שעות.
    הערה: אם החצץ גושני כאשר הוא יבש, הוא לא נוקה או נשטף מספיק. חזרו על פרוטוקול הניקוי החל משלב 4.6, והוסיפו שטיפות נוספות בשלב 4.7.
  9. מחלקים חצץ נקי ויבש לבקבוקי זכוכית אוטומטיים בעלי ברגים בעומק מרבי של 5-6 ס"מ. יש לבצע אוטוקלאציה במחזור הקדם-ואקום למשך 30 דקות לצורך עיקור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיקור אקונומיקה של תולעים חיות
תולעים מולבנות על פני השטח נקיות למעשה מחיידקים חיצוניים עד שהתנועתיות חוזרת וההפרשה מתחדשת. בתנאים המשמשים כאן, נצפית הכחדה מהירה של חיידקים במאגר (איור 1A-C, איור משלים 2, וידאו 1) מבלי להפריע לחיידקים הקשורים למעיים בתולעים משותקות קרות (איור 1D-F, וידאו 2). נתונים אלה מצביעים על כך שניתן להשתמש בהלבנת פני השטח ביעילות כדי לטהר את התולעים באו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן מוצגים נתונים על היתרונות של כימות תולעת בודדת של עומס חיידקים ב- C. elegans, יחד עם פרוטוקול שיבוש של 96 בארות כדי לאפשר רכישה מהירה ועקבית של מערכי נתונים גדולים מסוג זה. בהשוואה לשיטות הקיימות33, פרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה בתפוקה גבוהה יותר של קהילות מיקרוביאליות במעיים בתולעת.

לגישה זו יש ציפוי כצעד מגביל קצב ואינה באמת "תפוקה גבוהה". ציטומטריה של זרימה של עצמים גדולים (איור 3C,D) היא שיטה שימושית בעלת תפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות ל-H. Schulenberg ול-C. LaRock על השיתוף הנדיב שלהם בזני חיידקים ששימשו בניסויים אלה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מאוניברסיטת אמורי ו- NSF (PHY2014173).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
לוחות פוליפרופילן עם תחתית שטוחה 96 בארות, 300 uLEvergreen Labware290-8350-03F
שטיח איטום צלחות 96 בארות, סיליקון, בארות מרובעות (AxyMat)AxygenAM-2ML-SQ
צלחות 96 בארות, 2 מ"ל, בארות מרובעותAxygenP-2ML-SQ-C-S
96 בארות מכסי צלחות פוליפרופילןEvergreen Labware290-8020-03L
אגר
לצלחות 96 בארותQIAGEN119900לוחות מתאם לשימוש עם שתי צלחות 96 בארות על
הומוגנייזר רקמות טחנת חרוזים TissueLyser II (TissueLyser II)QIAGEN85300הומוגנייזר מכני לשיבוש דגימה בתפוקה בינונית עד גבוהה
BioSorterUnion Biometricaלפי ציטוטסדרן חפצים גדול מצויד במיקוד של 250 מיקרון עבור C. elegans
אקונומיקה, מסחרי, 8.25% נתרן היפוכלוריטClorox
Breathe-Easy 96-באר ממברנת איטום חדירה לגזמגוונתביוטק BEM-1ממברנות פוליאוריטן חדירות לגז. סרט איטום דק חדיר ל-O2, CO2 ואדי מים והוא שקוף UV עד 300 ננומטר. סטרילי, 100/קופסה.
סידן כלוריד דיהידרטפישר סיינטיפיקAC423525000
כולסטרולVWRAAA11470-30
חומצת לימון מונוהידראטפישר סיינטיפיקAC124910010
נחושת (II) סולפט פנטהידראטפישר סיינטיפיקAC197722500
קורנינג 6765 LSE מיני מיקרוצנטריפוגהקורנינג  COR-6765
דיסודיום EDTAFisher Scientific409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, לביולוגיה מול, DNAse, RNAse ופרוטאז ללא ACROS OrganicsFisher Scientific327190010
Eppendorf 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה,Eppendorf
Eppendorf 5424R מיקרוצנטריפוגהEppendorf540600064024 מקומות בקירור מיקרוצנטריפוגה
ספסל Eppendorf 5810R עם רוטור S-4-104Eppendorf22627040צנטריפוגה שולחנית 3L עם מתאמים לצינורות וצלחות 15-50 מ"ל
דלי צלחת אפנדורף (x2), לרוטור S-4-104Eppendorf22638930
אתנול 100%Fisher ScientificBP2818500
חרוזי זכוכית, 2.7 מ"ממוצרי מדעי החייםLS-79127
חרוזי זכוכית, שטופים בחומצה, 425-600 ומיקרו; mSigmaG877-500G
חרוזי ציפוי זכוכיתVWR76005-124
חומצה הידרוכלוריתVWRBDH7204-1
ברזל (II) סולפט הפטאהידראטפישר סיינטיפיק423731000
קימבל קונטס מנוע עלי גלולהDWK מדעי החיים749540-0000
קימבל קונטס עלי גלולה פוליפרופילן ו מיקרו-צינורות, 0.5 מ"לDWK מדעי החיים749520-0590
Leica DMi8 מיקרוסקופ הפוך ממונע עם שלב ממונעLeica11889113
Leica LAS X תוכנת פרימיוםLeica11640687
מגנזיום סולפט הפטהידראטפישר AC124900010
מנגן (II) כלוריד טטרהידרטVWR470301-706
PARAFILM M סרט איטום מעבדה גמישAmcorPM996
PeptoneFisher ScientificBP1420-500
צלחות פטרי, עגולות, 10 ס"מVWR25384-094
צלחות פטרי, עגולות, 6 ס"מVWR25384-092
צלחות פטרי, מרובעות, 10 x 10 ס"מVWR10799-140
מאגר פוספו מי מלח (1X PBS)Gold BioP-271-200
מגש חיטוי פוליפרופילן, רדודFisher Scientific13-361-10
אשלגן הידרוקסידFisher ScientificAC134062500
אשלגן פוספט dibasicFisher ScientificBP363-1
אשלגן פוספט מונו-בסיסיFisher ScientificBP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443R Foundationn/a
מרית מעבדה מסוג סקופ, מתכתVWR470149-438
כוסות סיליקון קרביד 36 חצץMJR/aחצץ סיליקון קרביד גס במיוחד שחור. זמין בגדלים של 0.5-5 פאונד מספק זה.
נתרן דודציל סולפטפישר סיינטיפיקBP166-100
נתרן הידרוקסידVWRBDH7247-1
נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מיםפישר סיינטיפיקBP332-500
סודום כלורידפישר סיינטיפיקBP358-1
סוכרוזפישר סיינטיפיקAC419760010
טרי-אשלגן ציטראט מונוהידראטFisher ScientificAC611755000
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
אבץ גופרתי heptahydrateפישר סיינטיפיקAC205982500
סט מתאם טחנת חרוזים של Fisher Scientific 443570050 טבעי n

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093(2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652(2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53(2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090(2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604(2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113(2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38(2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327(2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068(2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701(2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263(2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505(2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921(2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633(2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338(2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037(2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Caenorhabditis ElegansBacterial ColonizationHost Microbe InteractionsSingle Worm Quantification96 Well PlateMechanical DisruptionColony PlatingSurface BleachingSerial DilutionIntestinal Bacterial Load

מאמרים קשורים