פרוטוקול הצלת עוברים להכלאה בין-מינית בסקווש

קוקורביטה (שם מדעי: Cucurbita; 2n = 40) הוא סוג מגוון מאוד במשפחת ה-Cucurbitaceae, הכולל 27 מינים שונים, מתוכם חמישה מבויתים¹. מבין אלה, Cucurbita moschata, C. pepo, ו- C. maxima הם החשובים ביותר מבחינה כלכלית בעולם. בארה"ב, C. moschata ו- C. pepo הם שני המינים החשובים ביותר בייצור החקלאי. C. pepo מורכב מארבעה תת-מינים (ovifera, pepo, fraternal ו-gumala) המכילים קבוצות דלעת בקיץ ובחורף של נוכלים, סטרייטנק, בלוט, צדפות, קוקוזל, מח ירקות, קישואים ודלעת 2,3,4,5. C. moschata מורכב בעיקר מסוגי שוק דלעת חורף כולל דלורית, דיקינסון וקבוצת גבינה¹. שני המינים מגוונים מבחינה מורפולוגית ופנוטיפית, כאשר C. pepo נחשב לתנובה שלו, לאוזניים, להרגל גידול השיחים ולתכונות פרי מגוונות הכוללות צורת פרי, גודל פרי, צבע בשר ותבנית קליפה. מאידך גיסא, C. moschata מוערך על הסתגלותו לחום ולחות, כמו גם עמידות למחלות ומזיקים ^6,7. הכלאה בין-מינית בין C. moschata ו- C. pepo היא לא רק אסטרטגיה חשובה לאינטרוגרסיה של תכונות רצויות בין שני המינים, אלא גם מאפשרת את הרחבת הבסיס הגנטי בתוכניות רבייה ^7,8.

הצלבות מוקדמות בין C. moschata ו- C. pepo נעשו כדי לקבוע את ההתאמה שלהם ו / או מחסומים טקסונומיים 9,10,11, בעוד שמחקרים מאוחרים יותר התמקדו בעיקר בהעברת תכונות רצויות^12,13,14. הכלאה בין-מינית בין שני המינים התמקדה בהעברת תכונות חדשות כגון הרגל גידול של שיח או שיח למחצה ושיפור התשואה מ- C. pepo יחד עם עמידות למחלות, הסתגלות ללחץ אביוטי ומרץ מוגבר מ- C. moschata^14,15,16. לדוגמה, הצלבות ספציפיות בין C. pepo (P₅) ו- C. moschata (MO₃) הביאו לתפוקת פירות גבוהה יותר 13, בעוד ש- C. moschata accessions (מקומי ניגרי ומנין) היו בשימוש נרחב כמקור העיקרי לעמידות בפני נגיפי פוטיוירוס בתרבויות C. pepo ^{מעובדות 17,18}.

מחקרים קודמים הראו כי הכלאה בין C. moschata ו- C. pepo אפשרית אך קשה ^8,15. הצלבים הבין-ספציפיים עלולים לגרום לכך שלא יהיו פירות (הפלה), פירות פרתנוקרפיים נטולי זרעים בני קיימא (זרעים ריקים), פירות ללא זרעים שבהם העוברים הלא בוגרים לא מצליחים להתפתח (stenospermocarpy), או פירות עם מעט עוברים לא בשלים שניתן להציל לצמחים בוגרים באמצעות הצלת עוברים^15,16. לדוגמה, לא הושגו זרעים בני קיימא על ידי חציית C. pepo (מלכת השולחן, האם) עם C. moschata (גבינה גדולה, אבהית), עם זאת, הצלב ההדדי הניב 57 זרעים בני קיימא מתוך 134 האבקה⁹. הייאז השיגה זרעים בני קיימא מצלבי C. moschata ו- C. pepo רק כאשר צלבים נעשו בשעה 04:00 בבוקר באמצעות אבקה שאוחסנה בטמפרטורה של 10 מעלות צלזיוס במשך הלילה¹⁹. באגט חצה שמונה זנים שונים של C. moschata עם C. pepo (דליקטה) ודיווח כי מתוך 103 האבקה כוללת, התקבלו 83 פירות שנראו תקינים, אך אף אחד מהם לא הכיל זרעים בני קיימא⁸. בהצלבה בין C. pepo (S179) ו- C. moschata (NK), Zhang et al. השיגו 15 פירות עם 2,994 זרעים, אך רק 12 מהם היו בני קיימא בעוד שהשאר הציגו התפתחות בסיסית בלבד. מחקרים אלה מצביעים על כך שלמרות שמעבר בין-ספציפי בין C. moschata ל- C. pepo מועיל מאוד, השגת פירות עם זרעים בני קיימא מהצלבים דורשת¹⁶.

הצלת עוברים הוצעה כשיטה מתאימה להתגבר על בעיות הנובעות מהפלה מוקדמת או מעוברים שפותחו בצורה גרועה והיא אחת הטכניקות המוקדמות והמוצלחות ביותר בתרבית במבחנה להתחדשות של עוברים לא בשלים^16,20. הצלת עוברים כוללת תרבית מבחנה של עוברים לא מפותחים/לא בשלים ולאחר מכן העברה למדיום מזין סטרילי כדי להקל על התאוששות השתילים ובסופו של דבר צמחים בוגרים²¹. למרות שהצלת עוברים משמשת בדרך כלל בגידול סקווש, חסר תיאור מפורט של המתודולוגיה המתאימה שתאפשר את יישומה השגרתי. שימוש בטכניקת הצלת עוברים כדי להתגבר על מחסומי הכלאה בין-ספציפיים במיני Cucurbita דווח כבר בשנת 1954²². עם זאת, ההצלחה של הצלת עוברים במחקרים המוקדמים לא דווחה או נמוכה מאוד. Metwally et al. דיווחו על שיעור הצלחה של 10% (התחדשות לצמחים בוגרים) בקרב 100 עוברים היברידיים בין-ספציפיים שניצלו מהכלאה בין C. pepo ו- C. martinezii²³. Sisko et al. דיווחו על שיעור הצלחה משתנה של התחדשות עוברים בקרב עוברים שהתקבלו משילובים צולבים שונים: שיעור ההתחדשות של בני כלאיים שהושגו על ידי חציית C. maxima (Bos. Max) ו- C. pepo (הבהלה לזהב) היה 15.5%, עבור C. pepo (קישואים) ו- C. moschata (הוקאידו) היה 20%, ואילו עבור C. pepo (הבהלה לזהב) ו- C. moschata (דולגה) הוא היה 37.5%²⁴. בנוסף לגנוטיפ, המדיה ותנאי התרבית במבחנה הם גורמים חשובים להצלחת הטכניקה^25,26. במחקר הנוכחי נבדקו שילובי צלב שונים בין C. moschata ו- C. pepo, ופותחה מתודולוגיה פשוטה לשימוש בטכניקת הצלת העוברים בסקווש. פיתוח טכניקת הצלת עוברים פשוטה וקלה לשחזור תאפשר הכלאה בין-מינית ושיפור הנבטים בתוכניות גידול סקווש.

1. שתילה והאבקה

הערה: חשוב לזהות גנוטיפים תואמים שההכלאה שלהם תביא לסט פירות ולייצור עוברים בני קיימא.

1. תנאי שתילה ותחזוקה
   1. השג זרעים של גנוטיפים של דלעת (cultivars/accessions) להכלאה (טבלה 1).
   2. מלאו 50 תאים התחלתיים (25 ס"מ רוחב x 50 ס"מ אורך) עם חומר עציץ מתוקן עם דשן NPK שלם המכיל 1.38 גרם/ק"ג N, 1.38 גרם/ק"ג P ו-1.38 גרם/ק"ג K.
   3. זורעים זרעים לעומק השווה לאורכם ומכסים במדיום עציצים. להשקות את הדירות מבלי ליצור מים עומדים. לאחר מכן, שמרו על המדיה לחה על ידי השקיה ידנית פעם ביום.
   4. בשלב השני של עלי אמת, השתלו את השתילים לתוך עציצים בקוטר 25 ס"מ עד 30 ס"מ מתוקנים עם דשן NPK שלם ב 3 כפות / סיר. דשן את הצמחים פעם בשבוע עם 500 מ"ל/סיר של דשן נוזלי המכיל NPK 20:20:20 הוסיף לריכוז של 1 גרם לכל גלון מים.
   5. לשמור על צמחים בחממה בטמפרטורות שבין 22-28 מעלות צלזיוס תחת משטר אור טבעי. עבור גנוטיפים מתפתלים, ספקו סורג תומך בחממה (איור 1).
2. ביצוע האבקות
   1. בדרך כלל, פריחה בדלעת מתחילה בגיל 6 עד 8 שבועות מהזריעה, תלוי בזן (איור 2A,B). התחילו לבצע הכלאה מבוקרת (צלבים) ברגע שהצמחים מתחילים לפרוח. בתנאי חממה, האבקה יכולה להיעשות כל השנה.
   2. זהה פרחים זכריים ונקביים של זני C. pepo ו- C. moschata שיהיו מוכנים להאבקה למחרת. כדי לזהות פרחים כאלה, בדוק אם יש פרחים שעלי הכותרת שלהם הם בעלי גוון צהוב אך אינם פתוחים. הדביקו בעדינות את הפרחים הסגורים בחלקם העליון באמצעות סרט מיסוך כדי למנוע האבקה מקרית של חרקים (איור 2C,D).
   3. בבוקר יום המחרת, הפרחים מוכנים להאבקה. בצע האבקה לפני 10:00 בבוקר כדי לשפר את שיעור ההצלחה של הכלאה²⁷.
   4. פתח את פרחי הנקבה והזכר על ידי הסרה עדינה של החלק העליון המודבק של עלי הכותרת. הסירו את עלי הכותרת מהפרח הזכרי והעבירו את האבקה על-ידי שפשוף עדין של הפורקן על הסטיגמה של הפרח הנקבי (איור 3A).
   5. לאחר ההאבקה, מיד לסגור את הפרח הנקבי המואבק עם סרט מיסוך. השתמשו בתג כדי לתעד את תאריך ההאבקה ולציין את ההורים האבהיים והאימהיים שבהם נעשה שימוש בצלב (איור 3B).
   6. צלב מוצלח מסומן על ידי שחלה מורחבת אשר יוצרת במהירות פרי קטן תוך שבוע אחד (איור 4A). לאחר מכן הצמח מוכן לקטיף 45-55 ימים לאחר האבקה²⁸ (איור 4B).

2. טכניקת הצלת עוברים

1. היערכות למדיה
   1. הכינו מלאי אנטיביוטיקה: עבור cefotaxime (מלח נתרן), להמיס את האנטיביוטיקה ב 4 מ"ל של מים deionized או מזוקקים, לסנן דרך מסנן מזרק סטרילי 0.22 μm, ולעשות 0.5 מ"ל aliquots. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. תמיסת המלאי המתקבלת תהיה בריכוז של 250 מ"ג/מ"ל.
   2. עבור אמפיצילין (מלח נתרן), יש להמיס את האבקה ב-10 מ"ל מים, לסנן דרך מסנן מזרק סטרילי של 0.22 מיקרומטר, ולאליקוט במלאי של 1 מ"ל בריכוז סופי של 100 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
   3. הפוך את Murashige ו- Skoog (MS) לבינוניים על ידי המסת 2.45 גרם של בינוני (ריכוז 4.91 גרם לליטר) ב-500 מ"ל של מים מזוקקים בבקבוק של 1 ליטר. הוסיפו 1.5 גרם של מסטיק גלן ואוטוקלאב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מסטיק הגלן מתמוסס לחלוטין במהלך האוטוקלבינג.
   4. לאחר autoclaving, לקרר את המדיום על ידי הנחת הבקבוק באמבט מים ב 50 מעלות צלזיוס. מוציאים את מלאי האנטיביוטיקה מהמקפיא ומפשירים אותם בארון הזרימה הלמינרית.
   5. מעבירים את הבקבוק הבינוני למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. הוסיפו 0.6 מ"ל של תמיסת מלאי cefotaxime (250 מ"ג/מ"ל) ו-0.25 מ"ל של מלאי אמפיצילין (100 מ"ג/מ"ל) לבקבוק הבינוני וערבבו היטב. יוצקים כ-7 מ"ל מהמדיום לתוך צלחת פטרי סטרילית (60 מ"מ x 15 מ"מ).
   6. תנו למדיום להתמצק בצלחות הפטרי למשך כ-15-20 דקות. סוגרים את צלחות הפטרי בעטיפת איטום ומניחים אותן בקופסת אחסון. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
2. הצלת עוברים
   1. לפני שתתחיל, נקו ועקרו את ארון זרימת האוויר הלמינרי עם 70% אלכוהול אתילי.
   2. קצרו את פרי הדלעת על-ידי שבירה/חיתוך שלו מהגפן הראשית וחטאו את משטח הפרי על-ידי שטיפה עם חומר ניקוי נוזלי (לדוגמה, 0.3% כלורוקסילנול) בכיור המעבדה עד להסרת כל הלכלוך הרופף (איור 5A).
   3. יש לשטוף במי ברז בשפע. יבשו את הפרי במגבות נייר נקיות. העבירו את הפרי לארון זרימת האוויר הלמינרי (איור 5B).
   4. פני השטח מעקרים את הפרי על ידי התזת 70% אתנול על הפרי בארון הסטרילי של זרימת האוויר הלמינרית. חצו את הפרי בסכין סטרילית (איור 5C) והוציאו את הזרעים.
   5. השתמשו במלקחיים סטריליים כדי לפתוח באופן אספטי את שכבת הזרעים ולחשוף את העוברים הלא בשלים (איור 6). הניחו בזהירות את העוברים הלא בשלים בצלחת פטרי המכילה MS בינוני בתוספת cefotaxime ואמפיצילין (איור 7A). סוגרים את צלחת הפטרי ואוטמים בסרט עטיפה.
      הערה: בהתאם לגודל העובר, ניתן להכניס חמישה או שישה עוברים לצלחת פטרי.
   6. מניחים את צלחות הפטרי האטומות עם העוברים בתא גידול מתחת ל-16 שעות פוטופריוד בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ו-70% לחות יחסית. אם מתרחש זיהום, מיד תת-תרבות העוברים הלא מזוהמים לצלחת חדשה עם אותו מדיום.
   7. הקוטילדונים יתחילו להתרחב לאחר 4 ימים ויהפכו לירוקים תוך 10 ימים (איור 7B). בשלב זה, במידת הצורך, לבצע subculturing לתוך לוחות חדשים המכילים את אותו מדיום כדי לאפשר הרחבת רקמות. השורשים יתחילו להופיע ב-14 יום (איור 7C), וב-21 יום יהיו לצמחים שורשים מורחבים ולקוטילדונים (איור 7D).
      הערה: מדיום התרבית המשמש בפרוטוקול מתאים להבחנה ליורה ושורשים ללא ויסות גדילה משלימים.
   8. בשלב זה, הסירו את השתילים מכלי הפטרי ושטפו בעדינות את המדיה מהשורשים במי ברז (איור 8). הניחו את הצמחים במיכל פלסטיק (14 ס"מ על 9 ס"מ על 4 ס"מ) וכסו את השורשים במגבות נייר רטובות (איור 9A). מכסים את המיכל ומרחים מחדש את מגבות הנייר לפי הצורך.
   9. שומרים את המכלים בטמפרטורת החדר (25-28 מעלות צלזיוס) ועם פוטופריוד של 16 שעות. שלב זה יאקלם את הצמחים. לאחר התאקלמות במשך 7-10 ימים במיכל, השתילים יהיו באורך של כ -3-4 אינץ '. במהלך תקופה זו, יש להרטיב מחדש את מגבות הנייר לפי הצורך.
   10. מעבירים את השתילים ל-50 תאי התחלה (25 ס"מ רוחב X 50 ס"מ אורך) מתוקנים עם דשן כפי שתואר קודם לכן ומעבירים אותם לחממה (איור 9B). אין שתילים מעל המים כדי למנוע ריקבון; יש להוסיף כ-10-20 מ"ל לתא לפי הצורך.
   11. בשלב השני עד השלישי של עלי אמת, השתיל את השתילים בעציצים בקוטר 30 ס"מ מלאים בחומר עציצים מתוקן בדשן כפי שתואר קודם לכן (איור 10A). ספקו תמיכה לצמחי גפנים ובצעו הכלאה מבוקרת כאשר הצמחים מתחילים לפרוח, כפי שתואר קודם לכן (איור 10B).
   12. תחזקו את הצמחים בחממה בטמפרטורות שבין 22-28 מעלות צלזיוס תחת משטר אור טבעי. להעריך את הצמחים עבור תכונות פירות וזרעים.

כדאיות סט פירות וזרעים
נערכה בדיקה ראשונית לקביעת כדאיות סט הפירות והזרעים במגוון שילובים צולבים. בסך הכל נבחרו 15 גנוטיפים של דלעת, ארבעה C. pepo ו-11 C. moschata, (טבלה 1). מתוך 24 צירופי הצלב הבין-ספציפיים שנוסו, הושגה ערכת פירות עבור 22 (טבלה 2), המייצגת הצלחה כוללת של >92% בערכת הפירות. לא הושגו פירות בוגרים על ידי חציית O ו-M ו-E ו-J, בעוד שהמספר הגבוה ביותר של פירות (n = 6) הושגו על ידי חציית F ו-J (טבלה 2). מספר הפרחים שהואבקה עבור שילובי צלב שונים נע בין אחד ל-11, ושיעור ההצלחה של האבקה נע בין 0% ל-100%. מספר הפרחים המואבקים בצירופי צלב שונים משתנה בהתאם למספר ערכות הפרחים ולסנכרון הפריחה בין פרחי הזכר והנקבה. אף על פי שפירות התקבלו מכל הצלבים למעט שניים, הערכת הפירות לאחר חיתוך העלתה כי רוב הפירות הפילו עוברים ללא זרעים בני קיימא. פירות מרוב הצלבים נראו תקינים אך היו נטולי זרעים או מורכבים מזרעים עם עוברים בסיסיים. בסך הכל הופקו 44 פירות מכל צירופי הצלב, ורק פרי אחד, שפותח על ידי חציית C ו-J, היה בעל עוברים מפותחים היטב שניתן היה לשחזר באמצעות טכניקת הצלת העוברים.

הצלת עוברים והתקדמות נוספת
להכלאה הבין-מינית F1 שפותחה על ידי חציית C ו-J היו 44 זרעים בסך הכל, אך רק ל-10 מהם היו עוברים שניתן היה להציל לקידום הדור. לשאר הזרעים לא היו עוברים. כל 10 העוברים עברו תרבית במדיה להצלת עוברים ונבדקו מדי יום לצמיחתם והתפתחותם. גודלם של 10 העוברים הלא בשלים נע בין 3.51 מ"מ ל-8.26 מ"מ. אחוזי ההצלחה של הצלת עוברים היו 80%. ההיברידיות הבין-ספציפיות F 1 (קווי גשר) שפותחו על ידי חציית C. moschata ו- C. pepo (C ו- J) הכילו את הגנומים של שני המינים ביחס של 1:1 (50% כל אחד). צמחים אלה שימשו כקווי גשר להפנמה של תכונות חשובות מבחינה כלכלית בין שני המינים. לדוגמה, חציית קווי גשר אלה עם C. moschata תגרום לבני כלאיים עם 75% C. moschata ו-25% C. pepo רקע גנטי, בהתאמה. הפירות שהתקבלו מקווי גשר אלה היו תערובת של זרעים וזרעים בלתי ניתנים להשגה עם עוברים לא בשלים שדרשו לאחר מכן תרבית רקמה להתחדשות. לדוגמה, לאחד הפירות היו בסך הכל 54 זרעים, מתוכם 14 זרעים היו עוברים לא בשלים שניצלו באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן.

איור 1: תמיכה בצמחי דלעת שגדלים אנכית בחממה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: איור של פרחים פתוחים ומודבקים. פרח דלעת פתוח (A) זכר ו-(B) נקבה בדלעת בחממה. (C) פרח זכרי מודבק מההורה האבהי Cucurbita moschata. (D) פרח נקבי מודבק מההורה האימהי Cucurbita pepo. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: איור של האבקה. (A) העבירו את האבקה מהפרח הזכרי על ידי שפשוף עדין של האפרכסת על הסטיגמה של הפרח הנקבי. (ב) לאחר ההאבקה, הדביקו את הפרח הנקבי והשתמשו בתג כדי לתעד את תאריך ההאבקה ואת ההורים האבהיים והאימהיים המשמשים בצלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: ערכת פירות . (A) לאחר האבקה, השחלה תתרחב במהירות, ותיצור פרי קטן תוך שבוע. (B) הפרי מוכן לקטיף 45 יום לאחר ההאבקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: הכנת פירות . (A) שטפו את הפרי בחומר ניקוי. קטיף וחיטוי פני השטח של הפרי על ידי שטיפתו עם חומר ניקוי נוזלי בכיור המעבדה. (B) יש לשטוף ולייבש את הפרי. יבשו את הפרי במגבות נייר נקיות, לאחר שטיפה במי ברז בשפע, והעבירו אותו לארון למינרי-זרימת אוויר. (C) פתחו את הפרי בסכין סטרילית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 6: חלץ עובר מהזרעים. השתמש מלקחיים סטריליים כדי לפתוח באופן אספטי את שכבת הזרע ולחשוף את העובר הלא בוגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 7: התחדשות עוברים במדיית הטרשת הנפוצה . (A) יש להניח בזהירות עוברים לא בשלים בצלחת פטרי המכילה מדיום טרשת נפוצה. (B) הקוטילדון יתרחב ויהפוך לירוק תוך 10 ימים. (C) השורשים יתחילו להופיע בגיל 14 יום. (D) בתום 21 יום, לצמחים יהיו שורשים מורחבים וקוטילדונים המוכנים להעברה למיכל פלסטיק לצורך התאקלמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 8: שטפו את השורשים. מוציאים את העציצים מהכלים של פטרי ושוטפים בעדינות את המדיה מהשורשים במי ברז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 9: התאקלמות הצמחים . (A) מניחים את הצמחים במיכל פלסטיק ומכסים את השורשים במגבת נייר רטובה למשך 5 ימים כדי להתאקלם בהם. (B) להעביר את הצמחים למגשי תאים המכילים תערובת עציצים מסחרית מתוקנת עם דשן NPK מלא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 10: השתלת השתילים בעציצים. (A) בשלב השני עד השלישי של עלי אמת, השתיל את השתילים בעציצים בקוטר 30 ס"מ מלאים במדיום עציצים מתוקן בדשן. (B) לספק תמיכה לצמחי גפנים ולבצע הכלאה מבוקרת כאשר הצמחים מתחילים לפרוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: בסך הכל 15 גנוטיפים של סקווש, ארבעה C. pepo ו-11 C. moschata, שימשו במחקר עבור צלבים בין-ספציפיים.

טבלה 2: שילובים צולבים ניסו עם 15 הגנוטיפים של הדלעת וקבוצת הפירות המתאימה, מספר הזרעים שהופלו, עוברים לא בשלים והצלת עוברים מוצלחת.

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.