הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תוספי שומנים לאריכות ימים וניתוח שעתוק גנים ב - Caenorhabditis elegans

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64092

⸱

9 בדצמבר 2022

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 3Integrative Program of Molecular and Biochemical Sciences, Baylor College of Medicine, 4Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 5Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לתוספי שומנים בתרביות נוזליות ובתרביות על צלחת עבור Caenorhabditis elegans, יחד עם מחקרי אורך וניתוח שעתוק גנים מכמות גדולה או כמה תולעים ורקמות תולעים.

תקציר

הזדקנות היא תהליך מורכב המאופיין בשינויים פיזיולוגיים מתקדמים הנובעים הן מתרומה סביבתית והן מתרומה גנטית. ליפידים חיוניים למרכיבים מבניים של קרומי התאים, לאגירת אנרגיה וכמולקולות איתות. ויסות חילוף החומרים והאיתותים של השומנים חיוני להפעלת מסלולים ברורים לאריכות ימים. התולעת העגולה Caenorhabditis elegans היא אורגניזם מצוין וחזק לנתח את התרומה של מטבוליזם שומנים ואיתות בוויסות אריכות ימים. מחקרים רבים תיארו כיצד תוספי תזונה של מולקולות שומנים ספציפיות יכולים להאריך את תוחלת החיים של C. elegans ; עם זאת, הבדלים קלים בתנאי התוספים עלולים לגרום לבעיות שכפול בקרב מדענים במעבדות שונות. כאן, דווח על שתי שיטות מפורטות של תוספי תזונה עבור C. elegans המשתמשות בתוספי שומנים עם חיידקים שנזרעו על צלחות או תרחיף חיידקים בתרבית נוזלית. כמו כן מסופקים כאן הפרטים לביצוע בדיקות תוחלת חיים עם תוספת שומנים לכל החיים וניתוח qRT-PCR באמצעות ליזאט תולעת שלמה או רקמות מנותקות שמקורן בכמה תולעים. באמצעות שילוב של מחקרי אורך ומחקרי שעתוק על תוספי שומנים, מבחני ההזנה מספקים גישות מהימנות לנתח כיצד שומנים משפיעים על אריכות ימים והזדקנות בריאה. מתודולוגיה זו יכולה להיות מותאמת גם לגישות סינון תזונתיות שונות כדי להעריך שינויים בתת-קבוצה של תעתיקים באמצעות מספר קטן של רקמות מנותחות או כמה בעלי חיים.

מבוא

שומנים
ליפידים הם מולקולות הידרופוביות או אמפיפתיות קטנות המסיסות בממיסים אורגניים אך אינן מסיסות במים 1,2. מולקולות ליפידים נפרדות נבדלות זו מזו בהתבסס על מספר הפחמן הכלול בשרשראות שלהן, מיקומן, מספר הקשרים הכפולים והמבנים הקשורים אליהן, כולל גליצרול או פוספטים. ליפידים ממלאים תפקידים מכריעים בתוך ובין תאים שונים כדי לווסת תפקודים אורגניזמיים, כולל דו-שכבתיות של ממברנות, אספקת אגירת אנרגיה ופעולה כמולקולות איתות 3,4.

ראשית, שומנים הם מרכיבים מבניים של ממברנות ביולוגיות, כולל קרום הפלזמה והממברנות התת-תאיות התוך-תאיות המפרידות בין התאים הפנימיים לבין הסביבה החוץ-תאית. שנית, שומנים הם הצורה העיקרית של אגירת אנרגיה בבעלי חוליות וחסרי חוליות. שומנים ניטרליים, כולל טריאצילגליצרולים, מאוחסנים לתקופה ממושכת ברקמות שונות, כולל ברקמת השומן. בנמטודה Caenorhabditis elegans, המעי הוא איבר אחסון השומן המטבולי העיקרי; תפקידו אינו מעורב רק בעיכול וספיגה של חומרים מזינים, אלא גם בתהליך של דטוקסיפיקציה, הדומה לפעילות של הפטוציטים של יונקים. רקמות אגירת שומן אחרות כוללות את הנבט, שבו שומנים חיוניים להתפתחות ביציות, ואת היפודרמיס, המורכב מתאי אפידרמיס דמויי עור 3,5. שלישית, בשנים האחרונות, עדויות נוספות מצביעות על כך שליפידים הם מולקולות איתות חזקות המעורבות באיתות תוך-תאי וחוץ-תאי על-ידי פעולה ישירה על מגוון קולטנים, כולל קולטנים מצומדים לחלבון G וקולטנים גרעיניים, או בעקיפין באמצעות אפנון נזילות הממברנה או שינויים לאחר תרגום 6,7,8,9 . מחקרים נוספים ימשיכו להבהיר את המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של איתות שומנים בקידום אריכות ימים ותוחלת חיים.

אורגניזמי מודל חשובים כדי לענות על שאלות ביולוגיות ספציפיות שהן מורכבות מכדי לחקור בבני אדם. לדוגמה, התולעת העגולה C. elegans היא מודל מצוין לביצוע ניתוח גנטי לניתוח תהליכים ביולוגיים הרלוונטיים לתזונת האדם ולמחלות10. המסלולים המולקולריים המשומרים ביותר הרלוונטיים לפיזיולוגיה האנושית, לרקמות מורכבות, לדפוסי התנהגות ולשפע של כלים למניפולציה גנטית הופכים את C. elegans לאורגניזם מודל יוצא דופן11. לדוגמה, C. elegans מצוין בהעברת בדיקות גנטיות לזיהוי גנים ספציפיים לפנוטיפ, כמו גם בבדיקות גנטיות הפוכות ברחבי הגנום באמצעות הפרעת RNA12.

במעבדות, הנמטודות גדלות על צלחות אגר פטרי שנזרעו עם מדשאה של חיידקי Escherichia coli, המספקות מקרונוטריאנטים כגון חלבונים, פחמימות וחומצות שומן רוויות ובלתי רוויות כמקורות אנרגיה ואבני בניין, ומיקרונוטריאנטים כגון קו-פקטורים וויטמינים13. בדומה ליונקים, נמטודות מסנתזות מולקולות של חומצות שומן הן מחומצה פלמיטית והן מחומצה סטארית (מולקולות רוויות של 16 פחמן ו-18 פחמן, בהתאמה) שהן רוויות ברצף ומוארכות למגוון חומצות שומן חד-בלתי רוויות (MUFAs) וחומצות שומן רב-בלתי רוויות (PUFAs)14,15,16,17,18. באופן מעניין, C. elegans מסוגל לסינתזה דה נובו של כל חומצות השומן ואנזימי הליבה הנדרשים המעורבים בביוסינתזה של חומצות שומן, דה-סטורציה והתארכות, מה שמקל על הסינתזה של PUFAsארוכי שרשרת 19. בשונה ממינים אחרים של בעלי חיים, C. elegans יכולים להמיר חומצות שומן 18-פחמן ו-20-פחמן ω-6 לחומצות שומן ω-3 עם אנזימי ω-3 דסטוראז משלהם. בנוסף, לתולעים יש דסטוראז Δ12 המזרז היווצרות חומצה לינולאית (LA) מחומצה אולאית (OA, 18:1)20,21. רוב בעלי החיים או הצמחים חסרים גם Δ12 וגם ω-3 desaturases ולכן מסתמכים על צריכה תזונתית של ω-6 ו- ω-3 כדי להשיג את ה- PUFA שלהם, בעוד ש- C. elegans אינו זקוק לחומצות שומן תזונתיות22. מוטנטים מבודדים ללא אנזימי דסטוראז פונקציונליים שימשו לחקר התפקודים של חומצות שומן ספציפיות בתהליכים ביולוגיים שונים, כולל רבייה, גדילה, אריכות ימים והעברה עצבית. ניתן לטפל בהשפעה של חומצות שומן בודדות על מסלולים ביולוגיים ספציפיים באמצעות גישה גנטית ותוספי תזונה16,17,23. עד כה, מחקר השומנים התמקד באפיון גנים המעורבים בסינתזה של שומנים, פירוק, אחסון ופירוק במצבים נוירולוגיים והתפתחותיים24. עם זאת, התפקידים של שומנים בוויסות אריכות ימים רק מתחילים להתגלות.

איתות שומנים בוויסות תוחלת החיים
ליפידים ממלאים תפקידים מכריעים בוויסות תוחלת החיים על ידי הפעלת מפלי איתות תאיים ברקמות ובסוגי תאים שונים. מחקרים אחרונים הדגישו את התפקידים הפעילים של שומנים בוויסות שעתוק ותקשורת בין תאים באמצעות חלבונים קושרי שומנים או זיהוי קולטני ממברנה25. בנוסף, תוספי שומנים תזונתיים מציעים כלי מצוין לנתח כיצד חילוף החומרים של שומנים משפיע על תוחלת החיים של C. elegans. הוכח כי MUFAs ו-PUFA שונים מקדמים אריכות ימים על-ידי הפעלת גורמי שעתוק26,27.

מודלים של אריכות ימים, כולל איתות אינסולין/IGF-1 ואבלציה של תאים מבשרי נבט, קשורים למסלול הביוסינתזה של MUFA, ותוספי MUFA, כולל חומצה אולאית, חומצה פלמיטולאית וציס-vaccenic, מספיקים כדי להאריך את תוחלת החיים של C. elegans 26. למרות שאפקט אריכות הימים שהוענק על ידי ממשל MUFA דורש חקירה נוספת, המנגנון הבסיסי צפוי להיות מתווך על ידי גורם השעתוק SKN-1/Nrf2, שהוא מפעיל מרכזי של תגובת עקה חמצונית ותקנה לאריכות ימים28,29. בקרב MUFAs, קבוצה מסוימת של אתנולמידים אציליים שומניים הנקראים N-acylethanolamines (NAEs) ממלאת תפקידים מכריעים במנגנונים שונים כולל דלקת, אלרגיות, למידה, זיכרון ומטבוליזם של אנרגיה30. במיוחד, מולקולת השומנים המכונה אולאויל-אתנול-אמיד (OEA) זוהתה כרגולטור חיובי של אריכות ימים על ידי קידום הטרנסלוקציה של החלבון קושר השומנים 8 (LBP-8) לתוך הגרעין כדי להפעיל את קולטני ההורמון הגרעיני NHR-49 ו- NHR-807. תוספת של האנלוגי OEA KDS-5104 מספיקה להארכת תוחלת החיים, וגורמת לביטוי של גנים המעורבים בתגובות עקה חמצונית ובחמצון β מיטוכונדריאלי 7,8.

יחד עם זאת, תפקידם של PUFAs נקשר גם לרגולציה של אריכות ימים. מתן PUFA ω-3 חומצת שומן α-חומצה לינולנית (ALA) מקדם אריכות ימים על ידי הפעלת NHR-49/PPARα, גורמי שעתוק SKN-1/NRF וגרימת חמצון β מיטוכונדריאלי31. באופן מעניין, מוצרים מחומצנים של ALA, המכונים אוקסיליפינים, מפעילים את SKN-1/NRF, מה שמרמז על כך שגם PUFA וגם הנגזרות החמצוניות שלהם יכולים להעניק יתרונות לאריכות ימים23. תוספת של חומצת שומן ω-6 חומצה ארכידונית (AA) וחומצה דיהומו-γ-לינולנית (DGLA) מאריכה את תוחלת החיים באמצעות הפעלת אוטופגיה, מקדמת בקרת איכות חלבון וכתוצאה מכך פוגעת בצברי חלבון מבוזבזים ורעילים27,32. לאחרונה, ויסות איתות תאי לא אוטונומי המתווך על ידי החלבון קושר השומנים 3 (LBP-3) ו-DGLA הוכח כחיוני לקידום אריכות ימים על-ידי שליחת אותות היקפיים לנוירונים, מה שמרמז על תפקיד ארוך טווח של מולקולות שומנים בתקשורת בין רקמות ברמות מערכתיות33. המחקר הנוכחי מדווח על כל שלב לביצוע תוספי שומנים עם חיידקים שנזרעו על צלחות או תרחיף חיידקים בתרבית נוזלית. מתודולוגיות אלה משמשות להערכת תוחלת חיים וניתוח שעתוק, תוך שימוש בתכולת גוף שלמה או ברקמות מנותקות שמקורן בכמה תולעים. ניתן להתאים את הטכניקות הבאות למגוון מחקרים תזונתיים ולהציע כלי תקף לנתח כיצד חילוף החומרים של השומנים משפיע על אריכות ימים והזדקנות בריאה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

איור 1 מתאר סכמת הזנה של שומנים באמצעות הגדרות ניסוי שונות.

1. הכנת חיידקים מותני שומנים

  1. הכן את תמיסת הבסיס להגבלה תזונתית של דילול חיידקים (BDR) על-ידי המסת 5.85 גרם של NaCl, 1.0 גרםשל K 2 HPO 4 ו-6.0 גרם של KH2PO4 (ראו טבלת חומרים) ב-999 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה. התאם את ה- pH ל- 6.0 עם 0.5 M KOH, ולאחר מכן סנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר.
    הערה: ניתן לאחסן את תמיסת ה-BDR בטמפרטורת החדר לאחסון לטווח ארוך.
  2. הכן את מדיום ה-BDR על-ידי הוספת 10 מיקרו-ליטר של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול (מומס באתנול עמיד בפני 200 מ"ל) לכל 10 מ"ל של תמיסת בסיס BDR.
  3. פסו את חיידקי OP50 (ראו טבלת חומרים) ממלאי של -80 מעלות צלזיוס לצלחות LB-agar ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: לאחר הדגירה במהלך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, ניתן לאחסן את צלחת OP50 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לקבלת תוצאות הזנה יציבות.
  4. יש לחסן את חיידקי OP50 מצלחת OP50 LB-agar למדיום LB ולדגירה בשייקר של 37°C למשך הלילה (16 שעות).
    הערה: הנפח הבינוני של LB הדרוש תלוי בהגדרות הניסוי. מומלץ להשתמש ב-200 μL של 5x חיידקים מרוכזים שנזרעו על כל אחת מהצלחות בגודל 6 ס"מ וב-1 מ"ל של 5x חיידקים מרוכזים עבור כל אחת מהצלחות בגודל 10 ס"מ וכל אחת מהן משוכפלת של תנאי ההזנה הנוזלית. לכן, 1 מ"ל ו 5 מ"ל של חיסון LB ראשוני חייב להיות מוכן עבור כל תרבית הזנה שומנים, בהתאמה.
  5. אסוף חיידקים באמצעות צנטריפוגה בגודל 4,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט.
  6. השהה את כדור החיידקים ב-20 מ"ל של בסיס BDR, וצנטריפוגה ב-4,000 x גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופר-נטנט.
    הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לשטוף את שאריות של LB בכדור החיידקי.
  7. השהה כל כדור חיידקי במדיום BDR כדי ליצור מלאי חיידקי BDR פי 20. יש לדלל את מלאי חיידקי ה-BDR פי 20 עם מדיום BDR עד פי 5 לפני השימוש.
    הערה: השתמש בנפח של 1/20 של מדיום BDR של נפח LB המקורי כדי להגיע לריכוז של פי 20 עבור החיידקים. ניתן לאחסן את מלאי החיידקים פי 20 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
  8. הכינו תמיסת מלאי שומנים, תוך שימוש באתנול או דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כממס בבקבוקון זכוכית חדש, ומלאו את בקבוקון הזכוכית בארגון או בחנקן כדי למנוע חמצון.
    הערה: ריכוז התמיסה במלאי הוא בדרך כלל בין 250 mM ל-1mM.
  9. העבירו את תמיסת מלאי השומנים לכמות הרצויה של תמיסת חיידקי BDR כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי בתנאי האכלה. מערבבים היטב על ידי מערבולת במשך 20 שניות.
    הערה: הריכוז הסופי של השומנים בהזנה הוא בדרך כלל 1 μM עד 1 mM, בהתאם לשומנים ולתנאי הבדיקה. מומלץ לערוך תחילה ניסוי פיילוט כדי לבדוק ריכוזים שונים הנעים בין 0.1 מיקרומטר ל-1 מ"מ אם עובדים עם שומנים חדשים. ערבבו את תמיסת מלאי השומנים עם חיידקי BDR מיד לפני זריעתו לצלחת או הכנסתו לתרביות תולעים נוזליות. הכינו את החיידקים המותנים בשומנים לא יותר משעה לפני ההזנה לתולעים.
  10. ערבבו את אותם נפחים של אתנול מסונן או DMSO (תלוי באיזה מהם משתמשים בקבוצת הזנת השומנים) עם חיידקי BDR כדי לשמש כבקרת הרכב.

2. הכנת C. elegans מסונכרנים לתוספת שומנים

  1. הכן מאגר M9 על ידי ערבוב (תוך שימוש בריכוזים הסופיים שצוינו) 22 mM KH 2 PO 4, 22 mM Na 2HPO 4, 85 mM NaCl ו-2mM MgSO 4 (ראה טבלת חומרים). אוטוקלאב את המאגר כדי לעקר.
  2. הכינו תמיסת אקונומיקה טרייה עם 60% אקונומיקה ביתית (v/v, ראו טבלת חומרים) וריכוז סופי של 1.6 M NaOH.
  3. אסוף בוגרים גרבידים בצינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות 10 מ"ל של חיץ M9.
    הערה: מספר התולעים והלוחות הדרושים לסנכרון תלוי בהגדרות הניסוי (כלומר, מספר התנאים והשכפולים ושיטות ההזנה). באופן אידיאלי, כל צלחת מלאה של 6 ס"מ של תולעים בוגרות אמורה להיות מסוגלת להניב לפחות 600 תולעים L1 לאחר סנכרון.
  4. סובבו את התולעים ב-1,450 x גרם למשך 30 שניות. הסר את supernatant ולשטוף את התולעים פעם נוספת עם 10 מ"ל של חיץ M9.
  5. סובבו את התולעים ב-1,450 x גרם למשך 30 שניות. לשאוף את supernatant, משאיר aliquot 4 מ"ל בצינור חרוטי. יש להוסיף 2 מ"ל של תמיסת אקונומיקה ולנער במרץ במשך דקה אחת.
  6. סובבו את התולעים ב-1,450 x גרם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.
  7. הסר את supernatant ולהוסיף 4 מ"ל של חיץ M9 ו 2 מ"ל של תמיסת אקונומיקה. לנער את הצינור עד גופי התולעת מומסים.
  8. סובבו את הביצים בטמפרטורה של 1,450 x גרם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.
  9. הסר את supernatant ולשטוף את הביצים עם 10 מ"ל של חיץ M9.
  10. חזור על שלבים 2.8 ו- 2.9 3x.
  11. להשעות את העוברים עם 6 מ"ל של חיץ M9. נדנדנדו את העוברים על מסובב בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך יומיים כדי לאפשר להם לבקוע ולהסתנכרן.
  12. מעבירים זחלי L1 לצלחות זרעים OP50. דגירה בטמפרטורה של 20°C למשך 48 שעות כדי לאסוף תולעי L4 מסונכרנות, 72 שעות עבור יום-1 מבוגרים, ו-96 שעות עבור יום-2 מבוגרים.
    הערה: לוחות OP50 מוכנים על ידי הוספת 1 מ"ל של 20x OP50 חיידקים לכל צלחת 10 ס"מ של מדיום גידול נמטודה (NGM)34. ניתן לזרוע 30,000 תולעי L1 לכל אחת מצלחות OP50 אם הן שואפות לקצור את התולעים בשלב L4, וניתן לזרוע 20,000 תולעי L1 לכל אחת מצלחות OP50 אם שואפים לקצור בוגרים של יום-1 במסגרות הניסוי הנוכחיות. זה עשוי להיות שונה עבור הגדרות מעבדה שונות, ולכן מומלץ לבדוק את מספרי התולעים שניתן לזרוע כדי לוודא שלתולעים נותר מספיק מזון לפני שהן נקטפות.
  13. אסוף תולעים בוגרות L4, יום-1 בוגרות או יום-2 בצינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות 10 מ"ל של חיץ M9. השתמשו בעוד 5 מ"ל של חיץ M9 כדי לשטוף את שאריות התולעים מהצלחות.
  14. סובבו את התולעים ב-1,450 x גרם למשך 30 שניות והשליכו את הסופר-נטנט. לשטוף את כדור התולעת עם 10 מ"ל של מדיום BDR, צנטריפוגה ב 1,450 x גרם במשך 30 שניות, ולהשליך את supernatant.
  15. עבור תולעים בשיטת ההזנה הנוזלית, העבירו את מדיום ה-BDR לתולעים כדי להשיג ריכוז תולעים של 3,000 תולעים/מ"ל. עבור תולעים בשיטות האכלה בצלחת, הפחיתו את נפח מדיום ה-BDR שנוסף לתולעים כדי לקצר את זמן הייבוש בצלחת.

3. תוספת שומנים עבור C. elegans

  1. בצעו תוספי שומנים בתרבית נוזלית לפי השלבים הבאים.
    הערה: שיטה זו מתאימה לבדיקת שינויי שעתוק באמצעות תולעים בתפזורת בתוספת שומנים.
    1. העבירו את הכמות הרצויה של בקרת שומנים או רכב לכל אחת מהבארות בלוחית של 12 בארות. הכינו שלוש עד ארבע בארות לכל תנאי הזנה כשכפול ביולוגי.
    2. ערבבו את תרחיף התולעים משלב 2.15 עם 5x חיידקי BDR ביחס של 1:1 כדי להשיג ריכוז סופי של 1,500 תולעים/מ"ל ופי 2.5 לחיידקים.
    3. מעבירים 2 מ"ל מתערובת התולעת-חיידקים במדיום BDR לכל באר של צלחת 12 הבאר.
    4. עוטפים את צלחת 12 הבארות בנייר כסף ומנערים באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס ב-100 סל"ד לאורך הדגירה הרצוי.
      הערה: כדי לבדוק תנאי האכלה שונים, דגרו את השומנים עם תולעים לפרקי זמן שונים, כגון במשך 6 שעות, 12 שעות ו-24 שעות. בנוסף, ניתן לבדוק שלבי תולעים שונים לקבלת תוצאות מיטביות, כולל הזנת שומנים מהשלב הבוגר L4 או day-1.
  2. בצעו תוספי שומנים על צלחות האגר בגודל 10 ס"מ NGM בהתאם לשלבים הבאים.
    הערה: שיטה זו מתאימה לבדיקת שינויי שעתוק באמצעות תולעים בתפזורת בתוספת שומנים.
    1. זרעו 1 מ"ל של החיידקים המותנים בשומנים משלב 1.9 אל מרכז כל אחד מהלוחות באורך 10 ס"מ. כאשר הוכנו מספר גבוה של צלחות, מערבבים את הפתרון הסופי העובד מספר פעמים בין זריעה. יבשו את הצלחות בחושך באמצעות מכסה מנוע בטיחותי.
    2. העבר 3,000 תולעים משלב 2.15 לכל אחד מהלוחות באורך 10 ס"מ. יבשו את הצלחות במכסה מנוע בטיחותי עד שהתולעים יוכלו לזחול על הצלחות עם תוספי השומנים במקום לשחות.
    3. דגירה של התולעים על הלוחות המותנים בשומנים באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי. יש להגן מפני אור אם משתמשים בשומנים רב בלתי רוויים.
      הערה: כדי לבדוק תנאי האכלה שונים, דגירה של השומנים עם תולעים לפרקי זמן שונים, כגון 6 שעות, 12 שעות ו-24 שעות. בנוסף, ניתן לבדוק שלבי תולעים שונים לקבלת תוצאות מיטביות, כולל הזנת שומנים בדם בשלב הבוגר L4 או יום-1.
  3. בצע תוספת שומנים על לוחות אגר NGM בגודל 6 ס"מ לניתוח שעתוק.
    הערה: שיטה זו מתאימה לבדיקת שינויי שעתוק בכמה תולעים בתוספת שומנים.
    1. זרע 300 μL של חיידקים מותנים בשומנים משלב 1.9 על מרכז כל צלחת בגודל 6 ס"מ. כאשר הוכנו מספר גבוה של צלחות, מערבבים את הפתרון הסופי העובד מספר פעמים בין זריעה. יבשו את הצלחות בחושך באמצעות מכסה מנוע בטיחותי.
    2. מעבירים עד 300 תולעים משלב 2.15 לכל אחת מהצלחות בקוטר 6 ס"מ. ייבשו את הצלחות במכסה המנוע עד שהתולעים יכולות לזחול על הצלחות עם תוספי השומנים במקום לשחות.
    3. דגירה של התולעים על הלוחות המותנים בשומנים באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי. יש להגן מפני אור אם משתמשים בשומנים רב בלתי רוויים.
      הערה: כדי לבדוק תנאי האכלה שונים, דגרו את השומנים עם תולעים בנקודות זמן שונות, כגון 6 שעות, 12 שעות ו-24 שעות. בנוסף, ניתן לבדוק שלבי תולעים שונים לקבלת תוצאות מיטביות, כולל הזנת שומנים בדם בשלב הבוגר L4 או יום-1.
  4. יש לבצע נטילת תוסף שומנים על לוחות אגר NGM בקוטר 6 ס"מ לצורך בדיקת אורך חיים.
    1. זרע 200 μL של חיידקים מותנים בשומנים (עם ריכוז שומנים אחד ופי 5 חיידקים מרוכזים) על מרכז כל אחד מלוחות NGM בגודל 6 ס"מ. הכינו שלוש צלחות לכל תנאי האכלה.
      הערה: יש להכין את הצלחות טריות ביום השימוש (באופן אידיאלי ממש לפני השימוש).
    2. יבשו את הצלחות במכסה מנוע ביו-בטיחותי. יש לכבות את האורות במכסה המנוע ובחדר אם משתמשים בשומנים רב-בלתי רוויים.
    3. בחר 30-40 תולעי L4 מסונכרנות לכל אחד מהלוחות. שמור את הצלחות עם התולעים באינקובטור 20 מעלות צלזיוס. אם אתם ניזונים מליפידים רב-בלתי רוויים, שמרו את הצלחות בקופסה מוגנת אור באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן להשתמש ב-OP50 מלוח מעבר רגיל בקוטר 6 ס"מ (OP50 ללא תנאי) כדבק לאיסוף תולעים, אך חשוב מאוד לא להשאיר כמות גדולה של OP50 בלתי מותנית בצלחת הבדיקה.
    4. מעבירים את התולעים לצלחות חדשות וטריות מותנות בשומנים מדי יום או כל יומיים, בהתאם למצב ההזנה הרצוי. הישרדות הוא ניקוד באותו אופן כפי שתואר קודםלכן 4.

4. מיצוי RNA לניתוח שעתוק

  1. בצע מיצוי RNA ממספר גדול של תולעים שלמות.
    1. העבר תולעים בתרבית הנוזלית משלב 3.1 ל 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge. שטפו תולעים מלוחות 10 ס"מ משלב 3.2 באמצעות חיץ M9 והעבירו את התולעים במאגר M9 לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    2. צנטריפוגה קצרה של התולעים עם מיני צנטריפוגה שולחנית (ראו טבלת חומרים) במשך 10 שניות ושאפו במהירות את הסופר-נטנט.
    3. מעבירים שאריות תולעים מבארות ההזנה הנוזליות או שוטפים מהצלחות לאותו צינור ומסתובבים. הסר את הסופרנטנט.
    4. שטפו את כדורי התולעת ב-1 מ"ל של M9 קר כקרח, סובבו לזמן קצר במשך 10 שניות עם מיני צנטריפוגה, ושאפו את הסופר-נט. חזור על 1x או 2x בהתאם לשקיפות של הסופרנטנט.
    5. הניחו את צינורות המיקרוצנטריפוגה על קרח למשך 2 דקות והסירו כמה שיותר סופר-נטנט עם פיפטה של 200 μL, והשאירו כדור תולעת ארוז בנפח של לא יותר מ-15 μL.
    6. מעבירים 15 μL של תמיסת מיצוי RNA המכילה פנול וגואנידין איזותיוציאנט (טבלת חומרים) לכל אחד מצינורות המיקרוצנטריפוגה וטוחנים את התולעים עם מטחנת מנוע במשך כ-30 שניות עד שלא נראות תולעים שלמות.
      התראה: תמיסת מיצוי הרנ"א היא רעילה ודליקה, וכל שלב הכרוך במיכל פתוח עם מגיב זה חייב להיות מופעל במכסה מנוע כימי.
    7. העבר 285 μL מתמיסת מיצוי ה- RNA לצינור המיקרוצנטריפוגה תוך שטיפת כל תוכן תולעת מקצה מטחנת המנוע לצינור המיקרוצנטריפוגה. מערבולת לערבב היטב.
      הערה: זוהי נקודת השהיה. דגימות ניתן לאחסן בתמיסת מיצוי RNA ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. כאשר מוציאים את -80 מעלות צלזיוס, נותנים לדגימות להפשיר בטמפרטורת החדר.
    8. העבר 60 μL של כלורופורם לכל דגימה ומערבולת במרץ. תנו לדגימות לשקוע בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
      התראה: כלורופורם הוא רעיל ויש לטפל בו במכסה מנוע כימי.
    9. צנטריפוגה ב 21,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבר בזהירות 140 μL של השכבה המימית בחלק העליון לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ונטול RNase באמצעות פיפטה של 200 μL, העברת 2x עם 70 μL בכל פעם.
      הערה: משלב זה והלאה, כל קצוות הפיפטה והמיכלים שיש להם מגע ישיר עם הדגימה צריכים להיות נטולי RNase. כמו כן, מומלץ להשתמש בתמיסת טיהור RNase כדי לנגב את כל הציוד ואת מרחב העבודה.
    10. העבר 140 μL של איזופרופנול לצינור הדגימה. מערבלים במרץ ונותנים לדגימה להתיישב בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. צנטריפוגה ב 21,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ולהסיר בזהירות את כל supernatant.
    11. מעבירים 0.5 מ"ל של אתנול קר כקרח 80% אתנול (v/v) לצינור הדגימה עם גלולת RNA. מערבולת במרץ עד שכדור הרנ"א עוזב את תחתית הצינור וצף סביב בתמיסת האתנול. צנטריפוגה ב 21,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant.
    12. צנטריפוגה קצרה של צינורות הדגימה בצנטריפוגה המיני במשך 15 שניות כדי לסובב כל ממס שנדבק לדופן הצינור, ולאחר מכן להסיר את תמיסת האתנול הרבה ככל האפשר עם פיפטה.
    13. השאירו את מכסה הצינור פתוח לייבוש גלולת ה-RNA. אם הכדור נשטף ביסודיות עם תמיסת האתנול, שלב הייבוש צריך לקחת פחות מ -10 דקות.
      הערה: זוהי נקודת השהיה. גלולת RNA מיובשת יכולה להיות מאוחסנת ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
    14. ממיסים את גלולת הרנ"א היבש ב-40 מיקרון מים נטולי נוקלאז ומעבדים עם ערכה להסרת דנ"א בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
      הערה: מומלץ להמיס RNA במים נטולי נוקלאז תחילה. אם מערבבים 40 μL של מים עם חיץ 10x DNase לפני המעבר לצינור ה-RNA, כדור ה-RNA לא יתמוסס לחלוטין. דגימות הרנ"א צריכות להישמר על קרח בעת המסת גלולת הרנ"א במים. מחזורי הפשרה בהקפאה מפחיתים את איכות הרנ"א; לכן, המשך לשלב השעתוק ההפוך באותו יום של הטיפול ב- DNase.
  2. מיצוי RNA ממספר קטן של תולעים שלמות.
    1. בחרו 15-20 תולעים מהמדשאה החיידקית שלהן לתוך צלחת NGM חדשה ולא מעובדת כדי לסלק את החיידקים מהתולעת.
    2. על פי היצרן של ערכת qRT-PCR 2-step (ראה טבלת חומרים), להכין 20 μL של תמיסת ליזה סופית עבור כל דגימה על ידי ערבוב 0.2 μL של DNase עם 19.8 μL של תמיסת ליזה בצינורות PCR. מערבבים את תמיסת הליזיס על ידי צנרת למעלה ולמטה פי 5.
    3. מעבירים 15-20 תולעים מצלחת ה-NGM הלא ממומשת לתוך צינור ה-PCR המכיל 20 מיקרון של תמיסת התזה הסופית עם מספר מינימלי של חיידקים. לדגור את תגובת התזה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. Probe-sonicate (ראה טבלת חומרים) התולעים עם משרעת 30% באמצעות התוכנית הבאה: סוניקציה במשך 5 שניות, הפסקה במשך 5 שניות, וחזרה על 4x עם זמן סוניקציה כולל של 20 שניות. שמור את הדגימות באמבט מים קרים כקרח במהלך סוניקציה.
    5. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
      הערה: הוסף עוד DNase לפני הדגירה אם הבקרה השלילית ללא RT מראה זיהום DNA ברמה מדאיגה.
    6. העבר 2 μL של תמיסת עצירה לתגובת הליזיס וערבב על ידי הקשה עדינה. דגירה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להגדיר על קרח.
      הערה: ניתן להשאיר את הדגימות על קרח עד שעתיים לפני שתמשיך לשלב השעתוק ההפוך.
  3. בצע מיצוי RNA מרקמות תולעת לפי השלבים הבאים.
    1. בחרו כ-20 תולעים מהמדשאה החיידקית שלהן והניחו אותן על צלחת NGM טרייה שלא נזרעה כדי להסיר מהן את החיידקים.
    2. העבירו את 20 התולעים (עם כמה שפחות חיידקים) לזכוכית שעון המכילה 500 μL של תמיסת M9 המכילה 4 μM levamisole (ראו טבלת חומרים). האימוביליזציה תתרחש תוך שניות.
    3. כאשר התולעים משותקות, נתחו את הנבט או המעי באמצעות מחט של 25 גרם שניתן לחבר למזרק 1 מ"ל.
      1. תחת היקף הנתיחה, לבצע חתך במיקום של נורת הלוע השנייה כדי לאפשר שחול טבעי של המעי ואת הנבט. ניתן להבחין בקלות בין שתי הרקמות על סמך המורפולוגיה שלהן והניגודיות השונה שלהן. השתמש פינצטה או מחטים כדי להפריד בעדינות את הרקמות, הימנעות מפגיעה בהם.
        הערה: מומלץ לנתח תוך 5-10 דקות. אם החתך אינו מייצר שחול רקמה טוב, מומלץ לעבור לתולעת הבאה ולנתח כמה שיותר תוך 10 דקות. הליך זה דורש מסגרת זמן קצרה כדי למנוע שינויי תמלול מהסביבה.
    4. על פי יצרן ערכת qRT-PCR דו-שלבית, הכן 20 μL של תמיסת ליזיס סופית עבור כל דגימה על ידי ערבוב 0.2 μL של DNase I עד 19.8 μL של תמיסת ליזה בצינורות PCR. מערבבים את תמיסת הליזיס על ידי צנרת למעלה ולמטה פי 5.
    5. השתמש פיפטה זכוכית autoclaved כדי להעביר את הרקמות מנותקות לתוך צינור PCR. הניחו את צינורות ה-PCR על קרח למשך 2 דקות כדי לאפשר שקיעת חומר בתחתית. הסר את הסופרנטנט, הוסף 20 μL של תמיסת ליזיס סופית לתוך צינור ה- PCR, וערבב על ידי הקשה.
    6. לדגור את תגובת התזה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבר 2 μL של תמיסת עצירה לתגובת הליזיס וערבב על ידי הקשה. לדגור במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: ניתן להשאיר את הדגימות על קרח עד שעתיים לפני שתמשיך לשלב השעתוק ההפוך.

5. תמלול לאחור ו- qRT-PCR

  1. בצע תמלול הפוך ו- qRT-PCR מתולעים בתפזורת.
    1. מדוד את ריכוז ה- RNA והכן 5 מיקרוגרם של RNA כולל לשעתוק הפוך.
    2. הכינו דגימת RNA מרוכזת על ידי ערבוב כמויות שוות של RNA מכל דגימה והתאמת ריכוז הרנ"א הסופי ל-0.556 גרם/ל' (5 מיקרוגרם/9 מיקרול). השתמש בדגימת ה-RNA המאוגדת עבור העקומה הסטנדרטית qRT-PCR ובקרות RT-negative.
    3. בצע תמלול הפוך בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). הפעל את בקרת האיכות הבאה בתגובות שעתוק לאחור לצד דגימות ה- RNA הבודדות.
      1. בצע שעתוק הפוך עם דגימת הרנ"א המאוגדת כתבנית (עבור עקומה סטנדרטית qRT-PCR).
      2. בצע שעתוק הפוך עם דגימת ה-RNA המאוגדת כתבנית, ללא הטרנסקריפטאז ההפוך (בקרת RT-שלילית; בקרת איכות עבור זיהום DNA פוטנציאלי בגנום).
      3. בצע שעתוק הפוך עם המים נטולי הנוקלאז כתבנית (בקרת RT-שלילית; בקרת איכות לזיהום RNA פוטנציאלי בריאגנטים).
        הערה: זוהי נקודת השהיה. דגימות ניתן להשאיר ב thermocycler לילה או מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
    4. דלל את ה-cDNA שנוצר מדגימות ה-RNA המאוגדות ארבע פעמים, 20 פעמים, 100 פעמים ו-500 פעמים עם מים נטולי נוקלאז לקבלת עקומות סטנדרטיות qRT-PCR.
    5. דלל את ה-cDNA שנוצר מכל דגימת RNA 20-100 פעמים כדי להשתמש בו כתבניות לתגובות qRT-PCR.
      הערה: יחס הדילול תלוי בשפע הגן המעניין. עבור גנים בעלי ביטוי גבוה, כגון גנים של משק בית או egl-3 ו- egl-21 המשמשים במחקר זה, מומלץ דילול של פי 100. עבור גנים בעלי ביטוי נמוך, כגון lbp-8, מומלץ דילול של פי 20.
    6. בצע qRT-PCR עם ריאגנטים qRT-PCR בהתאם להוראות היצרן כדלקמן: 95 °C למשך 10 דקות, חזור על 40 פעמים עם 95 °C למשך 15 שניות ו- 60 °C למשך דקה אחת, ולאחר מכן תוכנית עקומת ההיתוך המוגדרת כברירת מחדל, והחזק ב- 8 °C לזמן בלתי מוגבל.
  2. בצע שעתוק לאחור ו- qRT-PCR מכמה תולעים או רקמות תולעים.
    1. העבר 25 μL של מאגר RT ו- 2.5 μL של תערובת אנזימי RT 20x מהערכה הדו-שלבית qPCR (ראה טבלת חומרים) לכל צינור המכיל ליזאט תולעת משלב 4.2.6 או שלב 4.3.6.
      הערה: בקרת RT-שלילית היא קריטית עבור qRT-PCR מכמה תולעים. כל ניסוי צריך לכלול דגימה של ליזאט תולעת (משלב 4.2.6) עם מאגר RT אך ללא אנזים RT כדי לבחון את זיהום הדנ"א בדגימות. אם יש בעיה בזיהום דנ"א, שקול להוסיף יותר DNase למאגר התזה או יותר DNase לדגימה לאחר שהתולעים שוכבות. לחלופין, ניתן לבצע בקרת RT-שלילית עבור כל דגימה על ידי שימוש במחצית מהליזאט בתגובת RT רגילה ובחצי השני בתגובת RT ללא טרנסקריפטאז הפוך.
    2. מערבבים על ידי הקשה עדינה. הסתובבו באמצעות מיני צנטריפוגה למשך 10 שניות.
    3. טען את הדגימות למכונת התרמוציקלר בהתאם להוראות היצרן: 37 °C למשך 60 דקות, 95 °C למשך 5 דקות ו- 8 °C לזמן בלתי מוגבל.
      הערה: זוהי נקודת השהיה. דגימות ניתן להשאיר ב thermocycler לילה או מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
    4. שמור את כל הריאגנטים והדגימות על קרח והגן על ריאגנטים qRT-PCR מפני אור.
    5. הכינו צלחת qPCR של 96 בארות, ובכל באר ערבבו 6 μL של מים נטולי נוקלאזות, 10 μL של ריאגנט qRT-PCR, 2 μL של 5 μM תערובת פריימר (קדימה ואחורה), ו-2 μL של cDNA. כסו את משטח לוח ה-qPCR בעל 96 הבארות בסרט אופטי מגן ולחצו כלפי מטה כדי לאטום אותו.
    6. הפעל את תוכנית qRT-PCR על רוכב תרמי בהתאם להוראות היצרן כדלקמן: 50 °C למשך 2 דקות, 95 °C למשך 2 דקות, חזור על 40 פעמים עם 95 °C למשך 3 שניות ו- 60 °C למשך 30 שניות, ואחריו 8 °C לזמן בלתי מוגבל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אימות של שינויי שעתוק באמצעות כמה תולעים שלמות עם תוספת שומנים
כדי לחקור אם הפרוטוקול לחילוץ ולתמלול מחדש של RNA לתוך cDNA מכמה תולעים שלמות ניתן לשחזור ולהשוואה עם הנתונים של תולעים בתפזורת,נעשה שימוש בזן תולעים בעל תוחלת חיים ארוכה המבטא יתר על המידה את החומצה הליזוזומלית ליפאז lipl-4 במעי 7,8,33,35. אינדוקציה שעתוק של הגנים לעיבוד נוירופפטידים egl-3 ו- egl-21...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תוספי שומנים שימשו במחקרי הזדקנות כדי להבהיר את ההשפעה הישירה של מיני שומנים מסוימים על הזדקנות בריאה 6,7,23,26,27,31. עם זאת, הליך נטילת תוספי שומנים יכול להיות מאתגר, וכל חוסר עקביות בין הניסויים יכול לגרום לתוצאות שאינן ניתנות לשחזור. כאן, הפרוטוקול המפורט הראשון שלב אחר שלב מתועד כדי להנחות מדענים חדשים כדי למנוע את המלכו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים.

תודות

אנו מודים ל- P. Svay על התמיכה בתחזוקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), קרן מארס אוף דימס (MCW), קרן וולש (MCW), חוקר HHMI (M.C.W.) ועמית קדם-דוקטורט (M.S.) של NIH T32 ES027801. חלק מהזנים סופקו על ידי CGC, הממומן על ידי משרד תוכניות תשתית המחקר של NIH (P40 OD010440).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 מ"ל עליGenesee Scientific93-165P15לטחינת תולעים עם טריזול
אגרוזסיגמאA9639-500G
AmfiRivert cDNA סינתזה פלטינה מאסטר מיקסGenDEPOTR5600לשעתוק הפוך מדגימות תולעת בתפזורת
יישומי Biosystems QuanStudio 3 בזמן אמת PCRThermoFisherA28567עבור qRT-PCR
Benchmark Scientific StripSpin 12 MicrocentrifugeBenchmark ScientificC1248עבור צינורות PCR מסתובבים
ברנסון 450 סוניפייר דיגיטלי, עם קצה 1/8 אינץ'ברנסון אולטרסאונד תאגיד100-132-888R
כלורופורםפישר סיינטיפיקC298-500
כולסטרולסיגמאC8503-25G
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמאD8418-100ML
Eppendorf 5424 R צנטריפוגהEppendorf22620444Rלמיצוי RNA
Eppendorf vapo protect mastercycler proEppendorf950030010לשעתוק הפוך
אתנול, מוחלט (200 הוכחה)Fisher ScientificBP2818-500
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W צלחתנטע סיינטיפיק66518012 בארות צלחות להאכלת ליקויד
צלחת פטרי גריינר ביו-וואן, Ps, 100 x 20 מ"מנטע סיינטיפיק664161לצלחות LB חיידקים ותולעים 10 ס"מ צלחות NGM
גריינר ביו-וואן צלחת פטרי, Ps, 60 x 15 מ"מנטע סיינטיפיק628161לתולעת 6 ס"מ צלחות NGM
Invitrogen מים ללא נוקלאזThermoFisherAM9937
IsoproanolSigmaPX1835-2
Levamisole hydrochlorideVWRSPCML1054
lipl-4TgMCW LabN/ATransgenic C. elegans
lipl-4Tg; fat-3(wa22)MCW LabN/Aטרנסגני C. elegans
Luria BrothBase ThermoFisher12795-084
מגנזיום גופרתי (MgSO4)SigmaM2643-500G
MicroAmp EnduraPlate אופטי 96-בארות צלחת תגובה מהירה וברורה עם ברקודThermoFisher448335496-well qPCR צלחת
MicroAmp סרט דבק אופטייישומי BioSystem4311971לאיטום צלחת qPCR עם 96 בארות
Milli-Q Advantage A10 מערכת טיהור מיםסיגמאZ00Q0V0WWמים נטולי יונים המשמשים לייצור כל הריאגנטים, כולל חיץ ומדיה תרבותית, אלא אם צוין כמים נטולי נוקלאז בפרוטוקול
N2Caenorhabditis Genetics CenterN/AC. ELEGANS WILD ISOLATE
NanoDrop ND-1000 ספקטרופוטומטרThermoFisherN/Aלמדידת ריכוז RNA
OP50Caenorhabditis Genetics CenterN/Aחיידקים המשמשים כC. elegans מזון
פוטזיום פוספט דו-בסיסי טריהידראט (K2HPO4· 3H2O)SigmaP5504-1KG
Potasium phosphate monobasic (KH2PO4)SigmaP0662-2.5KG
Power SYBR ערכת תאים ירוקים ל-CtThermoFisher4402953לשעתוק הפוך ו-qPCR מכמה תולעים או רקמת תולעת
Power SYBR Green Master MixThermoFisher4367659עבור qPCR מדגימות תולעים בתפזורת
קוטל חיידקים טהור בהיר אולטרה אקונומיקה KIK אינטרנשיונל LLC.59647210143אקונומיקה ביתית 6% להכנת ביצי תולעים
צלחת ספוט פיירקס עם תשעה שקעיםSigmaCLS722085-18EAזכוכית שעון לניתוח התולעים
RNaseZap RNase תמיסת טיהורThermoFisherAM9780
נתרן קלוריד (NaCl)SigmaS7653-1KG
נתרן הידרוקסיד (NaOH)SigmaSX0590-3
נתרן פוספט דו-בסיסי הפטהידראט (Na2HPO4· 7H2O)SigmaS9390-1KG
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R צנטריפוגהThermo7500-4337לאיסוף חיידקים
Thermo Sorvall ST 8 צנטריפוגהThermo7500-7200להכנת ביצי תולעת
TRIzol ReagentTheroFisher15596018מגיב מיצוי RNA
ערכת טורבו ללא DNA ThermoFisherAM1907להסרת זיהום DNA במיצוי RNA
Vortexer 59Denville Scientific INVS7030
VWR מערבלי גלולות חד פעמיים ומנוע אלחוטיVWR47747-370לטחינת תולעים עם Trizol
VWR אנרגיה קינטית 26 ג'אול מיני צנטריפוגה C1413 V-115VWRN/Aלאיסוף תולעים. דגם שהופסק, דגם דומה זמין ב-VWR עם Cat# 76269-064
קוטף תולעיםWormStuff59-AWP

מקורות

  1. Fahy, E., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1. Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).
  2. Liebisch, G., et al. Update on LIPID MAPS classification, nomenclature, and shorthand notation for MS-derived lipid structures. Journal of Lipid Research. 61 (12), 1539-1555 (2020).
  3. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Developmental Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  4. Kimura, T., Jennings, W., Epand, R. M. Roles of specific lipid species in the cell and their molecular mechanism. Progress in Lipid Research. 62, 75-92 (2016).
  5. Duffy, J., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Lipid Metabolism, Lipid Signalling and Longevity. Ageing: Lessons from C. elegans. Healthy Ageing and Longevity. Olsen, A., Gill, M. , Springer. Cham. 307-329 (2017).
  6. Lesa, G. M., et al. Long chain poly-unsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. Journal of Cell Science. 116 (24), 4965-4975 (2003).
  7. Folick, A., et al. Lysosomal signaling molecules regulate longevity in Caenorhabditis elegans. Science. 347 (6217), 83-86 (2015).
  8. Ramachandran, P. V., et al. Lysosomal signaling promotes longevity by adjusting mitochondrial activity. Developmental Cell. 48 (5), 685-696 (2019).
  9. Byrne, E. F. X., et al. Structural basis of Smoothened regulation by its extracellular domains. Nature. 535 (7613), 517-522 (2016).
  10. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A. Transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  11. Nigon, V. M., Félix, M. -A. History of research on C. elegans and other free-living nematodes as model organisms. WormBook. , 1-84 (2017).
  12. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  13. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PloS ONE. 4 (10), 7545(2009).
  14. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (2), 865-875 (2007).
  15. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PloS Genetics. 2 (7), 108(2006).
  16. Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 poly-unsaturated fatty acids cause behavioral and developmental defects in Caenorhabditis elegans fat-3 mutants. Genetics. 163 (2), 581-589 (2003).
  17. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of poly-unsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (9), 5854-5859 (2002).
  18. Watts, J. L., Browse, J. A. Palmitoyl-CoA-specific Δ9 fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 263-269 (2000).
  19. Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends in Endocrinology & Metabolism. 20 (2), 58-65 (2009).
  20. Peyou-Ndi, M. M., Watts, J. L., Browse, J. Identification and characterization of an animal Δ12 fatty acid desaturase gene by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Biochemistry and Biophysics. 376 (2), 399-408 (2000).
  21. Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal ω-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (4), 1142-1147 (1997).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Isolation and characterization of a Δ5-fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Archives of Biochemistry and Biophysics. 362 (1), 175-182 (1999).
  23. Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (81), e50879(2013).
  24. Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695(2021).
  25. Sunshine, H., Iruela-Arispe, M. L. Membrane lipids and cell signaling. Current Opinion in Lipidology. 28 (5), 408-413 (2017).
  26. Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
  27. O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. ω-6 Poly-unsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes & Development. 27 (4), 429-440 (2013).
  28. Steinbaugh, M. J., et al. Lipid-mediated regulation of SKN-1/Nrf in response to germ cell absence. eLife. 4, 07836(2015).
  29. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 88, 290-301 (2015).
  30. Ezzili, C., Otrubova, K., Boger, D. L. Fatty acid amide signaling molecules. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 20 (20), 5959-5968 (2010).
  31. Qi, W., et al. The ω-3 fatty acid α-linolenic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan via NHR-49/PPARα and oxidation to oxylipins. Aging Cell. 16 (5), 1125-1135 (2017).
  32. Shemesh, N., Meshnik, L., Shpigel, N., Ben-Zvi, A. Dietary-induced signals that activate the gonadal longevity pathway during development regulate a proteostasis switch in Caenorhabditis elegans adulthood. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 254(2017).
  33. Savini, M., et al. Lysosome lipid signalling from the periphery to neurons regulates longevity. Nature Cell Biology. 24 (6), 906-916 (2022).
  34. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  35. Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322 (5903), 957-960 (2008).
  36. Jacob, T. C., Kaplan, J. M. The EGL-21 carboxypeptidase E facilitates acetylcholine release at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscience. 23 (6), 2122-2130 (2003).
  37. Kass, J., Jacob, T. C., Kim, P., Kaplan, J. M. The EGL-3 proprotein convertase regulates mechanosensory responses of Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9265-9272 (2001).
  38. Bael, S. V., et al. Mass spectrometric evidence for neuropeptide-amidating enzymes in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 293 (16), 6052-6063 (2018).
  39. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNAqRT PCR
תוספי שומנים לאריכות ימים וניתוח שעתוק גנים ב - Caenorhabditis elegans
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.