מאמר שיטה

שיטת סינון פשוטה לבידוד בועיות חוץ-תאיות קטנות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים

DOI:

10.3791/64106

⸱

23 ביוני 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia Medical Centre, 2My CytoHealth Sdn. Bhd., 3School of Biosciences, Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University, 4School of Pharmacy, Monash University Malaysia, 5Haematology Unit, Cancer Research Centre, Institute for Medical Research (IMR), National Institutes of Health (NIH), Ministry of Health Malaysia, 6School of Pharmacy, Faculty of Health & Medical Sciences, Taylor's University, 7Centre for Drug Discovery and Molecular Pharmacology (CDDMP), Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בחבל הטבור האנושי (hUC-MSC-sEVs) באמצעות הגדרה פשוטה בקנה מידה של מעבדה. התפלגות הגודל, ריכוז החלבונים, סמני sEVs והמורפולוגיה של hUC-MSC-sEV מבודדים מאופיינים בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, בדיקת חלבון BCA, כתם מערבי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, בהתאמה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התהליך מבוסס האולטרה-צנטריפוגה נחשב לשיטה הנפוצה לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs). עם זאת, התשואה משיטת בידוד זו נמוכה יחסית, ושיטות אלה אינן יעילות בהפרדת תת-סוגים של sEV. מחקר זה מדגים שיטת סינון פשוטה לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מסוג MSC (hUC-MSC-sEVs) שמקורן בחבל הטבור האנושי, המופרדות בהצלחה על-ידי אולטרה-סינון מהמדיום המותנה של hUC-MSCs. התפלגות הגודל, ריכוז החלבונים, הסמנים האקזוזומליים (CD9, CD81, TSG101) והמורפולוגיה של hUC-MSC-sEV המבודדים אופיינו בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, בדיקת חלבון BCA, כתם מערבי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, בהתאמה. גודלם של ה-hUC-MSC-sEV המבודדים היה 30-200 ננומטר, עם ריכוז חלקיקים של 7.75 ×-10 10 חלקיקים/מ"ל וריכוז חלבון של80 מק"ג/מ"ל. נצפו פסים חיוביים לסמנים אקסוזומליים CD9, CD81 ו-TSG101. מחקר זה הראה כי hUC-MSC-sEV בודדו בהצלחה מתווך מותנה hUC-MSCs, ואפיון הראה כי המוצר המבודד עמד בקריטריונים שהוזכרו על ידי מידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות 2018 (MISEV 2018).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על פי MISEV 2018, sEVs הם חלקיקים דו-שכבתיים ליפידים שאינם משכפלים ללא גרעין פונקציונלי, בגודל של 30-200 ננומטר1. sEV שמקורם ב-MSC מכיל מולקולות איתות חשובות הממלאות תפקידים חשובים בהתחדשות רקמות, כגון מיקרו-רנ"א, ציטוקינים או חלבונים. הם הפכו יותר ויותר ל"נקודה חמה" מחקרית ברפואה רגנרטיבית ובטיפול ללא תאים. מחקרים רבים הראו כי sEV שמקורו ב-MSC יעיל כמו MSC בטיפול במצבים שונים, כגון אימונומודולציה 2,3,4,5, שיפור אוסטאוגנזה 6, סוכרת7,8 או התחדשות כלי דם 9,10. עם התקדמות ניסויי השלב המוקדם, הודגשו שלוש סוגיות מפתח עיקריות ביחס לתרגום הקליני של MSCs-EVs: תפוקת כלי הרכב החשמליים, טוהר כלי הרכב החשמליים (נקיים מפסולת תאים ומזהמים ביולוגיים אחרים כגון חלבון וציטוקינים), ושלמות הממברנה הדו-שכבתית הפוספוליפידית של כלי הרכב החשמליים לאחר בידוד.

שיטות שונות פותחו כדי לבודד sEVs, תוך ניצול הצפיפות, הצורה, הגודל וחלבון פני השטח של sEVs11. שתי השיטות הנפוצות ביותר בבידודים של כלי רכב חשמליים הן טכניקות מבוססות אולטרה-צנטריפוגה ואולטרה-סינון.

שיטות מבוססות אולטרה-צנטריפוגה נחשבות לשיטות תקן זהב בבידוד כלי רכב חשמליים. שני סוגים של טכניקות אולטרה-צנטריפוגות המשמשות בדרך כלל הן אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית ואולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. עם זאת, שיטות אולטרה-צנטריפוגות גורמות לעתים קרובות לתפוקה נמוכה ודורשות ציוד יקר עבור אולטרה-צנטריפוגות במהירות גבוהה (100,000-200,000 × גרם)11. יתר על כן, טכניקות אולטרה-צנטריפוגה לבדן אינן יעילות בהפרדת תת-סוגים של כלי רכב חשמליים (sEV ורכבים חשמליים גדולים), וכתוצאה מכך נוצרת שכבת משקעים לא טהורה11. לבסוף, אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות עשויה גם היא לגזול זמן רב ולדרוש צעדי זהירות נוספים כגון תוספת חיץ סוכרוז כדי לעכב את נזקי השיפוע במהלך שלבי האצה והאטה12. לפיכך, אולטרה-צנטריפוגה מובילה בדרך כלל לתנובה נמוכה יחסית ואינה מסוגלת להפלות בין אוכלוסיות שונות של כלי רכב חשמליים13, מה שמגביל את יישומה להכנת רכב חשמלי בקנה מידה גדול11.

השיטה השנייה לבידוד רכב חשמלי היא באמצעות אולטרה-פילטרציה, המבוססת על סינון גודל. אולטרה-סינון הוא חסכוני יחסית בזמן ובהשוואה לאולטרה-צנטריפוגה, מכיוון שהוא אינו כרוך בציוד יקר או בזמני עיבוד ארוכים14. לפיכך, אולטרה-סינון נראה כטכניקת בידוד יעילה יותר משתי שיטות האולטרה-צנטריפוגה שהוזכרו לעיל. המוצרים המבודדים יכולים להיות ספציפיים יותר בהתבסס על גודל הנקבוביות ותפוקה גבוהה יותר15. עם זאת, הכוח הנוסף המופעל בתהליך הסינון עלול לגרום לעיוות או התפרצות של כלי הרכב החשמליים16.

המאמר הנוכחי הציע פרוטוקול benchtop חסכוני וזמן לבידוד sEV הנגזרים מ- MSC לצורך ניתוח במורד הזרם ולמטרות טיפוליות. השיטה המתוארת במאמר זה שילבה שיטת סינון פשוטה עם צנטריפוגה עליונה כדי לבודד כלי רכב חשמליים בעלי תפוקה גבוהה ובאיכות טובה מ- hUC-MSCs לצורך ניתוח במורד הזרם, כולל ניתוח גודל חלקיקים, בדיקת סמנים ביולוגיים והדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות כל החומרים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. תאי גזע מזנכימליים של חבל הטבור האנושי ותרבית

  1. תרבית את hUC-MSCs בצפיפות זריעה של 5 × 103/cm2 ב- DMEM, בתוספת 8% טסיות דם אנושיות ו- 1% Pen-Strep. לדגור על התאים ב 37 ° C ב 5% CO2. החלף את מדיום תרבית התאים כל 3 ימים כדי להבטיח צמיחה תקינה של תאים.
  2. הרחיבו את התאים למעבר 5 בצלוחיות T175 לבידוד sEV.
    הערה: יש צורך בצלוחיות רבות כדי לקצור יבול גבוה של sEV (היבול עולה עם מספר התאים).

2. בידוד שלפוחית חוץ-תאית קטנה מ-hUC - MSCs

  1. החלף את מדיום התרבית ב- DMEM טרי ללא פנול אדום בתוספת 1% Pen-Strep [מדיום מותנה (CM)] כאשר התרבית מגיעה למפגש של 70%-80% במעבר 5.
    אזהרה: יש להשתמש במדיה בסיסית בלבד; הימנע FBS ותוסף טסיות דם אנושיות כדי למנוע זיהום על ידי sEV חיצוניים.
  2. לאחר 24 שעות, צנטריפוגה CM ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להסיר פסולת התא. אספו וסננו את הסופרנאטנט דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים הגדולים מ-220 ננומטר.
  3. מלא את יחידת המסנן הצנטריפוגלי ב- 30 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) המסונן דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. צנטריפוגה את יחידת המסנן הצנטריפוגלי ב 3,500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  4. מלאו את ה-CM המסונן ביחידת הסינון הצנטריפוגלית (הנפח המרבי של כל יחידה הוא 70 מ"ל). צנטריפוגה CM ב 3,500 × גרם ב 4 ° C.
    הערה: יש לעקוב אחר משך הצנטריפוגה מעת לעת עד שהפתרון מגיע לפני השטח של המסנן.
  5. יש להשליך את התמיסה לכוס תמיסת התסנין. צנטריפוגה הפוכה את מסנן הדגימה עם איסוף תרכיז ב 1,000 x גרם ב 4 ° C למשך 2 דקות.
  6. מעבירים את ה-CM המרוכז בחזרה ליחידת המסנן הצנטריפוגלי. הוסף 30 מ"ל של PBS מסונן ליחידת המסנן הצנטריפוגלי וצנטריפוגה את היחידה ב 3,500 × גרם ב 4 ° C.
  7. יש להשליך את התמיסה לכוס תמיסת התסנין. התקינו איסוף מרוכזת על יחידת המסנן וצנטריפוגה הפוכה ב-1,000 × גרם למשך 2 דקות ב-4°C כדי לקבל את ה-sEV המטוהרים.
  8. סנן את כלי הרכב החשמליים דרך מסנן מזרקים בגודל 0.22 מיקרומטר.
  9. העבר את הדגימות לצינורות חדשים ואחסן אותן ב -80 ° C לניתוח נוסף.

3. אפיון hUC-MSC-sEVs

  1. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים
    1. דללו את hUC-MSC-sEV המבודדים ב-PBS מסונן ל-20-100 חלקיקים/מסגרת.
    2. הכניסו 1 מ"ל של הדגימה המדוללת לתא נת"ע באמצעות מזרקים חד פעמיים של 1 מ"ל.
    3. קבעו את הגדרות המדידה בהתאם: התאימו את רמת המצלמה לרמה 14, קבעו את סף הגילוי כך שיכלול כמה שיותר חלקיקים עם הגבלה שסופרים 10-100 צלבים אדומים , וספירת הצלב הכחול מוגבלת לחמישה.
    4. עבור כל מדידה, הקליטו חמישה סרטונים בני דקה ונתחו אותם באמצעות תוכנת NanoSight עם סף זיהוי של חמישה.
    5. בצע מדידות בשלשה עבור כל דגימה.
  2. ניתוח כתמים מערביים
    1. Lyse, hUC-MSC-sEVs עם בדיקת משקעים רדיואימונוגרפיים קרים כקרח (RIPA) lysis buffer, לדגור במשך 30 דקות ב 4 °C, ו צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאסוף את supernatant.
    2. כמת את החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון של חומצה ביצינכונינית (BCA). הרכיבו את אלקטרופורזה הג'ל בהתאם ובצעו אלקטרופורזה בג'ל במתח של 90 וולט עד שהחלבון מגיע לקצה ג'ל הערימה. שנה את המתח ל 200 V כדי להפריד את החלבונים עד סוף ג'ל הפתרון.
    3. בצע העברה חצי יבשה כדי להעביר את החלבונים מהג'ל לקרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) ב 15 V למשך 1 שעות.
    4. חסום את קרום PVDF עם 3% אלבומין בסרום בקר (BSA)/Tris-buffered מלוחים-0.1% v/v Tween 20 (TBS-T) למשך שעה אחת על שייקר בטמפרטורת החדר. יש לדגור על קרום PVDF עם נוגדנים ראשוניים באופן הבא: נוגדן חד-שבטי נגד CD 9 של עכבר (1:500), נוגדן חד-שבטי נגד CD 81 של עכבר (1:500), נוגדן חד-שבטי של עכבר נגד GRP 94 נגד TSG 101 נוגדן חד-שבטי (1:500) ב-4°C למשך הלילה עם טלטול מתמיד.
    5. למחרת, שטפו את קרום PVDF 5 x 5 דקות עם TBS-T והמשיכו לדגור עם נוגדן משני: עכבר מצומד חזרת חלבון קושר מסוג IgG kappa (m-IgGκ BP-HRP) (1:5,000) למשך שעה אחת עם תסיסה בטמפרטורת החדר.
    6. שוב, שטפו את קרום PVDF עם TBS-T חמש פעמים, ודמיינו את הממברנה במצלמת CCD (charge-coupled imager) באמצעות מגיב זיהוי כימילומינסנציה. נתח את רמת הביטוי של החלבונים באמצעות תוכנת ImageJ. ראשית, פתח את קובץ התמונה ב- ImageJ (קובץ | פתוח...). שפר את איכות התמונה על-ידי התאמת הבהירות והניגודיות (תמונה | התאמה | בהירות/ניגודיות). התאם את התמונה עד שהכתמים נראים בבירור, לחץ על כפתור החל ולאחר מכן שמור את התמונות בפורמט TIFF (קובץ | שמירה בשם | טיף...).
  3. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת
    1. דללו חלק אחד של דגימת hUC-MSC-sEV בארבעה חלקים של PBS מסונן לנפח כולל של 10 μL ודגרו על רשת נחושת מצופה פחמן למשך 15 דקות.
    2. יש להסיר את עודפי הדגימה באמצעות מגבון מעבדה ולאפשר לה להתייבש באוויר למשך 3 דקות.
    3. יש לדגור על 10 μL של תמיסת 1% חומצה פוספוטונגסטית (PTA) כדי להכתים את הדגימה למשך 3 דקות.
    4. יש להסיר את עודפי תמיסת ה-PTA 1% באמצעות מגבון מעבדה ולאפשר לה להתייבש באוויר למשך 3 דקות.
    5. השתמש בדגימה להדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.
      הערה: עיין באיור 1 לקבלת שלבי הניסוי הסכמטיים המסוכמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 2 מראה של-hUC-MSC-sEV יש מצב גודל חלקיקים של 53 ננומטר, בעוד ששיאים משמעותיים אחרים של גודל חלקיקים היו 96 ו-115 ננומטר. ריכוז hUC-MSC-sEV שנמדד על ידי נת"ע היה 7.75 ×10 10 חלקיקים למ"ל. ריכוז החלבונים של hUC-MSC-sEV שנמדד בבדיקת BCA היה כ-80 מיקרוגרם/מ"ל.

בניתוח כתמים מערביים, hUC-MSC-sEV הדגימו פסים חיוביים עבור סמנים אקסוזומליים CD9, CD81 ו-TSG101, אך היו שליליים עבור GRP94 (איור 3). GRP94 הוא סמן רשתית אנדופלסמי המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלי רכב חשמליים הם אחת מתת-הקבוצות החשובות של ההפרשה ב-MSCs הממלאים תפקיד מכריע במהלך תהליכים נורמליים ופתולוגיים. עם זאת, sEVs, עם טווח גודל בין 30 ל -200 ננומטר, עלו ככלי פוטנציאלי לטיפול ללא תאים בעשור האחרון. טכניקות שונות פותחו כדי לבודד sEV מ MSCs. עם זאת, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, אולטרה-סינון, משקעים מבוססי פולימרים, לכידת זיקה חיסונית ומשקעים מבוססי מיקרופלואידיקה הם בעלי יתרונות וחסרונות שונים17. אף אחת מטכניקות בידוד אלה אינה יכולה להשיג שיעור החלמה גבוה וספציפיות. לפיכך, על החוקרים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרסום סרטון זה נתמך על ידי My CytoHealth Sdn. Bhd.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
40% אקרילאמידNacalai Tesque06121-95כתם מערבי
95% אתנולNacalai Tesque14710-25חומרי חיטוי
מתנול מוחלטChemiz45081להפעלת קרום PVDF (כתם מערבי)
AccutaseSTEMCELL Technologies7920אנזים דיסוציאציה תאים
אמוניום פרסולפטChemiz14475לזרז את פילמור הג'ל (אלקטרופורזה ג'ל
אנטי-CD 81 (B-11)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-166029נוגדן לסמן sEVs
נגד TSG 101 (C-2)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-7964נוגדן לסמן sEVs
אלבומין סרום בקרנקלאי טסק00653-31PVDF ממברנה חוסמת
ברומופנול כחולנקלאי טסק05808-61סמן צבע אלקטרופורטי
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)MilliporeUFC710008sEVs בידוד
ChemiLumi One LNacalai Tesque7880מגיב זיהוי כימילומינסנציה
CryoStor הקפאת מדיהSigma-AldrichC3124-100MLCell cryopreserve
Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוניNacalai Tesque08458-45מדיה לתרבית תאים
ExcelBand סמן חלבון משופר 3 צבעיםSMOBIOPM2610סמני משקל מולקולרי של חלבון
נייר ספוג עבה במיוחדATTObuffer reservior (כתם מערבי)
גליצרולMerckG5516כימיקלים לכתם מערבי
גליציןבסיס1BIO-2085-500 גרםכימיקלים לחוצץ (Western Blot)
עכבר מצומד חזרת פרוקסידאז חלבון קושר IgG kappa (m-IgGκ BP-HRP)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-516102נוגדן משני (כתם מערבי)
וורטון אנושי' s תאי גזע מזנכימליים שמקורם בג'לי (MSCs)המרכז להנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, הפקולטה לרפואה, האוניברסיטה הלאומית של מלזיה
נוגדנים לעכברים אנטי-CD 9 (C-4)סנטה קרוז ביוטכנולוגיה  sc-13118נוגדן לסמן sEVs
Nanosight NS300 מצויד במצלמת CMOS, עדשת אובייקטיבית 20 פעמים, מודול לייזר כחול (488  nm), ותוכנת NTA v3.2Malvern Panalytical, בריטניה
paraformaldehydeNacalai Tesque02890-45קיבוע לדוגמא במהלך TEM
penicillin– סטרפטומיציןנקלאי טסק26253-84אנטיביוטיקה למדיה
פנילמתיל-סולפוניל פלואורידנקלאי טסק27327-81מעכב פרוטאזות בדגימות ה-sEVs לאחר הוספת חוצץ ליזה
תמיסת מלח חוצצת פוספטGibco10010023כביסה, דילול דגימה
ממברנת פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) עם
0.45 מ"מ גודל נקבוביות		ATTOכדי להחזיק חלבון במהלך העברת חלבון (כתם מערבי)
קוקטייל מעכב פרוטאזNacalai Tesque25955-11מעכב פרוטאזות בדגימות ה-sEVs לאחר הוספת מאגר ליזה
ערכת בדיקת חלבון BicinchoninateNacalai Tesque06385-00מדגם למדידת חלבון
עם 2-MENacalai Tesque30566-22חומר מפחית לנתרן כתם מערבי
כלורידNacalai Tesque15266-64כימיקלים לכתם המערבי
נתרן דודציל סולפטNacalai Tesque31606-62פעילי שטח יוניים במהלך אלקטרופורזה של ג'ל
Tecnai G2 F20 S-TWIN מיקרוסקופ אלקטרונים שידורFEI, ארה"ב
טטרמתילאתילנדיאמיןNacalai Tesque33401-72כימיקלים להכנת ג'ל
tris-baseבסיס ראשוןBIO-1400-500 גרםכימיקלים למאגר (כתם מערבי)
  Tween 20GeneTexGTX30962כימיקלים לכתם מערבי
UVP (Ultra Vision Product) מצלמתCCD לזיהוי אותות כתם מערבי
תמיסת חיץ

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239(2017).
  3. Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
  4. Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
  5. Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
  6. Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
  7. Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741(2021).
  8. Jayabalan, N., et al. Frontiers in Endocrinology. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).
  9. Wei, Y., et al. Biomaterials. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).
  10. Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
  11. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  12. Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  13. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  14. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).
  15. Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  16. Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
  17. Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).
  18. Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BCAWestern Blot

מאמרים קשורים