מאמר שיטה

בידוד, אפיון ויישום טיפולי של שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים בתרבית

DOI:

10.3791/64135

⸱

23 בספטמבר 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Science, Northwest University, 2State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, Fourth Military Medical University, 3Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 4School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, 5Department of Orthodontics, School of Stomatology, Fourth Military Medical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הצנטריפוגה הדיפרנציאלית לבידוד ואפיון כלי רכב חשמליים מייצגים (אקסוזומים ומיקרובוסיקלים) מתאי MSC אנושיים מתורבתים. יישומים נוספים של כלי רכב חשמליים אלה מוסברים גם במאמר זה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן ננו-חלקיקי קרום הטרוגניים המשוחררים על ידי רוב סוגי התאים, והם מוכרים יותר ויותר כרגולטורים פיזיולוגיים של הומאוסטזיס אורגניזם ואינדיקטורים חשובים לפתולוגיות; בינתיים, הפוטנציאל העצום שלהם לבסס טיפולים נגישים וניתנים לשליטה במחלות הולך וגדל. תאי גזע מזנכימליים (MSCs) יכולים לשחרר כמויות גדולות של כלי רכב חשמליים בתרבית, אשר הראו הבטחה להתניע התחדשות רקמות יעילה ולהקל על יישומים טיפוליים נרחבים עם מדרגיות טובה ויכולת שחזור. קיים ביקוש גובר לפרוטוקולים פשוטים ויעילים לאיסוף ויישום MSC-EVs. כאן, פרוטוקול מפורט מסופק המבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד ולאפיין כלי רכב חשמליים מייצגים מתאי MSC אנושיים מתורבתים, אקסוזומים ומיקרו-שלפוחיות ליישומים נוספים. יכולת ההסתגלות של שיטה זו מוצגת עבור סדרה של גישות במורד הזרם, כגון תיוג, השתלה מקומית והזרקה מערכתית. יישום נוהל זה ייתן מענה לצורך באיסוף ויישום פשוט ואמין של MSC-EVs במחקר תרגומי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע הם תאים פלוריפוטנטיים בלתי ממוינים בעלי יכולת התחדשות עצמית ופוטנציאל תרגום1. תאי גזע מזנכימליים (MSCs) מבודדים, מתורבתים, מורחבים ומטוהרים בקלות במעבדה, מה שנשאר אופייני לתאי גזע לאחר מעברים מרובים. בשנים האחרונות, עדויות הולכות וגדלות תומכות בדעה כי MSCs לפעול במצב paracrine בשימוש טיפולי 2,3. במיוחד הפרשת שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) ממלאת תפקיד מכריע בתיווך הפונקציות הביולוגיות של MSCs. כננו-חלקיקים קרומיים הטרוגניים המשתחררים מרוב סוגי התאים, כלי רכב חשמליים מורכבים מתת-קטגוריות הנקראות אקסוזומים (Exos), מיקרו-שלפוחיות (MVs), וגופים אפופטוטיים גדולים עוד יותר 4,5. ביניהם, Exos הוא EV הנחקר ביותר עם גודל של 40-150 ננומטר, שהוא ממוצא אנדוזומלי מופרש באופן פעיל בתנאים פיזיולוגיים. MVs נוצרים על ידי שפיכה ישירות מפני השטח של קרום פלזמה התא בקוטר של 100-1,000 ננומטר, אשר מאופיינים ביטוי גבוה של פוספטידיל סרין ביטוי של סמנים פני השטח של תאים תורמים6. כלי רכב חשמליים מכילים רנ"א, חלבונים ומולקולות ביו-אקטיביות אחרות, שיש להן תפקידים דומים לתאי האב וממלאות תפקיד משמעותי בתקשורת התא, בתגובה החיסונית ובתיקון נזק לרקמות7. MSC-EVs נחקרו באופן נרחב ככלי טיפולי רב עוצמה ללא תאים ברפואה רגנרטיבית8.

בידוד וטיהור של כלי רכב חשמליים שמקורם ב-MSC הוא נושא נפוץ בתחום המחקר והיישום. כיום, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית וצפיפות שיפוע9, תהליך אולטרה-סינון 10, הפרדה אימונומגנטית 11, כרומטוגרף הדרה מולקולרית12 ושבב מיקרופלואידי13 הן שיטות בשימוש נרחב בבידוד וטיהור של כלי רכב חשמליים. עם היתרונות והחסרונות של כל גישה, לא ניתן לספק את הכמות, הטוהר והפעילות של כלי רכב חשמליים שנאספו בו זמנית14,15. במחקר הנוכחי מוצג בפירוט פרוטוקול הצנטריפוגה הדיפרנציאלית של בידוד ואפיון של כלי רכב חשמליים מתאי MSC מתורבתים, אשר תמך בשימוש טיפולי יעיל 16,17,18,19,20. יכולת ההסתגלות של שיטה זו לסדרה של גישות במורד הזרם, כגון תיוג פלואורסצנטי, השתלה מקומית והזרקה מערכתית, הוכחה עוד יותר. יישום נוהל זה ייתן מענה לצורך באיסוף ויישום פשוט ואמין של MSC-EV במחקר תרגומי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית הרביעית ובוצעו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. נעשה שימוש בעכברי C57Bl/6 בני שמונה שבועות (ללא העדפה לנקבות או לזכרים). MSCs שמקורם בחבל הטבור האנושי (UCMSCs), ששימשו למחקר הנוכחי, התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). השימוש בתאים אנושיים אושר על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הצבאית הרביעית לרפואה.

1. תרבית של תאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs)

  1. הכינו את האביזרים והתמיסות הדרושים לעבודה הניסיונית, כולל פיפטה, קצוות פיפטה, צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ, ציוד תרמוסטטי (אמבט מים), כפפות גומי, 75% אלכוהול, מדיום תרבית (מודגר ב-37°C), סרום בקר קטלני (FBS) ותמיסת 100x פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) (ראו טבלת חומרים).
  2. הכן את תקן אלפא-מינימום חיוני בינוני (α-MEM) הזמין מסחרית על-ידי תוספת של 20% FBS ו-1% P/S.
    הערה: יש לדלל את כל הפתרונות המשמשים לבידוד וניתוח של כלי רכב חשמליים במים מסוננים טהורים במיוחד המיוצרים על ידי מערכת טיהור המים המסוננים האולטרה-טהורה (ראה טבלת חומרים).
  3. שחזר את MSCs שמקורם בחבל הטבור האנושי (UCMSCs) מהחנקן הנוזלי על ידי המסתם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
  4. העבר במהירות ובעדינות את תרחיף התא המומס לתוך צינור 15 מ"ל עם 5 מ"ל של מדיום תרבית (שלב 1.2). צנטריפוגה ב 4 ° C, 500 x גרם במשך 5 דקות.
  5. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה סטרילית ושומרים על משקע התא. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבית לתוך צינור הצנטריפוגה ובעדינות להשהות מחדש את התאים.
  6. זרעו את התאים בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ, והוסיפו 8 מ"ל מדיום תרבית לסך כולל של 10 מ"ל.
  7. תרבית MSCs ב 37 ° C ב 5% CO2 באינקובטור התא.

2. צנטריפוגה דיפרנציאלית לבידוד Exos ו-MV

  1. כאשר MSCs גדלים למפגש של >90%, החלף את מדיום התרבית ב- α-MEM בתוספת FBS מדולדל EV ו- 1% P/S עבור 8 מ"ל מכל מנה.
    הערה: FBS צנטריפוגה ב 4 ° C, 1,50,000 x גרם לילה כדי להסיר EV וזיהומים אחרים.
  2. לאחר 48 שעות של תרבית, לאסוף את מדיום התרבות (שלב 2.1) לתוך צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל.
  3. צנטריפוגה את מדיום תרבית MSC ב 4 ° C, 800 x גרם במשך 10 דקות.
  4. הסר את שברי התא ואת פסולת התא על ידי העברת supernatant לנקות צינורות חרוטי 1.5 מ"ל.
    הערה: שימוש בצינורות חרוטיים של 1.5 מ"ל נחוץ כדי להגדיל את תפוקת הרכב החשמלי.
  5. צנטריפוגה את supernatant ב 4 ° C, 16,000 x גרם במשך 30 דקות. הגלולה היא MVs. MVs מכל צלחת של תאים הושעו מחדש עם 50 μL של PBS.
  6. העבר את הסופרנאטנט המתקבל על ידי צנטריפוגה בשלב 2.5 על ידי פיפטה לניקוי צינורות אולטרה-צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 1,50,000 x גרם במשך 2 שעות ב 4 ° C.
  7. השליכו את הסופרנאטנט ואספו את השאריות, שהן אקסוס. Resuspend Exos משבע מנות של תאים ב 50 μL של PBS.
    הערה: UCMSCs בעלי המעבר השישי משמשים לבידוד EV. כדי לקבל מספיק MVs ו Exos לשימוש ניסיוני, 7-8 מנות של תאים בתרבית נדרשים בדרך כלל. דגימות EV משמשות באופן מיידי לשלבי האפיון הבאים או ליישום טיפולי, שעדיף לא לאחסן.
    זהירות: הימנעו מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות של כלי רכב חשמליים, ועדיף לאחסן רכבים חשמליים בטמפרטורה של 4°C בטווח הקצר ולא בטמפרטורה של -80°C.

3. איתור מספרי חלקיקים והתפלגות גודל של כלי רכב חשמליים מ-MSC

הערה: לצורך הערכת התפלגות גודל, ניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA) מבוצע על ידי מנתח מעקב אחר ננו-חלקיקים הזמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).

  1. יש לדלל 1 μL של כלי רכב חשמליים (משלב 2.5 ושלב 2.7) ב-1,499 μL של PBS ולערבב מספיק בצינור של 15 מ"ל.
  2. הפעל את מנתח המעקב בהתאם להוראות היצרן. ראשית, הפעל את התוכנה התואמת (ראה טבלת חומרים).
  3. מלא את תא הדגימה במים מזוקקים, ולאחר מכן אפשר למכשיר להתחיל את בדיקת התא.
  4. כייל את המכשיר עם פתרון סטנדרטי מוכן. ודא שמספר החלקיקים המוצג בממשק זיהוי התוכנה הוא בין 50-400 (רצוי בסביבות 200). לחץ על אישור.
    הערה: הכן את התמיסה הסטנדרטית על-ידי בנייה מחדש של 1 מיקרוליטר של תמיסת כיול (ראה טבלת חומרים) ב-1 מ"ל מים מזוקקים כדי ליצור תמיסה ראשונית, ולאחר מכן קח 100 מיקרוליטר של התמיסה הראשונית והוסף 25 מ"ל מים מזוקקים להכנת תמיסה סטנדרטית (1:250,000). אחסן מגיב עובד זה ב 4 °C במשך שבוע.
  5. לשטוף את תא הדגימה עם 5 מ"ל של מים מזוקקים.
  6. לפני ניתוח הדגימה, לשטוף את התעלה עם 1 מ"ל של מים מזוקקים. ודא שמספר החלקיקים המוצג בממשק זיהוי התוכנה קטן מ- 10.
  7. הזריקו 1 מ"ל של דגימת EV שהוכנה בשלב 3.1. בצע בדיקת שלפוחית בהתאם להוראות ההפעלה של המכשיר.
    זהירות: הדגימה והמים המזוקקים מוזרקים עם מזרק 1 מ"ל במהירות קבועה של 0.5 מ"ל/שנייה תחת בקרה ידנית קפדנית.

4. אפיון מורפולוגיית EV במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)

  1. לדלל 1 μL של כלי רכב חשמליים משלב 2.7 ב 199 μL של PBS ולערבב מספיק. הוסיפו 20 מיקרוליטר של טיפות מתלה EV לרשת המרובעת המצופה בפורמבר/פחמן (ראו טבלת חומרים), והשאירו אותה למשך 3 דקות.
  2. הסר את עודפי הנוזלים על ידי נייר סינון קטן, ותן לו להישאר במשך 15 שניות כדי לייבש מעט את פני השטח.
  3. דגימות EV מכתימות באופן שלילי עם טיפות חומצה פוספוטונגסטית 1.5% למשך 40 שניות.
  4. הסר את עודף חומצה phosphotungstic ולאפשר לו לעמוד במשך 15 s כדי לייבש מעט את פני השטח.
  5. הניחו את הדוגמה המכילה רשת מרובעת מצופה טופס/פחמן בכלי נקי מכוסה בניירות פילטר. התבונן וצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת.
    הערה: בתהליך זה, Exos נלקחים כדוגמה.

5. תיוג כלי רכב חשמליים שמקורם ב-MSC

  1. לאחר חילוץ EVs (שלב 2.5), השהה מחדש עם 250 μL של PBS בצינור חרוטי 1.5 מ"ל.
  2. השתמש עוד 1.5 מ"ל צינור חרוטי להכנת פתרון העבודה של צבע PKH26; השתמש 1 μL של מגיב תיוג PKH26 מדולל עם 250 μL של מדלל C (רכיב של ערכת תיוג EV זמין מסחרית המשמש במחקר הנוכחי, ראה טבלה של חומרים).
    הערה: הכן את פתרון העבודה מיד לפני השימוש.
    אזהרה: צבע או תיוג מוגזם של PKH26 ללא דילול מראש עלולים לגרום נזק לכלי הרכב החשמליים.
  3. ערבבו את כלי הרכב החשמליים המושהים מחדש עם פתרון העבודה. אפשר לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, ולאחר מכן הוסף 500 μL של FBS מדולדל EV כדי לעצור את התגובה.
  4. עבור MVs, צנטריפוגה ב 4 ° C, 16,000 x גרם במשך 30 דקות, ולהשליך את supernatant על ידי פיפטה. הוסף 1 מ"ל של PBS כדי לשטוף את השאריות.
  5. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C, 16,000 x גרם למשך 30 דקות, והשליכו את הסופרנאטנט כדי להסיר את הצבע הלא קשור.
  6. להשעות מחדש את השאריות עם 200 μL של PBS. זרוק 20 μL של השעיה על המגלשה והתבונן בה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    הערה: בתהליך זה, MV נלקחים כדוגמה.

6. השתלה מקומית והזרקה סיסטמית של MSC-EV

הערה: עבור ההליכים הבאים, הניחו את כלי הרכב החשמליים על קרח לפני ההזרקה.

  1. בצע השתלה מקומית לפי השלבים הבאים.
    1. מרדימים את העכברים עם איזופלורן 4% (vol/vol). יש להקפיד על הרדמה באיזופלורן של 1%-3% במהלך ההליך.
    2. לפני הניתוח, יש לתת 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן (IP) לשיכוך כאבים כדי למזער כאבים לאחר הניתוח.
    3. לפני כריתת הפצע, יש לגלח את השיער הגבי ולעקר את המשטח הגבי על ידי מריחת 3 סיבובים לסירוגין של 10% פובידון-יוד ו-75% אתנול.
    4. באמצעות ניקוב ביופסיה (ראו טבלת חומרים) נוצר פצע בעובי מלא של 1 ס"מ על העור הגבי.
    5. יש להשהות מחדש את כלי הרכב החשמליים שמקורם ב-MSC משתי צלחות ב-100 מיקרוליטר של PBS ולתת את ההזרקה בשכבה התת עורית של מיטת הפצע, סביב כל פצע עם ארבעה אתרים.
      הערה: מוזרק בממוצע 100 מיקרוגרם של כלי רכב חשמליים לעכבר (כלי רכב חשמליים משתי צלחות תאים בקוטר 10 ס"מ). עשר צלחות של 10 ס"מ של MSCs דרושות כדי להניב מספיק כלי רכב חשמליים כדי להקים ניסוי של n = 5 במודל מורין.
    6. לאחר הטיפול, עטפו את העכברים בגזה סטרילית והניחו אותם על רפידות בידוד חום (ראו טבלת חומרים) עד שיתעוררו.
    7. ודא שהעכברים לא יישארו ללא השגחה עד שהם יחזרו להכרה מספקת. אין להחזיר את העכברים לחברתם של בעלי חיים אחרים עד שיחלימו לחלוטין.
    8. מתן מנות נוספות של שיכוך כאבים ביום 2 וביום 3 לאחר הניתוח לפי הצורך.
  2. לבצע הזרקה מערכתית.
    1. השהה מחדש כלי רכב חשמליים שמקורם ב-MSC ב-200 מיקרוליטר של PBS, ולאחר מכן ערבב עם תמיסת הפרין ביחס נפח של 10:1.
    2. הכניסו את העכברים למערכת הדמיית הוורידים הקאודליים (ראו טבלת חומרים). לחץ על המתג כדי להרים את הידית.
    3. יש לחטא את וריד הזנב באמצעות כרית אלכוהול לפני הזרקת העירוי. לאחר מכן, הזריקו לעכברים באופן שיטתי מתלה שהוכן בשלב 6.2.1 דרך וריד הזנב. ההליך נעזר במאייר ורידים זנב.
      הערה: יש להזריק מתלה EV מיד לאחר ערבוב עם הפרין. בממוצע מוזרק 100 מיקרוגרם EV לעכבר (כלי רכב חשמליים משתי צלחות תאים בקוטר 10 ס"מ). עשר צלחות של 10 ס"מ של MSCs דרושות כדי להניב מספיק כלי רכב חשמליים כדי להקים ניסוי של n = 5 במודל מורין.
      זהירות: הזרקת ורידים בזנב העכבר מוגבלת בדרך כלל לנפח של 200 מיקרוליטר. הזריקה צריכה ללכת לאט ולהפסיק אם אתה רואה בליטה או התנגדות, מה שמרמז על המחט היא מחוץ לווריד. אם העכברים מראים סימנים קליניים שליליים כמו סלסול ורעד, זו יכולה להיות תגובת הלם להזרקה בנפח גבוה, הזרקה מהירה או רעילות/אנפילקסיס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MVs ו-Exos מ-UCMSCs אנושיים מתורבתים מבודדים בעקבות זרימת העבודה הניסויית (איור 1). תוצאות נת"ע מראות כי גודל Exos מ-MSCs אנושיים נע בין 40 ננומטר ל-335 ננומטר עם גודל שיא של כ-100 ננומטר, וגודל ה-MV נע בין 50 ננומטר ל-445 ננומטר עם גודל שיא של 150 ננומטר (איור 2). אפיון מורפולוגי של Exos שמקורו ב-MSC מציג צורת טיפוסית (איור 3). כלי רכב חשמליים מסומנים ביעילות על-ידי PKH26, אשר נצפה הן על-ידי התצוגה הגסה ככדוריות מסומנות והן על-ידי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלי רכב חשמליים ממלאים תפקיד חשוב בפעילויות ביולוגיות מגוונות, כולל הצגת אנטיגן, הובלת חומרים גנטיים, שינוי מיקרו-סביבה של תאים ועוד. יתר על כן, היישום הרחב שלהם מביא גישות חדשות והזדמנויות לאבחון וטיפול במחלות21. יישום יישומים טיפוליים של כלי רכב חשמליים מבוסס על בידוד ואפיון מוצלחים. עם זאת, בשל היעדר שיטות בידוד וטיהור סטנדרטיות ויעילות המיצוי הנמוכה, מחקר הרכב החשמלי נפגע. מאמר זה מציג בעיקר פרוטוקול מיצוי ואפיון קל ליישום של כלי רכב חשמליים מתאי MSC אנושיים מתורבתים ויישומים נוספים, שניתן לתי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32000974, 81930025 ו-82170988) ומהקרן הסינית למדע פוסט-דוקטורט (2019M663986 ו-BX20190380). אנו אסירי תודה על הסיוע של המרכז הלאומי להדגמת הוראה ניסויית לרפואה בסיסית (AMFU) והמעבדה המרכזית לניתוח ובדיקות של המרכז לחדשנות רפואית צבאית של האוניברסיטה הרפואית של חיל האוויר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% פובידון-יוד (בטדין)Weizhenyuan10053956954292חיטוי פצעים
תמיסת כיולParticle Metrix110-0020כיול מכשיר NTA
קרפרופןסיגמא53716-49-7תרופה משכך כאבים
צילום ורידים זנב KEW Life ScienceKW-XXYצילום ורידים זנב
צנטריפוגהEppendorf5418Rצנטריפוגה
סרום בקר קטלניCorning35-081-CVתרבית של UCMSCs
Formvar/מצופה פחמן רשת מרובעתPBL Assay Science 24916-25מיקרוסקופ אלקטרונים שידור
כרית חימוםZhongke מדעי החייםZ8G5JBMzטיפול לאחר טיפול בבעלי חיים
תמיסת הפריןתא גזע7980הזרקה מערכתית
איזופלורןRWD מדעי החייםR510-22הרדמה לבעלי חיים
מינימום חיוני בינוני אלפא בסיסי (1x)GibcoC12571500BTתרבית של מנתח
מעקב אחר ננו-חלקיקיםParticle MetrixZetaView PMX120ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים
PBS (1x)MeilunbioMA0015השעיית EVs
פניצילין/סטרפטומיציןProcell מדעי החייםPB180120תרבית של UCMSCs
חומצה פוספוטונגסטיתSolarbio12501-23-4מיקרוסקופ
PipetteEppendorf3120000224
PKH26 ערכת קישור תאים פלואורסצנטיים אדומיםSigma-AldrichMINI26תיוג EVs
ביופסיה עורית אגרוףAcuderm69038-10-50פגמי עור
תוכנה ZetaViewParticle Metrixגרסה 8.05.14 SP7 
ציוד תרמוסטטימענקv-0001-0005אמבט מים
מיקרוסקופ אלקטרונים הולכהHITACHIHT7800מיקרוסקופ אלקטרונים שידור
UCMSCsBai'ao UKK220201מסחרית UCMSCs
אולטרה-צנטריפוגהבקמןXPN-100
מערכת טיהור מים מסוננים אולטרה-טהוריםMilli-QIQ 7000הכנת מים טהורים
UCMSCs אלקטרונים הולכה במיוחד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619(2020).
  2. Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
  3. Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025(2019).
  4. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  5. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
  6. Lei, L. M., et al. Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996(2021).
  7. Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
  8. Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  9. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3 22(2006).
  10. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
  11. Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
  12. Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  13. Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).
  16. Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
  17. Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
  18. Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074(2021).
  19. Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830(2020).
  20. He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708(2019).
  21. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).
  22. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  23. Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835(2019).
  24. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109(2021).
  25. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).
  26. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533(2020).
  27. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
  28. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162(2016).
  29. Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
  30. Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
  31. Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
  32. Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274(2019).
  33. Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Mesenchymal Stem CellsExtracellular VesiclesDifferential CentrifugationMicrovesicle IsolationExosome CharacterizationNanoparticle TrackingFluorescence MicroscopyPKH26 LabelingSystemic InjectionTissue Regeneration

מאמרים קשורים