הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מידול גרורות במוח על ידי הזרקת עורק הצוואר הפנימי של תאים סרטניים

8.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64216

⸱

2 באוגוסט 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UQ Centre for Clinical Research, The University of Queensland, 2Centre for Advanced Imaging, Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology and ARC Training Centre for Innovation in Biomedical Imaging Technology, The University of Queensland, 3School of Biomedical Sciences, The University of Queensland, 4Mater Research and Mater Research Institute, The University of Queensland, 5Pathology Queensland, Royal Brisbane Women's Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

גרורות במוח הן גורם לתחלואה קשה ולתמותה בחולי סרטן. רוב המודלים של עכברי גרורות במוח מסובכים על ידי גרורות מערכתיות מבלבלות ניתוח של תמותה ותוצאות התערבות טיפולית. מוצג כאן פרוטוקול להזרקת קרוטיד פנימית של תאים סרטניים המייצר גידולים תוך גולגולתיים עקביים עם גידולים סיסטמיים מינימליים.

תקציר

גרורות במוח הן גורם לתחלואה קשה ולתמותה בחולי סרטן. היבטים קריטיים של מחלות גרורתיות, כגון המיקרו-סביבה העצבית המורכבת והאינטראקציה בין התאים הסטרומלים, אינם ניתנים לשכפול לחלוטין באמצעות מבחני מבחנה ; לפיכך, מודלים של בעלי חיים הם קריטיים לחקירה ולהבנה של ההשפעות של התערבות טיפולית. עם זאת, רוב שיטות ההשתרשות של גידולי מוח אינן מייצרות גרורות במוח באופן עקבי מבחינת מסגרת הזמן ועומס הגידול. מודלים של גרורות במוח שנוצרו על ידי הזרקה תוך-לבבית של תאים סרטניים עלולים לגרום לעומס גידול חוץ-גולגולתי לא מכוון ולהוביל לתחלואה ותמותה גרורתית. למרות שהזרקה תוך גולגולתית של תאים סרטניים יכולה להגביל את היווצרות הגידול החוץ-גולגולתי, יש לה מספר אזהרות, כגון התאים המוזרקים היוצרים לעתים קרובות מסת גידול יחידה באתר ההזרקה, מעורבות גבוהה של לפטומנינגיאל, ופגיעה בכלי הדם במוח במהלך חדירת המחטים. פרוטוקול זה מתאר מודל עכברי של גרורות במוח הנוצרות על ידי הזרקת עורק הצוואר הפנימי. שיטה זו מייצרת גידולים תוך גולגולתיים באופן עקבי ללא מעורבות של איברים אחרים, ומאפשרת הערכה של גורמים טיפוליים לגרורות במוח.

מבוא

גרורות במוח הן ממאירות שכיחה הקשורה לפרוגנוזה גרועה מאוד 1,2. הטיפול הסטנדרטי בחולי גרורות במוח הוא רב-מודאלי, המורכב מנוירוכירורגיה, הקרנות מוח שלמות ו/או רדיוכירורגיה סטריאוטקטית, בהתאם למצב הבריאותי הכללי של החולים, נטל המחלה החוץ-גולגולתית ומספר ומיקום הגידולים במוח 3,4. חולים עם עד שלושה נגעים תוך גולגולתיים זכאים לכריתה כירורגית או רדיוכירורגיה סטריאוטקטית, בעוד שטיפול בהקרנות למוח שלם מומלץ לחולים עם נגעים מרובים כדי למנוע את הסיכון לזיהום הקשור לניתוח ובצקת5. עם זאת, הקרנות מוח שלמות יכולות לגרום נזק למבנים מוחיים רגישים, מה שתורם לאיכות חיים ירודה6.

טיפול סיסטמי הוא גישה אלטרנטיבית והגיונית לא פולשנית לטיפול בחולים עם נגעים מרובים7. עם זאת, זה פחות נחשב בשל הרעיון ארוך השנים כי טיפולים סיסטמיים יש יעילות ירודה כי משלוח פסיבי של תרופות ציטוטוקסיות דרך זרם הדם לא יכול להשיג רמות טיפוליות במוח ללא הסיכון של רעילות לא בטוחה8. פרדיגמה זו מתחילה להשתנות עם הטיפול המערכתי שאושר לאחרונה על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) (tucatinib עם trastuzumab ו- capecitabine המצוין עבור גרורות גרורתיות HER2+ סרטן השד)9,10,11,12 והעדכון בהנחיות הטיפול כך שיכלול התייחסות לאפשרויות טיפול סיסטמיות לחולות גרורות במוח13,14.

בהקשר זה, התפתחויות בתחום הטיפול הממוקד המולקולרי, האימונותרפיה ומערכות אספקת תרופות חלופיות, כגון נשא ננו-תרופה ממוקד, יכולות להתגבר על האתגרים של טיפול בגרורות במוח15,16,17,18. בנוסף, גישות כימיות ומכניות לשיפור אספקת תרופות באמצעות חלחול של מחסום גידול המוח נחקרות גםהן 19,20. כדי לחקור ולמטב גישות כאלה כך שיתאימו למטרה, חיוני להשתמש במודלים פרה-קליניים שלא רק משקפים את הפיזיולוגיה המורכבת של גרורות במוח, אלא גם מאפשרים ניתוח אובייקטיבי של תגובת תרופות תוך גולגולתית.

באופן כללי, הגישות הנוכחיות למודל גרורות במוח in vivo כוללות הזרקה תוך-לבבית (חדר שמאלי), תוך-ורידי (בדרך כלל וריד זנב), תוך-גולגולתי או תוך-גולגולתי (עורק צוואר משותף) של תאים סרטניים בעכברים 21,22,23,24,25,26,27 . מלבד אסטרטגיות השתלת גידולים, מודלים של עכברים מהונדסים גנטית שבהם היווצרות הגידול מופעלת על ידי הסרת גנים מדכאי גידול או הפעלה של אונקוגנים שימושיים למידול גידולים. עם זאת, דווח כי רק כמה מודלים של עכברים מהונדסים גנטית מייצרים גידולים משניים ועוד פחות מכך מייצרים גרורות מוחיותבאופן אמין 28,29,30.

שיטות חריטה כגון הזרקה תוך לבבית (חדר שמאלי) והזרקה תוך ורידית (בדרך כלל וריד זנב) מחקות את ההפצה המערכתית של סרטן. מודלים אלה מייצרים בדרך כלל נגעים באיברים מרובים (למשל, מוח, ריאות, כבד, כליות, טחול) בהתאם למצע הנימי שלוכד את רוב תאי הגידול במהלך 'המעבר הראשון' שלהם במחזור הדם31. עם זאת, שיעורים לא עקביים של השתלת מוח ידרשו יותר בעלי חיים כדי להשיג את גודל המדגם עבור הכוח הסטטיסטי הרצוי. מספר תאי הגידול שבסופו של דבר מתבססים במוח באמצעות שיטות הזרקה תוך-לבביות ותוך-ורידיות אלה משתנה. לפיכך, נטל הגידול בגרורות במוח יכול להשתנות בין בעלי חיים וההבדל בהתקדמות יכול להפוך את הסטנדרטיזציה של ציר הזמן הניסויי ואת הפרשנות של התוצאות לאתגר. נטל הגידול החוץ-גולגולתי עלול להוביל לתמותה של גרורות שאינן מוחיות, מה שהופך מודלים אלה לבלתי מתאימים להערכת יעילות תוך גולגולתית. קווי תאים טרופיים במוח הוקמו באמצעות תהליכי ברירה של תאי שיח מלאכותיים כדי להפחית את ההתבססות החוץ-גולגולתית, אך שיעורי הקליטה לא היו עקביים, ותהליך הברירה הקלונלית יכול להפחית את ההטרוגניות שנמצאת בדרך כלל בגידולים אנושיים32.

שיטות השתלה ספציפיות למוח, כגון הזרקה תוך-גולגולתית ותוך-גולגולתית, מאפשרות מידול עקבי ויעיל יותר של גרורות במוח. בשיטה התוך גולגולתית33, תאים סרטניים מוזרקים בדרך כלל לקליפת המוח הקדמית, אשר מייצרת צמיחת גידול מהירה וניתנת לשחזור עם מעורבות מערכתית נמוכה. בעוד שההליך נסבל היטב עם תמותה נמוכה33, האזהרות הן שמדובר בגישה גסה יחסית המציגה במהירות בולוס (מקומי) של תאים במוח ואינה מדגימה פתוגנזה מוקדמת של גרורות במוח. המחט פוגעת בכלי הדם של רקמת המוח, מה שגורם לדלקת מקומית 5,34. מניסיון, קיימת נטייה להזרקת תאי הגידול לרפלוקס במהלך הסרת המחט, מה שמוביל למעורבות לפטומנינגיאלית. לחלופין, השיטה התוך-קרוטית מעבירה תאים לעורק הצוואר המשותף עם מיקרו-ווסקולטורה במוח כמצע הנימי הראשון שנתקלו בו, ומדגימה הישרדות במחזור הדם, בפזרנות ובקולוניזציה24. בהסכמה עםאחרים 25, הניסיון שלנו עם שיטה זו מצא כי היא יכולה לגרום לגידולים בפנים עקב העברה לא מכוונת של תאים סרטניים דרך עורק הצוואר החיצוני למיטות נימי ברקמות אלה (נתונים שלא פורסמו). ניתן למנוע גידולים בפנים על-ידי קשירת עורק הצוואר החיצוני לפני הזרקת עורק הצוואר הנפוץ (איור 1). בהמשך המאמר, שיטה זו מכונה 'הזרקת עורק הצוואר הפנימי'. מניסיון, שיטת ההזרקה של עורק הצוואר הפנימי מייצרת באופן עקבי גרורות במוח עם מעט מאוד אירועים סיסטמיים, והצליחה לייצר מודלים של גרורות במוח של סוגי סרטן ראשוניים שונים (למשל, מלנומה, סרטן השד והריאות) (איור 1). החסרונות הם שזה מאתגר מבחינה טכנית, גוזל זמן, פולשני, ודורש אופטימיזציה זהירה של מספרי תאים וציר זמן ניטור. לסיכום, הן שיטות ההזרקה התוך-גולגולתיות והן שיטות ההזרקה של עורקי הצוואר הפנימיים מייצרות מודלים של עכברים המתאימים להערכת ההשפעה הטיפולית על תועלת ההישרדות הקשורה לגידול במוח.

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ההזרקה של עורק הצוואר הפנימי כדי לייצר מודל עכברי של גרורות במוח כמעט ללא מעורבות מערכתית ולכן מתאים להערכה פרה-קלינית של הפצת תרופות ויעילות של טיפולים ניסיוניים.

דיאגרמת מודל גרורות של סרטן מוח עכבר עם הגדרת הזרקת עורק הצוואר; תוצאות היסטולוגיות.
איור 1: ייצוג סכמטי של פרוטוקול הזרקת עורק הצוואר הפנימי עבור גרורות במוח. הזרקת עורק הצוואר הפנימי עם קשירת עורק הצוואר החיצוני יכולה לייצר באופן אמין מודל גרורות במוח מסוגי סרטן ראשוניים שונים. בפרוטוקול זה, שלוש ליגטורות ממוקמות על עורק הצוואר (מבואר כ- L1-L3 באיור). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המחקרים נערכו במסגרת ההנחיות של ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת קווינסלנד (UQCCR/186/19), והקוד האוסטרלי לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות.

1. הכנת תאים סרטניים להזרקה

הערה: במחקר זה נעשה שימוש בקו התאים של סרטן השד האנושי, BT-474 (BT474). BT474 תורבית במדיום גדילה מלא הכולל מדיום RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% אינסולין. התאים נשמרו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני באטמוספירת האוויר. לאמת את קו התא על ידי טנדם לווייני חוזר על בדיקה35, לאשר את הביטוי של חלבון הכתב (למשל, לוציפראז) אם בכלל, ולבדוק זיהום מיקופלסמה.

  1. זרע BT474 תאים סרטניים בצפיפות זריעה של 2.0 x 106 תאים לתוך בקבוק T75 באמצעות 10 מ"ל של מדיית גדילה מלאה ותרבית (ב 37 °C עם 5% CO2) עד 70%-80% מפגש לפני ההזרקה.
  2. ביום ההזרקה, יש להשליך את מדיית הגדילה ולשטוף את התא מונולאייר עם מלח חצוב פוספט (PBS) פעמיים.
  3. הוסיפו 5 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תרבית תאים שחוממה מראש (ראו טבלת חומרים) ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד לניתוק התאים. לאחר 5 דקות, יש להקיש בעדינות על הבקבוקון כדי לסייע בניתוק התא.
  4. יש להוסיף 5 מ"ל של מדיית גדילה מלאה המכילה 10% סרום בקר עוברי כדי להרוות את פעילות מגיב הדיסוציאציה.
  5. החזירו את התאים בעדינות על ידי פיפטינג כדי להפחית את גושי התאים.
  6. העבר את מתלה התא לצינור של 50 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 180 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. דקנו את תמיסת העל והחזירו את כדור התא ב-10 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של Hank (HBSS) ללא סידן ומגנזיום כדי למזער את היווצרות הגושים בתאים.
  8. צנטריפוגה של מתלה התא ב 180 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. דקאנט את הסופר-נאטנט כדי להסיר ריאגנט סרום/דיסוציאציה שיורי ולהחיות את כדור התא ב-3 מ"ל של HBSS.
  10. מניחים מסננת תאים בקוטר 100 מיקרומטר על צינור חרוטי טרי של 50 מ"ל ומעבירים את מתלה התא כדי להסיר גושים של תאים.
    הערה: תרחיף של תא בודד חיוני כדי למזער את חסימת כלי הדם ואת הסיכון לשבץ בהזרקה.
  11. חשב את מספר התאים בני קיימא באמצעות הרחקת Trypan Blue והמוציטומטר בשיטות סטנדרטיות.
  12. דלל את תרחיף התא עם HBSS לריכוז תאים של 2.5 x 106 תאים למ"ל.
  13. השאירו את הצינור אופקי על קרח ונדנדו בעדינות את הצינור מעת לעת כדי למזער גושים. ניתן לאחסן את תרחיף התא על קרח למשך 6 שעות לכל היותר.
    הערה: נדנדה נעשתה באופן ידני אך ניתן לעשות זאת גם באמצעות שייקר בסל"ד נמוך.

2. הכנת העכבר להליך

הערה: במחקר זה, בני 4-5 שבועות, נעשה שימוש בנקבות עכברי NOD scid. הציגו לעכברים מזון להתאוששות מתזונה רכה (למשל, ג'ל דיאטה, הידרוג'ל, צ'או עכבר מעוך) 3 ימים לפני ההליך כדי לעודד האכלה לאחר ההליך.

  1. כלי ניתוח אוטוקלב. יש לרסס ולנגב את אזור הניתוח והציוד בחומר חיטוי משטחים, ואחריו 70% אתנול.
  2. הניחו שטיחון חום לבעלי חיים מתחת ללוח הניתוח כדי למנוע היפותרמיה. הפעל אותו 30 דקות לפני הניתוח. יש לרסס ולנגב את לוח הניתוח בחומר חיטוי משטחי ואחריו 70% אתנול.
  3. הכינו כלוב ביתי נקי לבעלי חיים וכרית חימום חמה להתאוששות.
  4. יש ללבוש ציוד מגן אישי נקי (חלוק, מסכה, רשת שיער וכפפות). שמרו על סטריליות לאורך כל ההליך על ידי שימוש בכפפות בדיקה נקיות ובטכניקה של 'טיפים למכשירים בלבד'.
  5. הרדמת העכבר עם תא הרדמה באמצעות 5% איזופלורן עם זרימת חמצן של 2 ליטר לדקה עד שהעכבר מאבד את רפלקס הדוושה.
  6. הוציאו את החיה מהתא והניחו אותה בקונוס אף המספק 2% איזופלוראן בזרימת חמצן של 2 ליטר לדקה להליך הכירורגי הנותר.
  7. עכבר אגרוף לאוזן לזיהוי והשתמש בקוצץ חשמלי כדי לגלח את הפרווה מאזור הצוואר. יש לנקות את עודפי השיער מעור חשוף באמצעות סרט הדבקה.
  8. שקול את העכבר לחישוב מינוני תרופות ההרדמה ומשככי הכאבים הנדרשים. יש לתת בופרנורפין ומלוקסיקם ב-50 מיקרוגרם/ק"ג ו-1 מ"ג/ק"ג, בהתאמה, באמצעות הזרקה תת-עורית.
  9. העבר את העכבר ללוח ניתוחים חם וחבר את חרוט האף באמצעות סרט הדבקה.
  10. יש למרוח חומר סיכה עיני על העיניים כדי למנוע התייבשות.
  11. אבטח את העכבר בעדינות על ידי חיבור השיניים החותכות העליונות באמצעות חוט המודבק ללוח הניתוח, ולאחר מכן הקשה על הרגליים הקדמיות והאחוריות. צעד זה מאריך את הגוף ושומר על הצוואר ישר במהלך ההליך.
  12. יש לבצע הכנת עור לפני הניתוח כמתואר להלן.
    1. נגבו את הצוואר בחומר חיטוי מקומי (פובידון-יוד) כדי להפחית את עומס המיקרופלורה בעור ולהסיר שיער רפוי. נקי ממרכז העור, עובד כלפי חוץ כדי למנוע זיהום מחדש של אתר החתך. חזור על התהליך באמצעות 70% אתנול. בצע שלושה סבבים מתחלפים של יוד ואתנול לחיטוי.
    2. הניחו וילון כירורגי מעל החיה. זה נחתך ומעוצב מחתיכת מגבת נייר סטרילית או שקית אוטוקלאב.
  13. הניחו מגבות נייר סטריליות או שקיות אוטוקלאב לכלי ניתוח.
  14. בדוק רפלקס באמצעות 'בדיקת צביטה' כדי להבטיח הרדמה מספקת לפני שתמשיך בהליך.

3. הזרקת קרוטיד פנימית

הערה: בניסוי זה נעשה שימוש בצינורית עירוי של 31 גרם ובהגדרת מזרקים המופעלת על ידי כף הרגל כדי להקל על הליך ההזרקה (איור משלים 1). הגדרה זו היא אופציונלית והמשתמש יכול להשתמש במזרק אינסולין 31 G ולדלג על שלבים 3.11 ו- 3.12. כדי להכין את צינורית העירוי, משכו והפרידו את חלק המחט מהחלק המתאים למזרק של מחט 31 גרם באמצעות שני זוגות מהדקי תפר. לאחר מכן, חבר את חלק המחט לקצה אחד של צינור עירוי עדין באורך של כ -10 ס"מ.

  1. מקם את מיקרוסקופ הנתיחה מעל העכבר.
  2. באמצעות מספריים, בצע חתך אנכי של 15 מ"מ לאורך קו האמצע באזור הצוואר החל מ-5 מ"מ מתחת ללסת ועד לפתח בית החזה.
  3. באמצעות שני זוגות של מלקחיים זוויתיים, יש להפריד את העור ואת בלוטות הרוק שמתחתיו, ולמרוח רטרקטורים כדי לשמור על קנה הנשימה חשוף. השלב הבא יחשוף את נדן הצוואר שנמצא במקביל לקנה הנשימה.
  4. באמצעות שני זוגות של מלקחיים בזווית עדינה, יש לנתח בבוטות את רקמת השריר והשומן הסמוכה לקנה הנשימה ולחשוף את נדן הצוואר הימני. נדן הצוואר הוא השכבה הסיבית המכסה את עורק הצוואר המשותף, הווריד והעצב התועה, וניתן לדמיין צרור זה על ידי עורק הצוואר המשותף האדום הבוהק. במחקר זה, ההזרקה בוצעה על עורק הצוואר הימני.
  5. יש לנקות מקטע של עורק הצוואר המשותף לביפורקציה הקרוטידית של החיתולית שמסביב ולהפריד אותה מהעצב התועה והוורידים.
  6. לבודד ולנקות את ביפורקציה הצוואר (הצומת המחבר בין עורקי הצוואר החיצוניים והפנימיים) מהעצבים והחיתולית שמסביב. מקמו מלקחיים עדינים מתחת לעורק הצוואר החיצוני והעבירו תפר משי (בעובי 5-0) מתחת לעורק. קשרו והדקו את התפר וחתכו את הקו העודף.
    הערה: ליגטורה זו (L1) תמנע מהזרקה לעבור דרך עורק הצוואר החיצוני.
  7. מקמו מלקחיים עדינים מתחת לעורק הצוואר המשותף והעבירו תפר משי (בעובי 5-0) מתחת לעורק. קושרים קשר ומהדקים את התפר במיקום פרוקסימלי לאתר ההזרקה המוצע. חותכים את התפר העודף ומשאירים כ-10 מ"מ של קו.
    הערה: ליגטורה שנייה זו (L2) תגביל את זרימת הדם ואת הדימום לאחר ההזרקה. הוא משמש גם כדי למקם ולהחזיק את עורק הצוואר במהלך ההזרקה.
  8. חותכים ומרטיבים רצועה של מגבים חד פעמיים (אוטומטיים) בעלי מוך נמוך (ראו טבלת חומרים) כ-10 מ"מ על 5 מ"מ. קפל את הרצועה לתוך 4 מ"מ x 5 מ"מ, 2-3 מ"מ עובי, ומניחים אותו מתחת לעורק הצוואר באתר ההזרקה המוצע. זה יתמוך בכלי במהלך ההזרקה.
  9. על עורק הצוואר המשותף rostral לאתר ההזרקה המוצע, למקם קשירה שלישית (L3) עם קשר רופף. זה מהודק רק לאחר ההזרקה (בשלב 3.16).
  10. התסיסו בעדינות את תרחיף התאים ושאבו 200 μL של תרחיף התא לתוך מזרק אינסולין (עם מחט של 31 גרם).
  11. טען את המזרק לתוך דרייבר המזרק המחובר לדוושת רגל מפעילה.
  12. חברו צינורית דקה עם מחט 31 גרם למזרק והגדילו את הקו.
  13. בדוק אם עורק הצוואר ממוקם היטב בלחץ.
  14. באמצעות שני מלקחיים זוויתיים עדינים, האחד מותח בעדינות על קצה הליגטורה הראשונה והשני אוחז במחט 31 G, מחדירים באיטיות את המחט עם השיקוע למעלה לתוך לומן של כלי הדם תוך הקפדה שלא לנקב אותה.
  15. יש להזריק באיטיות 100 μL של תרחיף התא (משלב 1.13) לעורק הצוואר המשותף במהירות של 10 μL/s. זה יספק 2.5 x 105 תאים לתוך כלי הדם. הזרקה מוצלחת היא הדמיה באמצעות ניקוי של דם מכלי הדם carotid.
  16. הרימו והדקו בעדינות את הליגטורה הרופפת (L3) (משלב 3.9) מיד לאחר משיכת המחט כדי למנוע זרימה חוזרת ודימום. לקצץ תפר עודף.
    הערה: זה נורמלי לראות כמות קטנה של דם spuring לאחר הנסיגה של המחט. עם זאת, אסור שיהיה דימום פעיל לאחר הידוק הליגטורה השלישית.
  17. הסירו את חתיכת המגבים החד-פעמיים הלחים בעלי מוך נמוך.
  18. באמצעות פיפטה P200, יש לשטוף את חלל הניתוח פעמיים עם 150-200 μL של מים סטריליים או מלוחים.
  19. בדוק שוב אם יש דימום, ולאחר מכן להסיר את retractors.
  20. מקם מחדש את הרקמות הרכות, בלוטות הרוק והעור מעל עורק הצוואר וקנה הנשימה.
  21. יש לסגור את שכבת העור של החתך באמצעות מחזיק מחט תפר, מלקחיים ותפר מונופילמנט 6/0 נספג או לא נספג בתבנית רציפה.
  22. השליכו את מזרק מחט הצינורית והכינו מערך חדש לעכבר הבא. שימוש במזרק חדש יבטיח שמספר התאים המוזרקים לכל עכבר יהיה עקבי.
    הערה: תמונות מייצגות של ההליך מופיעות באיור משלים 2. אם כלי השיט מנוקב או קרוע על ידי המחט, מסומן על ידי דליפה של הזרקה או דימום, ההליך נחשב לא מוצלח. לאחר מכן, יש למשוך את המחט, ולהדק מיד את הליגטורה השלישית כדי למנוע דימום נוסף. אם הדימום הוא מתמשך לאחר הידוק של התפר, החיה חייבת להיות מורדמת עם pentobarbital.

4. התאוששות לאחר ההזרקה

  1. יש להזריק בופרנורפין (50 מיקרוגרם/ק"ג) ומלוקסיקם (1 מ"ג/ק"ג) בהזרקה תת-עורית להקלה על כאבים לאחר ניתוח.
  2. העבירו את החיה לכלוב חם ונקי כדי להתאושש מההרדמה. זה נורמלי שבעל חיים יש פעילות מאופקת (מצטופפת ולא פעילה או מסתובבת לאט) לאחר התעוררות.
  3. לאחר 30-45 דקות, העבירו עכברים למתקן החזקה לטווח ארוך.
  4. לספק לעכברים דיאטה רכה (ג'ל דיאטה, הידרוג'ל, מחית) לפחות שבוע לאחר הניתוח ולבדוק את המצב הגופני מדי יום עם תשומת לב מיוחדת עבור סימנים של שבץ, זיהום, דימום סביב אתר הפצע.
  5. יומיים לאחר הניתוח, זה אופייני לבעל החיים יש פעילות מופחתת, פרווה קלה פרועה ואיבד 15% ממשקל הגוף לפני הניתוח. מתן משכך כאבים (meloxicam) מדי יום במשך 2-3 ימים לאחר הניתוח כדי לנהל את הכאב ולסייע להחלמה.
  6. מהיום השלישי ואילך, בעלי החיים חייבים לחזור לפעילות, להגביר את תדירות ההאכלה והטיפוח ולחזור למשקל. המתת בעלי חיים עם ליקויים מתמשכים במצב גופני (כאבים, חיבוקים, לא פעילים, ירידה במשקל) לאחר 4 ימים לאחר הניתוח על ידי הזרקת נתרן פנטוברביטל במינון 200 מ"ג/ק"ג באמצעות הזרקה תוך-צפקית.
  7. ניתן לעקוב אחר השתלת הגידול והתקדמותו באמצעות שיטות הרדמה והדמיה לפי בחירה כגון הדמיה ביולומינסנטית, MRI או PET/MRI. הדרישה והיכולת לבצע הדמיה כזו יהיו תלויות מטבען במטרות הפרויקט האינדיבידואליות ובמתקן שבתוכו הוא מתבצע, ובהתאם לסוג תג המדווח של קווי התאים בהם נעשה שימוש, נגישות של רדיוכימיה רלוונטית ומתקני הדמיה גרעינית36,37
    הערה: בעלי חיים מסוימים עשויים שלא להגיב טוב ולחוות שבץ למרות הליך מוצלח. לאחר ההליך, בעלי חיים המופיעים עם תסמינים כלשהם של מצוקה נוירולוגית (סיבוב ראש ומשיכה לצד אחד, התנהגות הקיפה, גלגול, ת'ראש, אובדן תפקוד מוטורי) חייבים להיות מורדמים באופן מיידי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השוואת הזרקת עורק הצוואר הנפוצה עם או בלי קשירת עורק הצוואר החיצוני
כאשר תאים סרטניים הוזרקו דרך עורק הצוואר המשותף מבלי לקשור תחילה את עורק הצוואר החיצוני24, נמצאו גידולי פנים ב-77.8% מהעכברים המושתלים (n = 7/9 בעלי חיים). דוגמה לגידול בפנים מודגמת באיור משלים 3. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה מונעת גרורות לא מכוונות בפנים על ידי קשירת עורק הצוואר החיצוני לפני עורק הצוואר המשותף.

כדי להשוות בין שתי השיטות, לקטין הוזרק ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

גרורות במוח הן תהליך מורכב של תאים סרטניים המתפשטים מהאתר הראשוני שלהם למוח. קיימים מודלים שונים של בעלי חיים המשקפים שלבים מסוימים בתהליך רב-שלבי זה, וישנם שיקולים פיזיולוגיים ומעשיים לתכנון מחקרי גרורות פרה-קליניים41,42. רוב המחקרים שפורסמו החוקרים את השימוש בננו-רפואה לטיפול בגרורות במוח השתמשו במודלים תוך-לבביים של 43,44ו-45,46,47,48,49

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר; באיסוף, ניתוח או פרשנות של נתונים; בכתיבת כתב היד, או בהחלטה לפרסם את המאמר.

תודות

מחקר זה מומן על ידי המועצה הלאומית האוסטרלית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC), מענק מספר APP1162560. ML מומנה על ידי מלגת מחקר לתואר שני של UQ. ברצוננו להודות לכל מי שסייע בגידול בעלי חיים ובהדמיה in vivo של בעלי החיים. אנו מודים לבית החולים המלכותי בריסביין ולנשים על תרומת אליקוטים של זירקוניום למחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100 ומיקרו; מסננת תאים mקורנינגCLS431752
30G מחט מיקרולנסBD23748
31G מזרק אינסולין Ultra-Fine IIBD326103
מלקחיים זוויתייםProscitechT67A-SSמחודד עדין, זוויתי ללא שיניים, קצה 18 מ"מ, אורך 128 מ"מ
מחצלת
אנטיביוטיקה ואנטימיקוטיקהשקיות חיטוי של ThermoFisher Scientific15240062
BT-474 (HTB-20) קו תאי סרטן השדATCCHTB-20
בופרנורפין (TEMGESIC)
מונה תאי רוזנתThermoFisher ScientificC10227
Diet-76AClearH2O72-07-5022
מיקרוסקופ
מנקב
קוצץ
מלקחיים בזווית עדינהProscitechDEF11063-07זוויתי 45°, קצה חלק, רוחב קצה: 0.4 מ"מ, ממד קצה: 0.4 x 0.3 מ"מ, אורך 9 ס"מ
צינורות עדינים לצינורית, צינורות OD (ב) 1/32, מזהה צינורות (ב) 1/100 אינץ'Cole ParmerEW-06419-00
סרום בקר עובריThermoFisher Scientific26140079
תמיסת המלח המאוזנת של האנק ללא סידן ומגנזיוםThermoFisher Scientific14170120
הידרוג'לClearH2O70-01-5022
Isoflurane
Kimwipes מגבים חד פעמיים עם מוך נמוךקימברלי קלארק- KimwipesZ188964
צ'או
מלוקסיקם (METACAM)
חרוטמעוצב מצינור מיקרופוגה
חומר סיכה לעיניים PAA (קרבומר 2 מ"ג/גרם)  Bausch and lomb
Povidone-יוד תמיסתBetadine2505692
PPE (כפפה, מסכה, חלוק, רשת שיער)
RetractorsKent ScientificSURGI-5001
RPMI 1640 MediaThermoFisher Scientific11875093
תפר משי 13 מ"מ 5-0, P3, 45 ס"מEthiconJJ-640G
מלח רגילים סטרילייםThermoFisher ScientificTM4469
סרט
לוחקרש חיתוך עטוף בשקית הניתנת לחיטוי.
מספריים כירורגייםProscitechT104מידות קצה (LxD): 38x7 מ"מ, אורך 115 מ"מ
מלקחיים תפרים / מלקחיים מעוקלים BrophyProscitechT113Cמעוקל, קצה צר מעוגל 2 מ"מ, עם שיניים, אורך 165 מ"מ
מחזיק מחט תפר (מחזיק מחט Olsen Hegar)ProscitechTC1322-180אורך 190 מ"מ, מהדק מחגר
נהג מזרק עם דוושת רגל/ משאבתמיקרו UMP3 UltraWorld Precision InstrumentsUMP3-3
T75 בקבוק תרבית רקמותThermoFisher Scientific156499
חוט
Trigene II חומר חיטוי משטחCeva
Trypan Blue ו-Cell Counting Chamber SlidesThermoFisher ScientificC10228
TrypLE אקספרס דיסוציאציה מדיוםThermoFisher Scientific12605010
חום לבעלי חייםדיסקציהאוזנייםחשמליעכבר פירה אף מי דביק כירורגי

מקורות

  1. Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. Epidemiology of brain metastases. Current Oncology Reports. 14 (1), 48-54 (2012).
  2. Australian Institute of Health and Welfare. Cancer in Australia. , Canberra: AIHW. (2017).
  3. Maher, E. A., Mietz, J., Arteaga, C. L., DePinho, R. A., Mohla, S. Brain metastasis: opportunities in basic and translational research. Cancer Research. 69 (15), 6015-6020 (2009).
  4. Lin, N. U. Breast cancer brain metastases: new directions in systemic therapy. Ecancermedicalscience. 7, (2013).
  5. Zimmer, A. S., Van Swearingen, A. E. D., Anders, C. K. HER2-positive breast cancer brain metastasis: A new and exciting landscape. Cancer Reports. 5 (4), (2020).
  6. Brown, P. D., et al. Postoperative stereotactic radiosurgery compared with whole brain radiotherapy for resected metastatic brain disease (NCCTG N107C/CEC·3): a multicentre, randomised, controlled, phase 3 trial. Lancet Oncology. 18 (8), 1049-1060 (2017).
  7. Murrell, J., Board, R. The use of systemic therapies for the treatment of brain metastases in metastatic melanoma: Opportunities and unanswered questions. Cancer Treatment Reviews. 39 (8), 833-838 (2013).
  8. Stemmler, H. J., et al. Ratio of trastuzumab levels in serum and cerebrospinal fluid is altered in HER2-positive breast cancer patients with brain metastases and impairment of blood-brain barrier. Anticancer Drugs. 18 (1), 23-28 (2007).
  9. Venur, V. A., Leone, J. P. Targeted therapies for brain metastases from breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1543(2016).
  10. Murthy, R., et al. Tucatinib with capecitabine and trastuzumab in advanced HER2-positive metastatic breast cancer with and without brain metastases: a non-randomised, open-label, phase 1b study. The Lancet Oncology. 19 (7), 880-888 (2018).
  11. Murthy, R. K., et al. trastuzumab, and capecitabine for HER2-positive metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 382 (7), 597-609 (2019).
  12. Shah, M., et al. FDA approval summary: Tucatinib for the treatment of patients with advanced or metastatic HER2-positive breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (5), 1220-1226 (2021).
  13. Vogelbaum, M. A., et al. Treatment for brain metastases: ASCO-SNO-ASTRO guideline. Journal of Clinical Oncology. 40 (5), 492-516 (2021).
  14. Ramakrishna, N., et al. Management of advanced human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer and brain metastases: ASCO guideline update. Journal of Clinical Oncology. 10, (2022).
  15. Li, J., et al. A multifunctional polymeric nanotheranostic system delivers doxorubicin and imaging agents across the blood-brain barrier targeting brain metastases of breast cancer. ACS Nano. 8 (10), 9925-9940 (2014).
  16. Mittapalli, R. K., et al. Paclitaxel-hyaluronic nanoconjugates prolong overall survival in a preclinical brain metastases of breast cancer model. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (11), 2389-2399 (2013).
  17. Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), 991-1001 (2015).
  18. Patil, R., et al. MRI virtual biopsy and treatment of brain metastatic tumors with targeted nanobioconjugates: nanoclinic in the brain. ACS Nano. 9 (5), 5594-5608 (2015).
  19. Brighi, C., et al. MR-guided focused ultrasound increases antibody delivery to non-enhancing high-grade glioma. Neuro-Oncology Advances. 2 (1), (2020).
  20. Inamura, T., Black, K. L. Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 14 (5), 862-870 (1994).
  21. Priego, N., et al. Abstract 2746: Stat3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Cancer Research. 79, 2746(2019).
  22. Wyatt, E. A., Davis, M. E. Method of establishing breast cancer brain metastases affects brain uptake and efficacy of targeted, therapeutic nanoparticles. Bioengineering & Translational Medicine. 4 (1), 30-37 (2018).
  23. Nakayama, J., et al. The in vivo selection method in breast cancer metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1886(2021).
  24. Zhang, C., Lowery, F. J., Yu, D. Intracarotid cancer cell injection to produce mouse models of brain metastasis. Journal of Visualized Experiments. 120, 55085(2017).
  25. Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622(2019).
  26. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
  27. Hu, X., Villodre, E. S., Woodward, W. A., Debeb, B. G. Modeling brain metastasis via tail-vein injection of inflammatory breast cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 168, (2021).
  28. Cho, J. H., et al. AKT1 activation promotes development of melanoma metastases. Cell Reports. 13 (5), 898-905 (2015).
  29. Meuwissen, R., et al. Induction of small cell lung cancer by somatic inactivation of both Trp53 and Rb1 in a conditional mouse model. Cancer Cell. 4 (3), 181-189 (2003).
  30. Kato, M., et al. Transgenic mouse model for skin malignant melanoma. Oncogene. 17 (14), 1885-1888 (1998).
  31. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  32. Sulaiman, A., Wang, L. Bridging the divide: preclinical research discrepancies between triple-negative breast cancer cell lines and patient tumors. Oncotarget. 8 (68), 113269-113281 (2017).
  33. Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. 91, 52017(2014).
  34. Geisler, J. A., et al. Modeling brain metastases through intracranial injection and magnetic resonance imaging. Journal of Visualized Experiments. 160, (2020).
  35. Reid, Y., Storts, D., Riss, T., Minor, L., et al. in Assay Guidance Manual. eds Markossian, S. et al.) Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
  36. Janowicz, P. W., et al. Understanding nanomedicine treatment in an aggressive spontaneous brain cancer model at the stage of early blood brain barrier disruption. Biomaterials. , 283(2022).
  37. Houston, Z. H., et al. Understanding the Uptake of Nanomedicines at Different Stages of Brain Cancer Using a Modular Nanocarrier Platform and Precision Bispecific Antibodies. ACS Cent Sci. 6 (5), 727-738 (2020).
  38. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46, 6387-6392 (1986).
  39. Clemons, T. D., et al. Distinction between active and passive targeting of nanoparticles dictate their overall therapeutic efficacy. Langmuir. 34 (50), 15343-15349 (2018).
  40. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), (2021).
  41. Masmudi-Martín, M., et al. Brain metastasis models: What should we aim to achieve better treatments. Advanced Drug Delivery Reviews. 169 (20), 79-99 (2021).
  42. Carney, C. P., et al. Harnessing nanomedicine for enhanced immunotherapy for breast cancer brain metastases. Drug Delivery and Translational Research. 11 (6), 2344-2370 (2021).
  43. Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), Berlin, Germany. 991-1001 (2015).
  44. Bao, Y., et al. Synergistic chemotherapy for breast cancer and breast cancer brain metastases via paclitaxel-loaded oleanolic acid nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 17 (4), 1343-1351 (2020).
  45. Kotb, S., et al. Gadolinium-based nanoparticles and radiation therapy for multiple brain melanoma metastases: Proof of concept before phase I trial. Theranostics. 6 (3), 418-427 (2016).
  46. Zhang, T., et al. Multitargeted nanoparticles deliver synergistic drugs across the blood-brain barrier to brain metastases of triple negative breast cancer cells and tumor-associated macrophages. Advanced Healthcare Materials. 8 (18), 1900543(2019).
  47. He, C., et al. Blood-brain barrier-penetrating amphiphilic polymer nanoparticles deliver docetaxel for the treatment of brain metastases of triple negative breast cancer. Journal of Controlled Release. 246, 98-109 (2017).
  48. Wang, X., et al. Enhanced anti-brain metastasis from non-small cell lung cancer of osimertinib and doxorubicin co-delivery targeted nanocarrier. International Journal of Nanomedicine. 15, 5491-5501 (2020).
  49. Gries, M., et al. Multiscale selectivity and in vivo biodistribution of NRP-1-targeted theranostic AGuIX nanoparticles for PDT of glioblastoma. International Journal of Nanomedicine. 15, 8739-8758 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מודל גרורות במוחהזרקה לעורק התרדמי הפנימיהזרקת תאי סרטןגרורות במוח של עכברהיווצרות גידול תוך-גולגולתיתהולכת תרופות למוחניטור התקדמות גידולדימות ביולומינצנטיקשירת עורק התרדמיהיסטולוגיה של גידולי מוח
מידול גרורות במוח על ידי הזרקת עורק הצוואר הפנימי של תאים סרטניים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.