מאמר שיטה

ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם מורין ותאי נישה סטרומליים

DOI:

10.3791/64248

⸱

28 בספטמבר 2022

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד והכתמה של תאי מח עצם מורין לפנוטיפ תאי גזע המופויטיים ותאי אב יחד עם תאי גזע אנדותל ומזנכימליים תומכים. כמו כן נכללת שיטה להעשרת תאים הממוקמים באזורי אנדוסטל ומח עצם מרכזי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מח העצם (BM) הוא הרקמה הרכה המצויה בתוך העצמות שבהן מתרחשת בעיקר המטופויזה, התהליך שבו נוצרים תאי דם חדשים. ככזה, הוא מכיל תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs), כמו גם תאי סטרומה תומכים התורמים לתחזוקה ולוויסות של HSPCs. הפרעות BM המטולוגיות ואחרות משבשות את ההמטופוייזה על ידי השפעה ישירה על תאים המטופויטיים ו / או באמצעות שינוי של נישת BM. כאן, אנו מתארים שיטה לחקר hematopoiesis בבריאות וממאירות באמצעות ניתוח פנוטיפי של מורין BM HSPCs ואוכלוסיות נישה סטרומה על ידי ציטומטריית זרימה. השיטה שלנו מפרטת את השלבים הנדרשים להעשרת תאי BM בשברים אנדוסטליים ובשברי BM מרכזיים, כמו גם את אסטרטגיות הגאטינג המתאימות לזיהוי שני סוגי תאי הנישה העיקריים המעורבים בוויסות HSPC, תאי אנדותל ותאי גזע מזנכימליים. הניתוח הפנוטיפי המוצע כאן עשוי להיות משולב עם מוטציות עכבר, מודלים של מחלות ומבדקים פונקציונליים כדי לאפיין את תא HSPC ואת הנישה שלו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציטומטריית זרימה היא שיטה רבת ערך לאפיון ובידוד פרוספקטיבי של תאים חיסוניים והמטופויאטיים. הוא גם משמש יותר ויותר לניתוח אוכלוסיות סטרומה ואפיתל של רקמות שונות. לתא הגזע ההמטופויאטי (HSC) תכונות ייחודיות של התחדשות עצמית ורב-עוצמה. ביונקים בוגרים, HSCs מתגוררים בעיקר במח העצם (BM), שם הם מקבלים אותות שקט והישרדות מהמיקרו-סביבה שמסביב או מנישה1. HSCs מוגדרים באופן רשמי על פי בדיקות פונקציונליות2. אף על פי כן, מספר מאמרים פורצי דרך הראו את התועלת של ציטומטריית זרימה לזיהוי HSCs. באמצעות שימוש בסמנים מוגבלים בפני השטח של התא, ניתן להבחין בין אוכלוסיות המטופויטיות המועשרות מאוד ב-HSCs3. ציטומטריית זרימה היא, אם כן, שיטה מרכזית בשדה תאי הגזע. נעשה בו שימוש נרחב כדי להעריך את ההשפעה של סוגי תאי נישה משוערים וגורמי נישה על HSC. על ידי שילוב של ציטומטריית זרימה עם הדמיה ובדיקות פונקציונליות, הוכח כי HSCs נתמכים באופן קריטי על ידי תאי גזע מזנכימליים פריווסקולריים (MSCs) ותאי אנדותל (ECs). BM MSCs הם קבוצה הטרוגנית ויש להם תרומות ציטוקינים שונות4, אבל זה מבוסס היטב כי קולטן לפטין (LepR)+ MSCs הם תאי נישה מרכזיים1. BM ECs הם גם הטרוגניים מאוד ויכולים להיות חלק מסינוסואידים, עורקים וכלי דם מסוג H / מעבר5. מחקרים שונים הראו את התרומה הניואנסית של ECs שונים אלה. לדוגמה, ECs סינוסואידים אנדוסטליים קרובים יותר מרחבית ל- HSCs6 שקטים, בעוד HSCs לא נודדים עם רמות נמוכות יותר של מיני חמצן תגובתי ממוקמים ליד ECsעורקיים 7. גם המיקום האנדוסטאלי לעומת המרכזי של הנישות חשוב מאוד. כלי דם מסוג H אנדוסטלים קשורים לתאי סטרומה פריווסקולריים שאבדו עם ההזדקנות, מה שמוביל לאובדן HSCs8. בלוקמיה מיאלואידית חריפה, ECs מרכזיים מורחבים, בעוד כלי אנדוסטל ו- HSCs אנדוסטליים הולכים לאיבוד9.

רוב המחקרים בתחום התמקדו בהמטופויזה עצמה ובוויסות החיצוני של התא של HSCs. עם זאת, יותר ויותר הוכר כי יש צורך לאפיין טוב יותר את הנישות המווסתות אבות אחרים, כלומר אבות רב-פוטנטיים (MPPs), במיוחד בהתחשב בכך שהם הנהגים העיקריים של hematopoiesis במצב יציב10. בניגוד למבנה היררכי קבוע, מחקרים אחרונים הראו כי המטופויזיס הוא רצף שבו HSCs מתמיינים ל-MPPs מוטים בשלב מוקדם11. MPPs נקראו על שם תוכניות סיווג שונות12, אך נייר קונצנזוס שנערך לאחרונה על ידי האגודה הבינלאומית להמטולוגיה ניסויית (ISEH) הציע MPPs להיות מופלים כמו MPPs מוקדם ועל פי הלימפה שלהם (MPP-Ly), megakaryocytic ו erythroid (MPP-Mk/E), ומיאלואיד (MPP-G/M)הטיה 13. השימוש בציטומטריית זרימה יהיה קריטי בהמשך המחקר על חשיבותן של נישות BM בוויסות אוכלוסיות אלה. שיטות ציטומטריית זרימה נוכחית משתמשות באסטרטגיות gating משתנות כדי להתמיין HSPCs ולזהות תאי סטרומה, כלומר ECs, באמצעות סמנים לא עקביים. מטרת השיטה הנוכחית היא להציג תהליך עבודה פשוט וניתן לשחזור של צביעת BM כדי לזהות תת-אוכלוסיות HSPC, קבוצות הטרוגניות של ECs ו- LepR+ MSCs. אנו מאמינים כי טכניקה זו, למרות שניתן להשוות אותה לשיטות שדווחו בעבר (ראה, למשל, הפניה 14), מספקת פרוטוקול מעודכן וקל ליישום לניתוח פנוטיפי של תאים המטופויטיים בשני אזורי מח המוח הפונקציונליים, אנדוסטל ו- BM 8,15 מרכזי, כמו גם תאי נישה סטרומה BM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעלי החיים המשמשים בפרוטוקול זה שוכנו במתקן בעלי החיים i3S בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים במחזור אור-חושך של 12 שעות ובסביבה מבוקרת טמפרטורה. גישה חופשית לצ'או מכרסמים סטנדרטי ומים סופקה. כל בעלי החיים קיבלו טיפול הומני על פי הקריטריונים שהותוו על ידי הפדרציה האירופית של אגודות מדעי חיות מעבדה לטיפול וטיפול בחיות מעבדה (הנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU). ההליך הניסיוני שבוצע על בעלי החיים (המתת חסד) אושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים i3S (ref. DD_2019_15) ועל ידי Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. פרטים על החומרים בהם נעשה שימוש בפרוטוקול זה ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. הכנת תמיסות והכתמת קוקטיילים

  1. מלח חוצץ פוספט (PBS): יש להמיס חמש טבליות PBS בליטר אחד של מים מזוקקים. יש לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
  2. PBS 2% סרום בקר עוברי (FBS): הוסף 10 מ"ל של FBS ל 500 מ"ל של PBS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  3. חיץ ליזה של תאי דם אדומים (RBC) (1x): הוסף 50 מ"ל של 10x RBC lysis buffer ל- 450 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  4. תמיסת Collagenase IV ו-dispase II: יש להמיס 30 מ"ג של collagenase IV ו-60 מ"ג של dispase II ב-30 מ"ל HBSS לקבלת תמיסת 1 מ"ג/מ"ל collagenase IV ו-2 מ"ג/מ"ל dispase II. יש להכין טרי לפני השימוש.
  5. פתרון חסימת קולטני Fc: הוסף 10 μL של נוגדן CD16/32 מטוהר נגד עכבר ל 490 μL של PBS 2% FBS. הכינו טרי או ביום הקודם. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
  6. תמיסת צביעת צביעה של כדאיות תאים פלואורסצנטיים: הוסף 2 μL של צבע כדאיות תאים פלואורסצנטיים ל- 1 מ"ל של PBS. יש להכין טרי לפני השימוש.
  7. קוקטייל שושלת ביוטין: יש לערבב 100 μL של כל אחד מהנוגדנים הבאים: ביוטין נגד עכבר CD3ε, ביוטין נגד עכבר CD4, ביוטין נגד עכבר CD8a, ביוטין נגד עכבר / CD11b אנושי, ביוטין נגד עכבר / CD45R / B220, ביוטין נגד עכבר Ly-6G/Ly-6C (Gr-1), וביוטין נגד עכבר TER-119/תאים אריתרואידים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
  8. קוקטייל הצביעה העיקרי של HSCs: הוסף 10 μL של קוקטייל שושלת ביוטין, 10 μL של immunofluorescently מתויג 510 CD150 נגד עכבר (SLAM), 10 μL של phycoerythrin (PE) נגד עכבר Flk2 (CD135), 10 μL של חלבון peridinin-chlorophyll (PerCP) נגד עכבר Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL של PE / ציאנין7 נגד עכבר CD48, ו 10 μL של allophycocyanin (APC) / Cyanine7 נגד עכבר CD117 (c-kit) ל 940 μL של PBS 2% FBS. הכינו טרי או ביום הקודם. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C כשהיא מוגנת מפני אור עד לשימוש.
  9. קוקטייל צביעה ראשוני סטרומה: הוסף 5 μL של לפטין עכבר R נוגדן biotinylated, 6.7 μL של נוגדן PE נגד עכבר אנדומוצין, 10 μL של PerCP נגד עכבר Ly-6A/E (Sca-1), 4 μL של PE / ציאנין7 נגד עכבר CD31, 10 μL של APC/Cyanine7 נגד עכבר CD45, ו 10 μL של APC/ציאנין7 נגד עכבר TER-119 / תאים אריתרואידים 954 μL של PBS 2% FBS. הכינו טרי או ביום הקודם. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C כשהיא מוגנת מפני אור עד לשימוש.
  10. HSCs/תמיסת צביעה שניונית סטרומה: הוסף 1 μL של סטרפטאבידין APC ל 1 מ"ל של PBS 2% FBS. הכינו טרי או ביום הקודם. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C כשהיא מוגנת מפני אור עד לשימוש.
  11. קוקטייל מכתים ECs: הוסף 10 μL של נוגדן PE נגד עכבר אנדומוצין, 10 μL של PerCP נגד עכבר Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL של PE / ציאנין7 נגד עכבר CD31, 10 μL של Alexa Fluor 647 נגד עכבר CD54 / ICAM-1, 10 μL של APC / ציאנין 7 נגד עכבר CD45, ו 10 μL של APC/ציאנין7 נגד עכבר TER-119 / תאים אריתרואידים ל 940 μL של PBS 2% FBS. הכינו טרי או ביום הקודם. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C כשהיא מוגנת מפני אור עד לשימוש.
  12. פתרון צביעת DAPI: הוסף טיפה אחת של מגיב DAPI ל- 500 μL של PBS. יש להכין טרי לפני השימוש.

2. מיצוי דגימה

  1. המתת חסד של בעל החיים על ידי פריקת צוואר הרחם (פרטים על בעלי החיים ששימשו להפקת הנתונים שהוצגו במחקר זה ניתן למצוא בטבלה משלימה 1). הניחו את בעל החיים עם הבטן על צלחת פטרי ורססו באתנול 70%. לעשות חתך מעל הבטן באמצעות מספריים ולמשוך את העור משם כל הדרך עד הקרסוליים.
  2. תפסו רגל אחת, ובעזרת מספריים חתכו אותה בתחתיתה (היכן שהמפרק בין הרגל לירך נמצא) כדי להפריד בינה לבין החיה. צעד זה ישמש גם כשיטת אישור משנית להמתת חסד. הסר את כף הרגל מהרגל על ידי חיתוך בקרסול. מניחים את הרגל ב-PBS קר כקרח 2% FBS. במידת הצורך, חזור על הצעד עם הרגל השנייה.
  3. תפוס את עצם הירך, ובעזרת מספריים לחתוך מאחוריה כדי להפריד אותו מן החיה. הניחו את עצם הירך ב-PBS קר כקרח 2% FBS. במידת הצורך, חזור על השלב עם עצם הירך השנייה.
  4. הניחו את עצמות הרגליים והירך בצלוחית פטרי ובעזרת אזמל סטרילי נקו את העצמות. להפריד את השוקה ואת עצם הירך על ידי חיתוך הברך עם אזמל. הניחו את העצמות הנקיות ב-PBS קר כקרח 2% FBS.

3. עיבוד דגימה לניתוח אוכלוסיות תאים המטופויטיים בסך מח עצם

  1. מניחים עצם הירך או השוקה במכתש עם PBS 2% FBS קר כקרח ומועכים את העצם על ידי הצמדתה בעדינות לדופן המליטה באמצעות המזיק. תאי BM משוחררים לתמיסה הכלולה במכתש.
  2. פיפטה מתלה התא שנוצר למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 10 מ"ל כדי הומוגניזציה והעברה לתוך צינור 50 מ"ל דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר הממוקם על גבי הצינור.
  3. אם העצמות המרוסקות אינן נראות לבנות בשלב זה, הוסף עוד PBS 2% FBS לטיט וריסוק חוזר, ולאחר מכן פיפטה למעלה ולמטה והעבר את התמיסה לאותו צינור 50 מ"ל דרך אותה מסננת תאים של 40 מיקרומטר.
  4. שטפו את המכתש עם עוד קצת PBS 2% FBS והעבירו את התמיסה לאותו צינור 50 מ"ל דרך אותה מסננת תאים של 40 מיקרומטר. צנטריפוגה את הצינור 50 מ"ל ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  5. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-5 מ"ל של חיץ ליזיס RBC (1x) ב-RT על ידי פיפטציה למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר דגירה של 2 דקות ב- RT, הוסף 15 מ"ל של PBS 2% FBS.
  6. צנטריפוגה את הצינור 50 מ"ל ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. אם גלולת התא עדיין נראית אדמדמה, חזור לשלב 3.5. אם לא, השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של PBS, והעבירו את מתלה התא לבאר של צלחת V תחתונה בעלת 96 בארות להכתמה.
  7. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C. יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג ולהשהות מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של תמיסת צביעת צבע פלואורסצנטית. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  8. צלחת צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C. יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג ולהשהות מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של PBS 2% FBS לשטיפה.
  9. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג, ו resuspend את הגלולה ב 100 μL של קולטני Fc חוסם פתרון. לדגור על הצלחת במשך 10 דקות ב 4 ° C מוגן מפני אור.
  10. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגו את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג, ואת resuspend את הגלולה ב 100 μL של קוקטייל צביעה ראשוני HSC. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  11. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג, והלייה מחדש את הגלולה ב 100 μL של HSCs תמיסת צביעה משנית. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  12. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגו את הצלחת במהירות של 500 x גרם למשך 3 דקות ב-4°C והשליכו את הסופרנאטנט על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג.
  13. השהה מחדש את הגלולה ב 250 μL של PBS 2% FBS והעבר את תרחיף התא לתוך צינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול תחתית דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. יש לשמור על קרח מוגן מפני אור עד לניתוח ציטומטריית זרימה.
    הערה: אם אתם מעוניינים לקבוע את המספרים המוחלטים של אוכלוסיות תאים המטופויטיים, הוסיפו חרוזי כיל לצינורות הפוליסטירן לפני ניתוח הציטומטר16.

4. עיבוד דגימות לניתוח אוכלוסיות תאי סטרומה בסך מח עצם

  1. מניחים עצם הירך או השוקה במכתש עם PBS 2% FBS קר כקרח ומועכים את העצם על ידי הצמדתה בעדינות לדופן המליטה באמצעות המזיק. חותכים את קצה קצה P1000 באמצעות מספריים ומשתמשים בו כדי להעביר את כל התוכן של המליטה לתוך צינור 50 מ"ל (לא לעבור דרך מסננת התא).
  2. צנטריפוגה את הצינור 50 מ"ל ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant, ולהשהות מחדש את הגלולה ב 3 מ"ל של collagenase IV ו dispase II פתרון. יש לדגור על הצינור בטמפרטורה של 37°C למשך 40 דקות.
  3. מלא את הצינור ל 25 מ"ל עם PBS 2% FBS ומערבולת לערבוב. העבר את התוכן של צינור 50 מ"ל לצינור חדש של 50 מ"ל דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר. הוסף 15 מ"ל של PBS 2% FBS לצינור הישן של 50 מ"ל והעבר את התמיסה לאותו צינור חדש של 50 מ"ל דרך אותה מסננת תאים. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  4. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-5 מ"ל של חיץ ליזיס RBC (1x) ב-RT על ידי פיפטציה למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר דגירה של 2 דקות ב- RT, הוסף 15 מ"ל של PBS 2% FBS.
  5. צנטריפוגה את הצינור 50 מ"ל ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. אם גלולת התא עדיין נראית אדמדמה, חזור לשלב 4.4. אם לא, השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של PBS 2% FBS, והעבירו את מתלה התא לבאר של צלחת V תחתונה של 96 בארות לצורך צביעה. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
  6. אם אתם מבצעים צביעת סטרומה, המשיכו לשלב 4.7. אם אתה מבצע צביעת EC, המשך לשלב 4.12.
  7. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג ותלו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של קוקטייל צביעה ראשוני סטרומה. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  8. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג, ו resuspend את הגלולה ב 100 μL של תמיסת צביעה משנית סטרומה. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  9. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג.
  10. השהה מחדש את הגלולה ב 250 μL של PBS 2% FBS והעבר את תרחיף התא לתוך צינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול תחתית דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. יש לשמור על קרח מוגן מפני אור.
  11. רגע לפני שאתם ניגשים לציטומטר, הוסיפו 35 מיקרוליטר של תמיסת צביעה DAPI לצינור המכיל את תרחיף התא לניתוח ציטומטריית זרימה ודגרו על הצינור ב-RT למשך 5 דקות בחושך. לאחר הדגירה הזו, יש לשמור על קרח מוגן מפני אור עד לניתוח ציטומטריית זרימה.
  12. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג ותלו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של קוקטייל EC מכתים. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  13. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
  14. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג. השהה מחדש את הגלולה ב 250 μL של PBS 2% FBS והעבר את תרחיף התא לתוך צינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול תחתית דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. יש לשמור על קרח מוגן מפני אור.
  15. רגע לפני שאתם ניגשים לציטומטר, הוסיפו 35 מיקרוליטר של תמיסת צביעה DAPI לצינור המכיל את תרחיף התא לניתוח ציטומטריית זרימה ודגרו על הצינור ב-RT למשך 5 דקות בחושך. לאחר הדגירה הזו, יש לשמור על קרח מוגן מפני אור עד לניתוח ציטומטריית זרימה.
    הערה: אם אתם מעוניינים לקבוע את המספרים המוחלטים של אוכלוסיות תאי סטרומה ואנדותל, הוסיפו חרוזי כיול לצינורות הפוליסטירן לפני הניתוח בציטומטר16.

5. עיבוד דגימה לניתוח אוכלוסיות תאים המטופויטיים ב- BM כתוש וסמוק

  1. מניחים עצם הירך על צלחת פטרי וחותכים את קצות העצם באמצעות אזמל סטרילי.
  2. שטפו את החלק המרכזי של העצם (דיאפיזיס) על ידי העברת 100 μL של PBS 2% FBS דרך החלק הפנימי של העצם פעם אחת מכל צד באמצעות מזרק אינסולין 0.5 מ"ל ללא נפח מת ואיסוף התמיסה בצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 1 מ"ל של PBS 2% FBS. לאחר מכן, להעביר את מתלה התא לתוך צינור 50 מ"ל המסומן כמו BM סמוק המכיל 4 מ"ל של PBS 2% FBS. שמור על קרח.
  3. מניחים את קצות העצם במכתש עם PBS 2% FBS קר כקרח ומועכים על ידי הצמדתו בעדינות לקיר הטיט באמצעות המזיק. פיפטה את תרחיף התא שנוצר למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 10 מ"ל כדי הומוגניזציה והעברה לתוך צינור 50 מ"ל המסומן כמו BM כתוש דרך מסננת תא 40 מיקרומטר.
  4. אם העצם המרוסקת אינה נראית לבנה בשלב זה, הוסף עוד PBS 2% FBS לטיט וחזור על הריסוק. לאחר מכן פיפטה למעלה ולמטה ולהעביר את התמיסה לתוך אותו צינור 50 מ"ל (BM כתוש) דרך אותה מסננת תאים 40 מיקרומטר.
  5. שטפו את הטיט עם עוד קצת PBS 2% FBS והעבירו את התמיסה לאותו צינור 50 מ"ל (BM כתוש) דרך אותה מסננת תאים של 40 מיקרומטר.
  6. צנטריפוגה צינורות 50 מ"ל המתאים דגימות סמוק כתוש ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
  7. בצע את שלבים 3.5 עד 3.13 (סעיף 3) עם דגימות BM סמוקות ומרוסקות.

6. הכנת בקרות צבע יחיד (SCC) לניתוח ציטומטריית זרימה

  1. בצע את שלבים 3.1 עד 3.6 (סעיף 3) עם עצם נוספת מאחת החיות שלא שימשו לניתוח העיקרי, העברת תרחיף התא הסופי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 1 מ"ל של PBS 2% FBS במקום באר של צלחת V תחתונה 96 באר.
  2. העבר 100 μL של תרחיף התא ל 8 בארות של צלחת V-תחתית 96 בארות, 100 μL לתוך צינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול תחתית המכיל 100 μL של PBS 2% FBS המסומן כ- DAPI SCC, ואת תרחיף התא הנותר לתוך צינור פוליסטירן עגול תחתון 5 מ"ל המכיל 100 μL של PBS 2% FBS המסומן כלא מוכתם. שמור על הצינורות על קרח מוגנים מפני אור.
  3. צנטריפוגו את הצלחת במהירות של 500 x גרם למשך 3 דקות ב-4°C והשליכו את הסופרנאטנטים על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג.
  4. יש להשהות גלולה אחת ב-100 מיקרוליטר של תמיסת צביעת צבע פלואורסצנטי ואת הנותרות ב-100 מיקרוליטר של PBS 2% FBS.
  5. הוסף 0.5 μL של הנוגדנים הבאים, מלבד קוקטייל השושלת של נוגדנים שעבורם מוסיפים 2 μL ונוגדן PECy7 CD31 שעבורו מוסיפים 0.3 μL, לכל אחת מהבארות עם תרחיף תאים ב- PBS 2% FBS (נוגדן אחד לכל באר, אותם נוגדנים המשמשים בלוחות הניתוח העיקריים או אותם נוגדנים פלואורופורים עם עוצמת פלואורסצנטיות דומה ושפע אפיטופים): קוקטייל שושלת ביוטין, מתויג באופן אימונופלואורסצנטי 510 CD150 נגד עכבר (SLAM), PE נגד עכבר Flk2 (CD135), PerCP נגד עכבר Ly-6A / E (Sca-1), immunofluorescently מתויג 647 נגד עכבר CD54 / ICAM-1, PE / ציאנין7 נגד עכבר CD48, ו APC / ציאנין7 נגד עכבר CD117 (c-kit). דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  6. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS לכל באר פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגו את הצלחת במהירות של 500 x גרם למשך 3 דקות ב-4°C והשליכו את הסופרנאטנטים על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג.
  7. השהה מחדש את כל הכדוריות מלבד זו המתאימה לתאים המודגרות עם קוקטייל השושלת של נוגדנים ב 180 מיקרוליטר של PBS 2% FBS והעבר את מתלי התא לתוך צינורות 5 מ"ל פוליסטירן עגול תחתית דרך מסננות תאים 40 מיקרומטר. יש לשמור על קרח מוגן מפני אור עד לניתוח ציטומטריית זרימה.
  8. להשהות מחדש את התאים המודגרים עם קוקטייל השושלת של נוגדנים ב 100 μL של HSCs/תמיסת צביעה שניונית סטרומה. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  9. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
  10. השהה מחדש את הגלולה ב 180 μL של PBS 2% FBS ולהעביר את תרחיף התא לתוך צינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול תחתית דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. יש לשמור על קרח מוגן מפני אור עד לניתוח ציטומטריית זרימה.
  11. רגע לפני שאתם ניגשים לציטומטר, הוסיפו 35 μL של תמיסת צביעה DAPI לצינור DAPI SCC ודגרו על הצינור ב-RT למשך 5 דקות בחושך. לאחר הדגירה הזו, יש לשמור על קרח מוגן מפני אור עד לניתוח ציטומטריית זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלקות מייצגות של ניתוח ציטומטריית זרימה של HSCs ו-MPPs בעכבר C57Bl/6 בוגר צעיר ובריא מוצגות באיור 1. אסטרטגיית הגאטינג עוקבת אחר המינוח ההרמוני האחרון שהוצע על ידי ISEH13. כאשר מנתחים את ההשפעה של הפרעה, כגון זיהום או סרטן, חשוב להשתמש בעכבר בקרה כהפניה לשערים רגילים. פקדי פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) יכולים להיות שימושיים במיוחד לתיחום גבולות השערים, אך יש לציין כי הגדרה עיוורת של גבולות שערים המבוססים על FMOs עלולה להשמיט תאי מטרה או לכלול תאים שאינם תאי יעד. לדוגמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד שהפרוטוקול המתואר הוא פשוט וקל לביצוע, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לשלבים ספציפיים. לדוגמה, בעת קבלת BM סמוק (שלב 5.2), אין לחרוג מהנפח או מספר הפעמים המצוינות כדי להעביר PBS 2% FBS דרך החלק הפנימי של החלק המרכזי של העצם, מכיוון שהדבר עלול לגרום לזיהום משמעותי של הדגימה הסמוקה על ידי אוכלוסיות תאים אנדוסטליים.

שינויים בפרוטוקול יכולים להיעשות כדי להקל על ביצועו על ידי החוקר. במיצוי דגימה (סעיף 2), רגליים ו / או עצמות ניתן לאחסן PBS 2% FBS ב 4 ° C עד 24 שעות לפני המשך עיבוד הדגימה וניתוח. עם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LM נתמך על ידי מענק מקרן הזיכרון ליידי טאטא. JR נתמך על ידי מלגת דוקטורט מ- Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; ממשק משתמש של מלגת FCT/BD/150833/2021). ML נתמכה על ידי מלגת דוקטורט של FCT (מלגת FCT 2021.04773.BD). DD נתמך על ידי מענקים מהאגודה האמריקאית להמטולוגיה, קרן Pablove, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) והאגודה הפורטוגזית להמטולוגיה. אנו מודים לתמיכה של ד"ר קטרינה מיירלס ואמיליה קרדוסו ממתקן TRACY ב-i3s.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן Alexa Fluor 647 נגד עכבר CD54/ICAM-1 נוגדןBioLegend116114
APC StreptavidinBioLegend405207
נוגדן APC/Cyanine7 נגד עכבר CD117 (c-kit)BioLegend105826
נוגדן APC/Cyanine7 נגד עכבר CD45 נוגדןBioLegend103116
APC/Cyanine7 נגד עכבר TER-119/תאי אריתרואידBioLegend116223
ביוטין נגד עכבר CD3ε נוגדןBioLegend100304
ביוטין נגד עכבר CD4 נוגדןBioLegend100404
ביוטין נגד עכבר CD8a נוגדןBioLegend100704
ביוטין נגד עכבר Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) נוגדן BioLegend108404
ביוטין נוגדן נגד עכבר TER-119/תאי אריתרואידBioLegend116204
ביוטין נגד עכברים/נוגדן CD11b אנושיBioLegend101204
נוגדן ביוטין נגד עכברים/אנושי CD45R/B220 נוגדןBioLegend103204
Brilliant Violet 510 נגד עכבר CD150 (SLAM) נוגדןBioLegend115929
Calibrite 2 חרוזים צבעונייםBD Biosciences
Collagenase IVMerck Life ScienceC1889
Dispase IIMerck Life ScienceD4693
סרום בקר עוברי, מוסמך, מושבת בחום, מאושר על ידי האיחוד האירופי, מקור דרום אמריקהThermoFisher Scientific10500064
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)ThermoFisher Scientific14175095
עכבר לפטין R נוגדן ביוטינילR& מערכות DBAF497
NucBlue מגיב תאים קבועים (DAPI)ThermoFisher ScientificR37606מגיב DAPI נוגדן
אנדומוצין נגד עכברThermoFisher Scientific12-5851-82
PE נגד עכבר Flk2 (CD135)ThermoFisher Scientific12-1351-82
PE/Cyanine7 נוגדן CD31 נגד עכברBioLegend102524
PE/Cyanine7 נגד עכבר CD48 נוגדןBioLegend103424
PerCP נגד עכבר Ly-6A/E (Sca-1) נוגדןBioLegend108122
טבליות מלח פוספט (PBS) MerckLife ScienceP4417
נוגדן מטוהר נגד עכבר CD16/32 BioLegend101302
RBC מאגר ליזה 10xBioLegend420302
צבע זומבי סגול לתיקון BioLegend423114צבע פלואורסצנטי
349502

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  4. Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
  5. Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189(2021).
  6. Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
  7. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  8. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  9. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  10. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  11. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  12. Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  13. Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
  14. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  15. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  16. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  17. Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519(2018).
  18. Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
  19. Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532(2018).
  20. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449(2018).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936(2016).
  22. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  23. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
  24. Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
  25. Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Bone Marrow CellsHematopoietic Stem CellsEndosteal Bone MarrowCentral Bone MarrowMesenchymal Stem CellsEndothelial CellsPhenotypic Analysis

מאמרים קשורים