כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד והכתמה של תאי מח עצם מורין לפנוטיפ תאי גזע המופויטיים ותאי אב יחד עם תאי גזע אנדותל ומזנכימליים תומכים. כמו כן נכללת שיטה להעשרת תאים הממוקמים באזורי אנדוסטל ומח עצם מרכזי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם מורין ותאי נישה סטרומליים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מח העצם (BM) הוא הרקמה הרכה המצויה בתוך העצמות שבהן מתרחשת בעיקר המטופויזה, התהליך שבו נוצרים תאי דם חדשים. ככזה, הוא מכיל תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs), כמו גם תאי סטרומה תומכים התורמים לתחזוקה ולוויסות של HSPCs. הפרעות BM המטולוגיות ואחרות משבשות את ההמטופוייזה על ידי השפעה ישירה על תאים המטופויטיים ו / או באמצעות שינוי של נישת BM. כאן, אנו מתארים שיטה לחקר hematopoiesis בבריאות וממאירות באמצעות ניתוח פנוטיפי של מורין BM HSPCs ואוכלוסיות נישה סטרומה על ידי ציטומטריית זרימה. השיטה שלנו מפרטת את השלבים הנדרשים להעשרת תאי BM בשברים אנדוסטליים ובשברי BM מרכזיים, כמו גם את אסטרטגיות הגאטינג המתאימות לזיהוי שני סוגי תאי הנישה העיקריים המעורבים בוויסות HSPC, תאי אנדותל ותאי גזע מזנכימליים. הניתוח הפנוטיפי המוצע כאן עשוי להיות משולב עם מוטציות עכבר, מודלים של מחלות ומבדקים פונקציונליים כדי לאפיין את תא HSPC ואת הנישה שלו.
מבוא
ציטומטריית זרימה היא שיטה רבת ערך לאפיון ובידוד פרוספקטיבי של תאים חיסוניים והמטופויאטיים. הוא גם משמש יותר ויותר לניתוח אוכלוסיות סטרומה ואפיתל של רקמות שונות. לתא הגזע ההמטופויאטי (HSC) תכונות ייחודיות של התחדשות עצמית ורב-עוצמה. ביונקים בוגרים, HSCs מתגוררים בעיקר במח העצם (BM), שם הם מקבלים אותות שקט והישרדות מהמיקרו-סביבה שמסביב או מנישה1. HSCs מוגדרים באופן רשמי על פי בדיקות פונקציונליות2. אף על פי כן, מספר מאמרים פורצי דרך הראו את התועלת של ציטומטריית זרימה לזיהוי HSCs. באמצעות שימוש בסמנים מוגבלים בפני השטח של התא, ניתן להבחין בין אוכלוסיות המטופויטיות המועשרות מאוד ב-HSCs3. ציטומטריית זרי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
בעלי החיים המשמשים בפרוטוקול זה שוכנו במתקן בעלי החיים i3S בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים במחזור אור-חושך של 12 שעות ובסביבה מבוקרת טמפרטורה. גישה חופשית לצ'או מכרסמים סטנדרטי ומים סופקה. כל בעלי החיים קיבלו טיפול הומני על פי הקריטריונים שהותוו על ידי הפדרציה האירופית של אגודות מדעי חיות מעבדה לטיפול וטיפול בחיות מעבדה (הנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU). ההליך הניסיוני שבוצע על בעלי החיים (המתת חסד) אושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים i3S (ref. DD_2019_15) ועל ידי Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. פרטים על החומרים בהם נעשה שימוש בפרוטוקול זה ניתן למצוא בטבלת החומרים.
1. הכנת תמיסות והכתמת קוקטיילים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
חלקות מייצגות של ניתוח ציטומטריית זרימה של HSCs ו-MPPs בעכבר C57Bl/6 בוגר צעיר ובריא מוצגות באיור 1. אסטרטגיית הגאטינג עוקבת אחר המינוח ההרמוני האחרון שהוצע על ידי ISEH13. כאשר מנתחים את ההשפעה של הפרעה, כגון זיהום או סרטן, חשוב להשתמש בעכבר בקרה כהפניה לשערים רגילים. פקדי פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) יכולים להיות שימושיים במיוחד לתיחום גבולות השערים, אך יש לציין כי הגדרה עיוורת של גבולות שערים המבוססים על FMOs עלולה להשמיט תאי מטרה או לכלול תאים שאינם תאי יעד. לדוגמ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בעוד שהפרוטוקול המתואר הוא פשוט וקל לביצוע, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לשלבים ספציפיים. לדוגמה, בעת קבלת BM סמוק (שלב 5.2), אין לחרוג מהנפח או מספר הפעמים המצוינות כדי להעביר PBS 2% FBS דרך החלק הפנימי של החלק המרכזי של העצם, מכיוון שהדבר עלול לגרום לזיהום משמעותי של הדגימה הסמוקה על ידי אוכלוסיות תאים אנדוסטליים.
שינויים בפרוטוקול יכולים להיעשות כדי להקל על ביצועו על ידי החוקר. במיצוי דגימה (סעיף 2), רגליים ו / או עצמות ניתן לאחסן PBS 2% FBS ב 4 ° C עד 24 שעות לפני המשך עיבוד הדגימה וניתוח. עם.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
LM נתמך על ידי מענק מקרן הזיכרון ליידי טאטא. JR נתמך על ידי מלגת דוקטורט מ- Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; ממשק משתמש של מלגת FCT/BD/150833/2021). ML נתמכה על ידי מלגת דוקטורט של FCT (מלגת FCT 2021.04773.BD). DD נתמך על ידי מענקים מהאגודה האמריקאית להמטולוגיה, קרן Pablove, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) והאגודה הפורטוגזית להמטולוגיה. אנו מודים לתמיכה של ד"ר קטרינה מיירלס ואמיליה קרדוסו ממתקן TRACY ב-i3s.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נוגדן Alexa Fluor 647 נגד עכבר CD54/ICAM-1 נוגדן | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| נוגדן APC/Cyanine7 נגד עכבר CD117 (c-kit) | BioLegend | 105826 | |
| נוגדן APC/Cyanine7 נגד עכבר CD45 נוגדן | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 נגד עכבר TER-119/תאי אריתרואיד | BioLegend | 116223 | |
| ביוטין נגד עכבר CD3ε נוגדן | BioLegend | 100304 | |
| ביוטין נגד עכבר CD4 נוגדן | BioLegend | 100404 | |
| ביוטין נגד עכבר CD8a נוגדן | BioLegend | 100704 | |
| ביוטין נגד עכבר Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) נוגדן BioLegend | 108404 | ||
| ביוטין נוגדן נגד עכבר TER-119/תאי אריתרואיד | BioLegend | 116204 | |
| ביוטין נגד עכברים/נוגדן CD11b אנושי | BioLegend | 101204 | |
| נוגדן ביוטין נגד עכברים/אנושי CD45R/B220 נוגדן | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 נגד עכבר CD150 (SLAM) נוגדן | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 חרוזים צבעוניים | BD Biosciences | ||
| Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| סרום בקר עוברי, מוסמך, מושבת בחום, מאושר על ידי האיחוד האירופי, מקור דרום אמריקה | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| עכבר לפטין R נוגדן ביוטיניל | R& מערכות D | BAF497 | |
| NucBlue מגיב תאים קבועים (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | מגיב DAPI נוגדן |
| אנדומוצין נגד עכבר | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE נגד עכבר Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 נוגדן CD31 נגד עכבר | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 נגד עכבר CD48 נוגדן | BioLegend | 103424 | |
| PerCP נגד עכבר Ly-6A/E (Sca-1) נוגדן | BioLegend | 108122 | |
| טבליות מלח פוספט (PBS) Merck | Life Science | P4417 | |
| נוגדן מטוהר נגד עכבר CD16/32 BioLegend | 101302 | ||
| RBC מאגר ליזה 10x | BioLegend | 420302 | |
| צבע זומבי סגול לתיקון BioLegend | 423114 | צבע פלואורסצנטי |
מקורות
- Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
