הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים לריצוף RNA חד-תאי מלב עכבר בוגר לאחר אוטם שריר הלב

2.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64290

⸱

3 בפברואר 2023

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Cardiovascular Intervention and Regenerative Medicine of Zhejiang Province, 2Department of Cardiology, Sir Run Run Shaw Hospital, School of Medicine, Zhejiang University Hangzhou

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד כמות מספקת של לא-קרדיומיוציטים בודדים עם כדאיות גבוהה מלב עכבר לאחר אוטם שריר הלב (MI). זה יכול לשמש לריצוף תא בודד לאחר מכן, ניתוח ציטומטריית זרימה, ותרבית תאים ראשונית.

תקציר

אוטם שריר הלב (MI) היא אחת ממחלות הלב וכלי הדם הנפוצות ביותר, עם תמותה גוברת ברחבי העולם. לא-קרדיומיוציטים מהווים יותר ממחצית מכלל אוכלוסיית תאי הלב, והם תורמים לפיצויים אדפטיביים על פגיעה בשריר הלב, כולל תגובות דלקתיות, תיקון רקמות והיווצרות צלקות. כדי לחקור את המיקרו-סביבה הלבבית שלאחר MI, ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) נמצא בשימוש נרחב לזיהוי סוגים שונים של תאי לב ותקשורת בין-תאית. בין ההליכים של הכנת דגימת scRNA-seq, הכנת תרחיף התא הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר, מכיוון שיכולת הקיום של התא יכולה להשפיע על איכות תוצאות scRNA-seq. לכן, תכננו פרוטוקול ניסיוני להכנת תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים מלבבות עכברים לאחר MI עם דגש נוסף על שיפור יכולת הקיום של התא על ידי בחירת אנזימי עיכול עדינים, שליטה בזמן העיכול ויישום מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS). לבסוף, בודדנו תאי CD45+ מתרחיף התאים שאינו קרדיומיוציטים המתקבל באמצעות פרוטוקול זה, ולאחר מכן ביצענו scRNA-seq.

מבוא

אוטם שריר הלב (MI) היא אחת ממחלות הלב וכלי הדם הנפוצות ביותר, ותמותה עולה ברחבי העולם1. MI נגרמת על ידי אספקת דם לא מספקת לשריר הלב שמסביב, אשר יכול להיות תוצאה של חסימת עורקים כליליים המתרחשת עם קרע רובד טרשתי. למרות שהתערבות כלילית מלעורית (PCI) הפחיתה את שיעורי התמותה של חולי MI חריפים, השכיחות הגבוהה של אי ספיקת לב לאחר MI נותרה בעיה2. הפתופיזיולוגיה העיקרית העומדת בבסיס אי ספיקת לב לאחר MI היא תגובת הפיצוי של הגוף לפגיעות לב, הכוללת החלפת שריר הלב המת בצלקות פיברוטיות שאינן מתכווצות. תגובות אדפטיביות אלה מסתמכות באופן משמעותי על דלקת מקומית המתווכת על ידי אינטראקציות בין סוגי תאים מרובים ותאי רקמת לב, ודלקת זו נחשבת כיום כיעד טיפולי פוטנציאלי להפחתת היווצרות צלקות פיברוטיות, ובכך להגן מפני אי ספיקת לב שלאחר MI 3,4. באופן מעניין, המיקרו-סביבה באתר אוטם חווה מעבר תלוי זמן בסוגי התאים החודרים ובתפקודים בשלבים שונים של MI 1,5. מחקרים רבים הראו כי לא-קרדיומיוציטים (למשל, תאי מערכת החיסון, פיברובלסטים ותאי אנדותל) ממלאים תפקידים מרכזיים בדלקת שלאחר MI ובתיקון רקמות 5,6. בשנים האחרונות, ריצוף חד-תאי נמצא בשימוש נרחב ככלי רב עוצמה להבהרת המעורבות והתפקודים של לא-קרדיומיוציטים במיקרו-סביבה 7,8 שלאחר MI. זה מספק תובנות לגבי הפתופיזיולוגיה של פציעה ותיקון לאחר MI ופיתוח טיפולים פוטנציאליים נגד אי ספיקת לב לאחר MI.

ריצוף RNA בתפוקה גבוהה (RNA-Seq) היא טכניקה המשמשת לחקר תעתיקים שלמים בפירוט רב באמצעות ריצוף הדור הבא (NGS)7,8,9. לאחרונה, הפיתוח של scRNA-Seq חולל מהפכה בתחום המחקר הביו-רפואי. בהשוואה לריצוף קונבנציונלי בתפזורת, scRNA-Seq מנתח פרופילי ביטוי גנים והטרוגניות שעתוק ברמת התא הבודד 7,8. טכניקה זו מקדמת באופן משמעותי את המחקר של הפתופיזיולוגיה התאית של MI 9,10 על ידי זיהוי סוגי תאים שונים במחזור הדם במיקרו-סביבה שלאחר MI וחשיפת האינטראקציה בין קרדיומיוציטים ושאינם קרדיומיוציטים. ממצאים אלה תורמים עוד יותר לחשיפת מטרות טיפוליות חדשות לאי ספיקת לב לאחר MI. באופן כללי, ניסוי הפוסט-MI מבוסס scRNA-seq כולל שלושה חלקים עיקריים: (1) ביסוס מודל בעלי חיים פוסט-MI; (2) הכנת השעיית התא; ו-(3) ריצוף מדגם וניתוח נתונים. באופן בולט, הכנת תרחיף התא היא השלב הקריטי ביותר בהכנת ניסוי scRNA-Seq מכיוון שאיכות תרחיף התא קובעת את דיוק התוצאות.

פרוטוקול זה נועד לחלץ תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים מרקמת הלב שלאחר MI; באופן משמעותי, הפרטים הספציפיים לשמירה על כדאיות התא ורזולוציה נכללים. בינתיים, את הציוד המשמש בפרוטוקול זה, כגון ערכות ניתוח לעכברים, מנשמי מכרסמים וצנטריפוגות, ניתן למצוא ברוב מרכזי הניסויים בבעלי חיים ובמעבדות ביו-רפואיות, ולכן עלות הניסוי של פרוטוקול זה נמוכה יחסית. יתר על כן, אם לוקחים בחשבון נקודות זמן ואתרים של אוטם כמשתנים, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לדמות מגוון רחב של תרחישים קליניים, במיוחד עבור סיבוכים לאחר MI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה באוניברסיטת ג'ג'יאנג ואושרו על ידי הוועדה המייעצת לבעלי חיים באוניברסיטת ג'ג'יאנג.

1. ניתוח קשירת עורקים כליליים יורדת קדמית שמאלית (קשירת LAD)

הערה: עכברי C57BL/6J זכרים בני שמונה שבועות שימשו כמודלים. הלבבות נקצרו שבועיים לאחר MI. ניתוח קשירת עורקים כליליים יורד קדמי שמאלי בוצע כמתואר קודם והדגים11.

  1. יש לחטא את כלי הניתוח באתנול 70% לפני הניתוח.
  2. לשקול את העכבר, ולאחר מכן להרדים את העכבר עם זריקות intraperitoneal של 1% נתרן pentobarbital (50 מ"ג / ק"ג). שימו לב לרפלקס צביטת הבוהן ומדדו את קצב הנשימה כדי להעריך את עומק ההרדמה במהלך ההליך.
  3. הניחו את העכבר על שולחן הניתוחים עם כרית חימום בטמפרטורה של 37°C. השתמש משחה אופתלמית כדי למנוע התייבשות העין.
  4. לנטרל את החזה והצוואר השמאלי שלו עם קרם depilatory, ולהשתמש בצמר גפן כדי להסיר שערות. יש לחטא את עורו ביודופור, ולאחר מכן לשתות 70% אלכוהול כדי לנקות את האזור שלוש פעמים.
  5. ביצוע חתך צוואר הרחם בקו האמצע (0.8-1.0 ס"מ) תחת מיקרוסקופ. הפרידו את העור, השרירים והרקמה המקיפים את קנה הנשימה, ולאחר מכן הכניסו צינורית 20 גרם לקנה הנשימה.
    הערה: יש להתבונן בעת החדרת הצינורית לקנה הנשימה במבט מיקרוסקופי כדי לוודא שהצינורית אינה מוחדרת לוושט.
  6. חבר את העכבר למאוורר מכרסם המוגדר בנפח גאות של 0.2 מ"ל עם 150 פעימות לדקה.
  7. חותכים את חזה העכבר בצורה אלכסונית לאורך קו אמצע הקלאוויקולר בעזרת מספריים סטריליים. לנתח את הרקמה תת עורית כדי לחשוף את הצלעות.
  8. השתמש מספריים סטריליים לחתוך את העור באלכסון לאורך קו אמצע clavicular שמאל (0.8-1.0 ס"מ). בצע בית החזה השמאלי כדי להפריד את הצלעות השלישית והרביעית כדי לחשוף את הלב. השתמש במסיר צלעות לקבלת תצוגה ברורה.
  9. פתח את קרום הלב עם מלקחיים מעוקלים, ולאחר מכן לקשור את העורק היורד הקדמי השמאלי (מתחת לנספח אטריום שמאל) באמצעות תפר משי 7-0. קיר קדמי חיוור של החדר השמאלי מצביע על כך שזילוח שריר הלב נקטע בהצלחה.
  10. שחררו את מסיר הצלעות, ותפרו את חתך בית החזה בשכבות עם תפר משי 5-0 תוך הוצאת אוויר מהחזה. תפרו את החתך בצוואר בתפר משי 5-0.
  11. הסר את צינור קנה הנשימה מהעכבר ברגע שהנשימה הספונטנית שלו משוחזרת. הזרקה intraperitoneally 0.5 מ"ל של מלח סטרילי מחומם מראש. הזריקו buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) כל 12 שעות תת עורית כדי למזער את הכאב.
  12. לבסוף, הניחו את העכבר על כרית החימום כדי להמתין להחייאה. עקוב אחר העכבר כדי לוודא שהוא אינו סובל מקוצר נשימה מוגזם או דימום באמצעות תצפית חזותית.
  13. החזירו את העכבר לכלוב שלו לאחר שהוא מתעורר. בשבוע הראשון, עקבו אחר העכבר מדי יום כדי לוודא שהרגלי הניידות, הטיפוח והאכילה שלו מספקים. על פי צרכי הניסוי, לקצור את הלב בנקודות זמן שונות לאחר MI.
    הערה: בפרוטוקול זה, התרחיף החד-תאי הוכן עם הלב שבועיים לאחר MI.

2. הכנת ההשעיה של תא בודד לב

  1. הכנת הפתרונות והמדיה
    1. חיץ דיסוציאציה של רקמת הלב: יש לערבב 10 מ"ג של collagenase IV (600 U/mL), 5 מ"ג של dispase II (0.5 U/mL) ו-50 μL של DNase I (100 מיקרוגרם/מ"ל) ב-5 מ"ל של RPMI 1640. יש לחמם מראש את הטמפרטורה הבינונית ל-37°C באמבט מים לפני השימוש.
    2. חיץ לשטיפת תאים: הכינו 1% BSA או 10% FBS במי מלח חוצצי פוספט (PBS, PH 7.4), ושמרו על טמפרטורה של 4°C או על קרח.
    3. פתרון זילוח: PBS טרום קירור (PH 7.4) כתמיסת זילוח.
    4. מאגר ליזה של תאי דם אדומים (RBC): השתמש במאגר הליזה של RBC כפי שצוין על-ידי היצרן.
      הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימת הריאגנטים והציוד שנעשה בהם שימוש במחקר זה.
  2. הרדימו את העכבר על ידי הזרקת נתרן פנטוברביטלי תוך צפקי (150 מ"ג/ק"ג).
  3. דיסקציה של הלב
    1. הניחו את העכבר במצב שכיבה על ידי קיבוע הגפיים האחוריות שלו במקומן בעזרת סרט הדבקה.
    2. רססו את הגוף באתנול 70%, ולאחר מכן חתכו אנכית דרך עור הבטן והשרירים תוך הימנעות מפירסינג בכבד. פתחו בזהירות את בית החזה תוך הימנעות מניקוב הלב.
    3. השתמש PBS מקורר מראש (PH 7.4) כדי לנקב את החדר השמאלי עד נוזל זילוח חסר צבע הוא ציין (כ 15 מ"ל של PBS [pH 7.4] נדרש).
    4. הרימו בעדינות את הלב מבית החזה בעזרת מלקחיים, וחתכו את הרקמה העודפת המחוברת לחלק החיצוני של הלב בעזרת מספריים אופתלמיים. מקם את הלב ב 1 מ"ל של PBS מקורר מראש (PH 7.4) בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
  4. דיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב
    1. מעבירים את לב העכבר לבאר אחת של צלחת בת 24 בארות עם 150 מיקרוליטר של חיץ הדיסוציאציה של רקמת הלב המונח על קרח, וחתכו אותו לחתיכות קטנות (~ 1 מ"מ) בעזרת מספריים.
    2. מעבירים את רקמת הלב הטחונה לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל עם 5 מ"ל של חיץ הדיסוציאציה של הרקמה.
      הערה: נפח החיץ המומלץ לדיסוציאציה של רקמת הלב הוא 5 מ"ל ללב.
    3. הניחו את צינור הצנטריפוגה בשייקר הגומלין התרמוסטטי החשמלי ב-125 סל"ד למשך שעה אחת ב-37°C. מפטמים את מתלה הרקמה למעלה ולמטה 10 פעמים כל 20 דקות.
    4. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר רקמות לא מעוכלות וגושים. הוסף 25 מ"ל של חיץ שטיפת התא כדי לשטוף את הצינור המקורי, ולאחר מכן להעביר אותו כדי לשטוף את מסננת התא. לאחר מכן, סנן את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להסיר עוד יותר גושי תאים.
    5. צנטריפוגה את מתלה התא המסונן ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופר-נטנט ולאחר מכן השהו מחדש את דגימת התא במאגר ליזה RBC 1x למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    6. הוסף נפח גדול פי ארבעה של מאגר שטיפת התא, וצנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
    7. הסר את supernatant, ו resuspend את התאים ב 10 מ"ל של מאגר שטיפת התא. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    8. הסר את supernatant, ו resuspend את התאים ב 1 מ"ל של מאגר שטיפת התא.
    9. ערבבו 18 μL של תרחיף התא עם 2 μL של תמיסת צביעה של תפוז אקרידין (AO)/פרופידיום יודיד (PI) (9:1), והוסיפו 10 μL של התערובת לשקופית תא ספירה. הערך את מספרי התאים ואת הכדאיות באמצעות מונה תאים אוטומטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תרחיף חד-תאי בעל חיוניות גבוהה הושג על ידי יישום סעיף 2 לפרוטוקול זה. אולם עדיין ניתן היה לצפות במקטעי תאים (איור 1A); לפיכך, מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) בוצע כדי לשפר עוד יותר את האיכות16. לאחר FACS, גודל התא הממוצע מצטמצם מ-9.6 מיקרומטר ל-9.1 מיקרומטר ( טבלה 1), מה שמרמז על כך שניתן להפחית ביעילות את חלקם של מקטעי התאים בתרחיף התא על-ידי FACS (איור 1B). אסטרטגיית ה-gating המשמשת עבור ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה נועד לתאר פרוטוקול לבידוד יחיד שאינו קרדיומיוציטים מלבבות עכברים לאחר MI. ניתן ליישם את הפרוטוקול כדי לבודד סוגים שונים של תאים במיקרו-סביבה שלאחר MI באיכות גבוהה, כולל תאי מערכת החיסון, תאי אנדותל ופיברובלסטים. שלושה גורמים חיוניים חיוניים להשגת תרחיף תאים איכותי לריצוף תא יחיד. הראשון הוא הגדרת העיכול האנזימטי. חשוב לשלוט בזמן העיכול ובנפח ובריכוז של אנזימי העיכול כדי להבטיח הן את יכולת הקיום של התאים והן את יעילות הבידוד. במקרה זה, הגדלנו כראוי את ריכוז האנזים והארכנו את זמן העיכול. כאן, אנו ממליצים על משך העי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מדעי הטבע של פרובינציית ג'ג'יאנג (LQ22H020010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כתום אקרידין / פרופידיום יודיד כתםלוגו ביוסיסטמותF23001
אוטומטי  סלולרי  CounterLogos biosystemsL20001
בקר סרום אלבומיןServicebioG5001אפקט ציטו-מגן
שקופיות ספירת תאים לוגוסביוסיסטמסL12001
קולגנאז סוג IVGibco17104019אנזימי עיכול
Dispase IISigmaD4693אנזימי עיכול
Dnase IRoche11284932001למנוע התקבצות תאים
של בז  40μ m מסננת תאיםFalcon352340הסר גושי תאים
בז  70μ m מסננת תאיםFalcon352350הסר רקמות לא מעוכלות וגושים
תאי זרימהבקמן קולטרB25982
יודופורOU QING SI
מחזיק מחט10054963976859 FST12061-01
מלקחיים עינייםRWDF14012-10
מספריים עינייםRWDS11036-08
מי מלח חומציים פוספט ServicebioG4202-500ML
RBC מאגר ליזהBeyotimeC3702-120 מ"להסר תאי דם אדומים
מפסק צלעותFST17005-04
מאוורר מכרסמיםהרווארד730043
RPMI 1640 בינוניGibco11875093ממס  תמיסה של אנזים
מספריים סטרילייםRWDS14014-10
סדרן

מקורות

  1. Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).
  2. Gu, J., et al. Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727(2021).
  3. Frangogiannis, N. G. The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling. Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).
  4. Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444(2014).
  5. Tzahor, E., Dimmeler, S. A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment. Science. 377 (6610), 4443(2022).
  6. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  7. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  8. Massaia, A., et al. Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167(2018).
  9. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
  10. Jin, K., et al. Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction. Small Methods. 6 (3), 2100752(2022).
  11. Tombor, L. S., et al. Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction. Nature Communications. 12 (1), 681(2021).
  12. Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581(2011).
  13. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).
  14. Gladka, M. M., et al. Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
  15. Garcia-Flores, V., et al. Preparation of single-cell suspensions from the human placenta. Nature Protocols. , (2022).
  16. Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
  17. Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
  18. Hua, X., et al. Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis. Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).
  19. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
  20. Vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14, 935-936 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תליה של תאים שאינם קרדיומיוציטיםאוטם שריר הלב בעכברבידוד תאי לבמיון תאים מופעל פלואורסצנציההערכת חיוניות תאיםפירוק רקמהפרופיל תאי מערכת החיסוןמיקרו-סביבה לבביתספירת תאים
הכנת תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים לריצוף RNA חד-תאי מלב עכבר בוגר לאחר אוטם שריר הלב
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.