מאמר זה מתאר את השימוש במצלמה אופטית חדשה ומהירה עבור הדמיה מקרוסקופית פוטולומינסנציה לכל החיים של דגימות פולטות דעיכה ארוכה. מתוארים תהליכי האינטגרציה, רכישת התמונה והניתוח, לצד הכנה ואפיון של חומרי החיישן להדמיה ויישום ההדמיה בחקר דגימות ביולוגיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Fluorescence Lifetime Macro Imager עבור יישומים ביו-רפואיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מאמר זה מציג מצלמת פוטולומינסנציה חדשה שנועדה למפות את ריכוז החמצן המולקולרי (O 2) בדגימות זרחן שונות, החל מציפויים רגישים ל-O 2 במצב מוצק ועד לדגימות רקמות חיות של בעלי חיים המוכתמות בבדיקות מסיסות רגישות ל-O2. בפרט, נעשה שימוש בגשושית ננו-חלקיקית המבוססת על אינפרא-אדום קרוב NanO2-IR, הניתנת לגירוי באמצעות דיודה פולטת אור (LED) של 625 ננומטר ופולטת ב-760 ננומטר. מערכת ההדמיה מבוססת על מצלמת Timepix3 (Tpx3Cam) ועל מתאם אופטו-מכני, הכולל גם מאיץ תמונה. O2 phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM) נדרש בדרך כלל עבור מחקרים שונים, אך לפלטפורמות הנוכחיות יש מגבלות בדיוק שלהן, בגמישות הכללית ובשימושיות שלהן.
המערכת המוצגת כאן היא מצלמת תמונה מהירה ורגישה במיוחד, הבנויה על חיישן אופטי משולב ומודול שבב קריאה, Tpx3Cam. הוא הוכח כמפיק אותות זרחן בעוצמה גבוהה וערכי חיים יציבים מדגימות רקמת מעי מוכתמת על פני השטח או מקטעים מוכתמים תוך לומינלית של המעי הגס ומאפשר מיפוי מפורט של רמות O2 ברקמה בכ-20 שניות או פחות. כמו כן מוצגים ניסויים ראשוניים על הדמיה של היפוקסיה בגידולים מושתלים בבעלי חיים חסרי הכרה. אנו גם מתארים כיצד ניתן להגדיר מחדש את מכשיר ההדמיה לשימוש עם חומרים רגישים O2 המבוססים על צבעי Pt-פורפירין באמצעות נורית LED של 390 ננומטר לעירור ומסנן פס פס של 650 ננומטר לפליטה. בסך הכל, נמצא כי מכשיר ההדמיה PLIM מפיק מדידות כמותיות מדויקות של ערכי חיים עבור הגשושיות בהן נעשה שימוש ומפות דו-ממדיות בהתאמה של ריכוז O2 . זה גם שימושי עבור הדמיה מטבולית של מודלים רקמות ex vivo ובעלי חיים חיים.
מבוא
O 2 הוא אחד הפרמטרים הסביבתיים המרכזיים למערכות חיות, והידע על התפלגות O 2 והדינמיקה שלו חשוב למחקרים ביולוגיים רבים 1,2,3. הערכת חמצון רקמות באמצעות בדיקות זרחניות 4,5,6,7,8 ו- PLIM 9,10,11,12,13 צוברות פופולריות במחקר ביולוגי ורפואי 3,9,14,15,16
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים עם בעלי חיים בוצעו תחת אישורים שהונפקו על ידי הרשות הרגולטורית למוצרי בריאות (HPRA, אירלנד) בהתאם לדירקטיבה של מועצת הקהילות האירופית (2010/63/EU) ואושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת קולג 'קורק.
1. הכנת מדגם
- מכתים עם בדיקה של דגימות רקמות חיות ex vivo
- עבור יישומי ex vivo , השתמש בדגימות רקמה מבודדות טריות מעכברות Balb/c בנות 4 שבועות.
- ביום הניסוי, הרדימו עכבר על ידי עריפת ראש, ונתחו במהירות שברים של המעי הגס, בגודל של כ -10 מ"מ. שטפו אותם מיד עם חיץ PBS, הניחו בתווך DMEM בתוספת חיץ Hepes של 10 mM (pH 7.2), ודגרו בטמפרטורה של37....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עבור יישומי הדמיה ex vivo , שברי רקמות מעיים הוכתמו על ידי יישום מקומי של בדיקת NanO2-IR בצד הסרוסלי של הרקמה. עבור צביעה עמוקה יותר, 1 μL של הבדיקה הוזרק לתוך לומן. במקרה האחרון, דופן המעי בעובי 0.2-0.25 מ"מ הגנה על הגשושית מפני המצלמה. שני תהליכי הצביעה מודגמים באיור 2A.
העוצמה המתקבלת ותמונות PLIM מוצגות באיור 2B-G. הצבעים משקפים בבירור את ההבדל בערכי החיים, ומכאן, את ההבדל בחמצון של הצדדי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקולים לעיל נותנים תיאור מפורט של הרכבת ה- imager החדש ופעולתו במצב FLIM/PLIM של מיקרו-שנייה. מצלמת Tpx3Cam מהדור החדש מבוססת TCSPC, המשולבת באמצעות המתאם האופטו-מכני Cricket עם חיישן התמונה, מסנן הפליטה ועדשת המאקרו, מייצרת מודול אופטי יציב, קומפקטי וגמיש וקל לתפעול. ההדמיה הוכחה כבעלת ביצועים טובים עם מגוון דגימות שונות ומשימות אנליטיות, שכללו אפיון חומרים זרחניים והדמיית רקמות חיות O2 . בניסויי ההדמיה נעשה שימוש בבדיקה המסיסה המבוססת על אינפרא-אדום קרוב Pt(II)-benzoporphyrin, NanO2-IR, וחיישני מצב מוצק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
תודות
תמיכה כספית לעבודה זו מקרן המדע אירלנד, מענקי SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 ו-18/SP/3522, ומחקר סרטן פורץ דרך (אונקולוגיה מדויקת אירלנד) זוכה להכרת תודה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 627 ננומטר LED | חלקי אקספרס | ניתן להחלפה ב-LED שונה על סמך אורך גל העירור של החיישן. משומש 390 ננומטר LED לצבעי Pt-porphyrin. | |
| 760 ± מסנן פליטה של 50 ננומטר | אופטיקה אדמונד | 84-788 | ניתן להחלפה במסנן אחר המבוסס על אורך גל הפליטה של החיישן. משומש 650 ± מסנן פס פס 50 ננומטר לצבעי Pt-porphyrin. |
| עכברי Balb / c | Envigo, בריטניה | Balb / c | |
| קופסה שחורה | Thorlabs | XE25C9 / M | |
| מתאם קריקט | פוטוניס | צרצר -2 | |
| CT26 תאים | ATCC | CT26. WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | ניתן להשתמש גם במדיה אחרת |
| ImageJ Software | ImageJ | תוכנת ניתוח תמונות בחינם. ניתן להוריד מ: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 מגביר תמונה עם מסך זרחן P47 | Photonis | PP0360EF | |
| מיני כלים | Sarstedt | 83.3900.300 | קוטר 35 מ"מ |
| סרט פלסטיק מיילר, 75 מיקרון | RS אירלנד | 785-0795 | ניתן להשתמש גם במצעי פלסטיק |
| תוצרת בית | NanO2-IR | n/a | ניתן לסנתז את הגשושית על פי השיטה שפורסמה 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. הדמיה in vivo של פעילות חילוף החומרים במוח באמצעות בדיקה זרחנית רגישה לחמצן. J שיטות נוירושי. 2013 יוני 15; 216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 25 באפריל. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' או מסופק על ידי המעבדה שלנו. |
| עדשת NMV-50M11 אינץ' 50 מ"מ | Navitar | ניתן להשתמש בעדשות אחרות התואמות ל-C-mount adators לוח | |
| לחם אופטי | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dish | Sarstedt | 82.1472.001 | קוטר 92 מ"מ |
| ספק כוח | Tenma | 72-10495 | |
| מחולל דופק | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | מסופק על ידי ASI יחד עם Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, ניתן להוריד מ: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
מקורות
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
