מאמר שיטה

תאים דמויי מיקרוגליה אנושית: התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ובדיקת פאגוציטוזה של תאים חיים במבחנה באמצעות סינפטוזומים אנושיים

DOI:

10.3791/64323

⸱

18 באוגוסט 2022

 , 
1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Translation Science Program, Morningside Graduate School of Biomedical Sciences, University of Massachusetts Chan Medical School

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את תהליך ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) לתאים דמויי מיקרוגליה לצורך ניסויים במבחנה . אנו כוללים גם הליך מפורט ליצירת סינפטוזומים אנושיים מנוירונים מוטוריים נמוכים שמקורם ב- iPSC שיכולים לשמש כמצע למבחני פאגוציטוזה במבחנה באמצעות מערכות הדמיה של תאים חיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוגליה הם תאי החיסון המקומיים ממוצא מיאלואידי המקיימים הומאוסטזיס במיקרו-סביבה של המוח והפכו לשחקן מפתח במחלות נוירולוגיות מרובות. חקר המיקרוגליה האנושית בבריאות ובמחלות מהווה אתגר בשל האספקה המוגבלת ביותר של תאים אנושיים. ניתן להשתמש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם באנשים אנושיים כדי לעקוף מחסום זה. כאן, הוא מדגים כיצד להתמיין תאי גזע פלוריפוטנטיים עצביים אנושיים לתאים דמויי מיקרוגליה (iMGs) לצורך ניסויים במבחנה . iMGs אלה מציגים את התכונות הצפויות והפיזיולוגיות של מיקרוגליה, כולל מורפולוגיה דמוית מיקרוגליה, ביטוי של סמנים תקינים ופאגוציטוזה פעילה. בנוסף, מסופק תיעוד לבידוד ותיוג של מצעי סינפטוזום שמקורם בנוירונים מוטוריים נמוכים שמקורם ב-iPSC אנושי (i3LMNs). בדיקת הדמיה אורכית של תאים חיים משמשת לניטור בליעה של סינפטוזומים אנושיים המסומנים בצבע רגיש ל-pH, ומאפשרת לחקור את היכולת הפאגוציטית של iMG. הפרוטוקולים המתוארים כאן ישימים באופן נרחב לתחומים שונים החוקרים את הביולוגיה של המיקרוגליה האנושית ואת תרומתה של המיקרוגליה למחלות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוגליה הם תאי מערכת החיסון המתגוררים במערכת העצבים המרכזית (CNS) וממלאים תפקיד מכריע בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית. מיקרוגליה חשובה גם במוח הבוגר לשמירה על הומאוסטזיס ולתגובה פעילה לתהליכי טראומה ומחלות. ראיות מצטברות מראות כי מיקרוגליה הם תורמים מרכזיים לפתוגנזה של מחלות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות מרובות 1,2. אף על פי שהידע הנוכחי על ביולוגיה של מיקרוגליה נגזר בעיקר ממודלים של עכברים, מחקרים אחרונים הבהירו הבדלים חשובים בין מורין למיקרוגליה אנושית, והדגישו את הצורך בפיתוח טכנולוגיות לחקר הגנטיקה והתפקודים הביולוגיים של המיקרוגליה האנושית 3,4. בידוד של מיקרוגליה מרקמה ראשונית מנותקת יכול לשנות באופן חמור את תכונות המיקרוגליה5, מה שעלול לבלבל תוצאות שנרכשו עם תאים כאלה. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים ל-iMGs, ובכך לספק מערכת תרבית תאים לחקר מיקרוגליה אנושית בתנאים בסיסיים. יתר על כן, בדיקת פאגוציטוזה באמצעות מערכת מודל אנושית מלאה נכללת כאן כאמצעי לחקור את הפונקציונליות של iMGs, הן כמדד בקרת איכות והן כדי להעריך תפקוד לקוי של iMG בהקשר של מחלה.

פרוטוקולים מרובים להתמיינות מיקרוגליה מ- iPSCs הופיעו לאחרונה בספרות 6,7,8,9,10. חסרונות פוטנציאליים של פרוטוקולים מסוימים כוללים תקופות ממושכות או ארוכות של הבחנה, תוספת של גורמי גדילה מרובים ו / או הליכים ניסיוניים מורכבים 6,9,10. כאן מודגמת שיטת התמיינות "ידידותית למשתמש", המשחזרת היבטים של מיקרוגליה אונטוגנית באמצעות התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לתאים מקדימים המכונים מבשרי מקרופאגים פרימיטיביים (PMPs)7,11. PMPs נוצרים כפי שתואר קודם לכן, עם כמה אופטימיזציות המוצגות כאן12. ה-PMPs מחקים מקרופאגים שמקורם בחלמון שאינו תלוי בחלמון, אשר מולידים מיקרוגליה במהלך ההתפתחות העוברית על ידי פלישה למוח לפני סגירת מחסום הדם-מוח13. כדי להבדיל באופן סופי בין PMPs ל-iMGs, השתמשנו בשיטת מונוקולטורה מהירה ופשוטה המבוססת על פרוטוקולים של Haenseler et al. ו-Brownjohn et al., עם כמה שינויים כדי ליצור שיטת בידול יעילה של מיקרוגליה, שבה iMGs מבטאים בחוזקה סמנים מועשרים במיקרוגליה 7,8. ניתן לשכפל שיטת בידול זו במעבדות עם מומחיות בתרבית של iPSCs ועם מטרות מחקר שמטרתן לחקור את הביולוגיה של מיקרוגליה באמצעות מערכת מודל אנושית.

מיקרוגליה שמקורה ב-iPSC מהווה מקור רלוונטי ביולוגית של מיקרוגליה אנושית לניסויים במבחנה, והם כלי חשוב לחקר תפקודים קנוניים של מיקרוגליה, כולל פאגוציטוזה. מיקרוגליה הם הפאגוציטים המקצועיים של המוח ושל מערכת העצבים המרכזית, שם הם מנקים פסולת תאים, חלבונים מצטברים ומיאלין14 פגום. מיקרוגליה מתפקדת גם בשיפוץ סינפטי על ידי בליעת סינפסות ובהגנה מפני זיהומים חיצוניים באמצעות פאגוציטוזה של פתוגנים15,16. בפרוטוקול זה, פאגוציטוזה על ידי iMGs מוערכת באמצעות סינפטוזומים אנושיים כחומר לבליעת iMG. לשם כך מתואר תיאור לבידוד סינפטוזומים הנגזרים מ-i3LMNs אנושיים. הסינפטוזומים האנושיים שמקורם ב-i3LMN מסומנים בצבע רגיש ל-pH המאפשר כימות של סינפטוזומים הממוקמים בתוך מדורים חומציים במהלך עיבוד פגוזומים והשפלה במבחנה. בדיקת פאגוציטוזה באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים מוצגת לניטור התהליך הדינמי של בליעת מיקרוגליה בזמן אמת. בדיקה תפקודית זו קובעת בסיס לחקור פגמים אפשריים בפאגוציטוזה מיקרוגליאלית בבריאות ובמחלות באמצעות מערכת אנושית שלמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה חייבים להיות סטריליים, וכל השלבים חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית בתנאים סטריליים. כל קווי ה- iPSC, כמו גם מדיית התחזוקה וההבחנה, מתוארים בטבלת החומרים. שיטת ההבחנה במיקרוגליה המתוארת להלן מבוססת על פרוטוקולים 7,8,12 שפורסמו בעבר עם שינויים חדשים המתוארים כאן.

1. הבחנה במיקרוגליה

הערה: סקירה כללית של הפרוטוקול מסוכמת באיור 1.

  1. תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC)
    הערה: פרטים נוספים המתארים טכניקות של תרבית iPSC ניתן למצוא במקום אחר17.
    1. הפשרה ותחזוקה
      1. הכינו מדיום iPSC, aliquot את המדיום, ואחסנו ב-20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. הפשירו את האליקוטים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס והשתמשו בהם עד שבוע. יש להשאיר את המדיה בטמפרטורת הסביבה למשך שעה אחת לפחות לפני השימוש.
      2. מצפים את הבארות של צלחת 6 בארות על ידי הוספת 1 מ"ל של 10 מיקרוגרם / מ"ל של laminin 521 מדולל DPBS המכיל סידן ומגנזיום18. שומרים את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך שעתיים לפחות או עדיף למשך הלילה. לאחר דילול, לאחסן את laminin ב 4 °C במשך 3 חודשים.
      3. הכינו תמיסת מלאי של מעכב רו קינאז Y27632 (מעכב ROCK) של 10 mM על ידי דילול במים סטריליים. הכינו אליקוטים חד-פעמיים של תמיסת מעכבי ROCK ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה.
      4. הכן 0.5 mM EDTA על ידי דילול פתרון המלאי של 0.5 M EDTA ב- DPBS.
      5. כדי להפשיר בקבוקון של iPSCs קפואים, הניחו את הבקבוקון באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהוא מופשר ברובו. מיד להעביר את התוכן של הבקבוקון לצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל של מדיום iPSC. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך דקה אחת.
      6. שאפו את הסופר-נאטנט והניחו מחדש את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום iPSC המכיל מעכב ROCK 10 μM באיטיות על דופן הצינור כדי למנוע הפרעה למושבות.
      7. הוסיפו 1.5 מ"ל של מדיום iPSC המכיל מעכב ROCK של 10 מיקרומטר לכל אחת מהבארות המצופות והעבירו את המושבות המחודשות טיפה אחר טיפה לבארות המכילות את המדיום.
        הערה: השתמש ב-5-7 טיפות משלב 1.1.1.6 לתחזוקת תרבית, אך התאם את צפיפות הזריעה האופטימלית עבור כל קו iPSC.
      8. פזרו באופן שווה את התאים בבארות על ידי ערבוב ידני של הצלחת מצד לצד ובחזרה לחזית. מניחים את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. למחרת, החלף לחלוטין את המדיום על ידי הוספת מדיום iPSC טרי ללא מעכב ROCK.
      9. לצורך תחזוקה, שנה את המדיום מדי יום עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%.
        הערה: ניתן לתחזק את התאים מבלי להחליף את המדיום למשך יומיים אם מדיום ה-iPSC שבו נעשה שימוש מאפשר לוח זמנים גמיש להזנה. מומלץ להגביל זאת לפעם אחת בכל מעבר ורק אם התאים פחות מ-50% נפגשים.
    2. פיצול
      1. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של DPBS (ללא סידן ומגנזיום).
      2. כדי לעקור את התאים, להוסיף 1 מ"ל של 0.5 mM EDTA ולדגור במשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר עד קצוות מושבות התא להרים מפני השטח של הבאר. לשטוף את התאים שוב עם DPBS ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום iPSC.
      3. נתקו את מושבות התאים על ידי גירודן בעדינות באמצעות מרים תאים. יש לגרד כל אזור בבאר פעם אחת בלבד כדי לא להפריע למושבות.
        הערה: שיטות חלופיות לעקירת המושבות מהבאר ניתן למצוא במקומות אחרים17.
      4. באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל, לאסוף את התאים ולהעביר אותם טיפה אחר טיפה ביחס של 1:6 (תאים לבינוני) לבארות מצופות מראש (כפי שצוין בשלב 1.1.1.2) המכילות 1.5 מ"ל של מדיום iPSC.
  2. התמיינות iPSC לתאים דמויי מיקרוגליה (iMGs)
    הערה: המולקולות הקטנות וגורמי הגדילה מומסים באלבומין בסרום בקר 0.1% מסונן סטרילי ב-DPBS לריכוז מלאי גבוה פי 1,000 מהריכוז הסופי. מומלץ להבדיל בין iPSCs ל-iMGs במהלך מעברים מוקדמים. מומלץ לבצע קריוטיפ שגרתי של קווי iPSC.
    1. הכנת פתרון ציפוי סטנדרטי
      1. הפשרת תמיסת המלאי של מגיב ציפוי מטריצה חוץ-תאית על קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      2. צינורות מיקרוצנטריפוגה Prechill וטיפים פיפטה מסנן ב 4 מעלות צלזיוס.
      3. Aliquot 250 μL של ריאגנט ציפוי מטריצה חוץ-תאית מרוכזת לתוך כל צינור ומיד להניח על קרח. אחסנו את האליקוטים ב-20°C-.
      4. כדי להכין את תמיסת הציפוי, הפשירו את אחד הריאגנטים לציפוי מטריצה חוץ-תאית על קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      5. הוסף 50 מ"ל של DMEM-F12 קר כקרח הממוטב לגידול של תאי גזע פלוריפוטנטיים עובריים ומושרים אנושיים (המכונים DMEM-F12) לצינור חרוטי מוכן מראש ושמור אותו על קרח.
      6. צנן קצה פיפטה של 1 מ"ל על ידי פיפטינג DMEM-F12 קר כקרח למעלה ולמטה מספר פעמים, ולאחר מכן השתמש מיד בקצה הפיפטה כדי להעביר 250 μL של מגיב ציפוי המטריצה החוץ-תאית לתוך הצינור החרוטי המכיל את המדיום DMEM-F12.
        הערה: ניתן לאחסן את תמיסת הציפוי הסטנדרטית למשך שבועיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. היווצרות גוף עוברי (EB)
      1. הכינו EB בינוני שניתן לשמור עליו בטמפרטורה של 4°C למשך עד 4 ימים.
      2. לאחר שה- iPSCs הגיעו למפגש של 80%, נתקו את המושבות על ידי שטיפה עם 1 מ"ל של DPBS והוספת 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה למשך 2 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. נתקו את המושבות באמצעות מרים תאים על ידי גירוד מספר פעמים כדי ליצור מתלה חד-תאי. לאסוף את התאים ולהעביר הכל לצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של DPBS.
      3. צנטריפוגה של התאים ב 500 × גרם במשך דקה אחת, להסיר את supernatant, ו resuse את התאים ב 1 מ"ל של מדיום EB. קח 10 μL של תאים ולדלל 1:1 עם כחול טריפאן. ספרו את התאים בעזרת המציטומטר, ובהתבסס על ספירת התאים, דיללו את מלאי התאים לדילול סופי של 10,000 תאים לכל 100 μL. עבור ציפוי תאים, הוסף 100 μL של התאים המדוללים לכל באר לתוך דבק נמוך, תחתית עגולה, 96 באר.
        הערה: באופן כללי, ניתן לקבל 48 בארות של צלחת 96 בארות מכל באר מפגש של 80% של iPSCs.
      4. צנטריפוגה את הצלחת ב 125 × גרם במשך 3 דקות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 במשך 4 ימים. בצע שינוי חצי-בינוני ביום השני על-ידי שימוש בפיפטה רב-ערוצית ואיסוף עדין של 50 μL של מדיום ישן, ולאחר מכן הוספת 50 μL של מדיום EB טרי.
        הערה: ביום הרביעי, iPSCs ייצרו מבנים תאיים כדוריים המכונים EBs כמתואר בסעיף התוצאות. ניתן להאריך את תהליך ההבחנה של EB עד 7 ימים, במידת הצורך.
    3. יצירת מבשרי מקרופאגים פרימיטיביים (PMPs)
      1. הכינו בסיס PMP בינוני, מסנן סטרילי, ואחסנו אותו ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
      2. מצפים את הבארות של צלחת 6 בארות על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת ציפוי Matrigel קרה כקרח ודגירה ב 37 °C ו 5% CO 2 לפחות2 שעות או עדיף לילה.
      3. ביום הרביעי של התמיינות EB, העבירו את ה-EBs לבארות המצופות במטריגל על ידי איסוף ה-EBs עם קצוות פיפטה של 1 מ"ל (באמצעות פיפטה). פיפטה למעלה ולמטה פעם או פעמיים כדי לנתק את ה- EBs מהבאר. החזק את צלחת 6 הבארות בזווית מוטה כדי לאפשר ל- EBs להתיישב בקצה הבאר.
        הערה: ניתן לצפות תשעה או עשרה EBs לכל ציפוי היטב.
      4. לאחר שכל ה- EBs התיישבו, פיפטה בעדינות והסר את המדיום הישן באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל תוך שמירה על ה- EBs בקצה הבאר. הוסיפו 3 מ"ל של PMP בינוני טרי לכל באר. פזרו באופן שווה את התאים בבארות על ידי ערבוב ידני של הצלחת מצד לצד ובחזרה לחזית. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2.
      5. אין להפריע לצלחת במשך 7 ימים כדי לאפשר ל- EBs להתחבר לתחתית הבאר. לאחר זמן זה, בצע שינוי חצי-בינוני באמצעות מדיום מלא PMP.
        הערה: בשלב זה, רוב ה- EBs צריכים להיות מחוברים לצלחת. ניתן להסיר כל EBs צפים.
      6. לאחר 5-7 ימים, בדוק את ה- EBs תחת מיקרוסקופ שדה אור בהגדלה של פי 4 כדי לוודא שהם מחוברים לתחתית הבארות. שנה את המדיום כמתואר ב- 1.2.3.5. ביום 21, בצע שינוי בינוני מלא עם 3 מ"ל של מדיום שלם PMP.
        הערה: אבות מיאלואידים שצפים בתווך עשויים להיות ניכרים בנקודה זו. תאים אלה צריכים להיות מושלכים במהלך השינוי הבינוני.
      7. ביום ה-28, חפשו תאים עגולים המכונים PMPs בסופר-נטנט ואספו את המדיום המכיל את ה-PMPs באמצעות פיפטה של 10 מ"ל ופיפטור אוטומטי. היזהרו לא להפריע ל-EBs. העבר את ה- PMPs ואת המדיום לצינור חרוטי של 15 מ"ל והמשך כמתואר בשלב 1.2.4.
        הערה: בדרך כלל ניתן לאסוף PMPs מאותו קו iPSC מחמש בארות של צלחת 6 בארות ולאגד יחד בצינור חרוטי יחיד של 15 מ"ל.
      8. הוסף 3 מ"ל של PMP טרי בינוני שלם לתחזוקה נוספת של EBs. מכיוון ש-PMPs מגיחים ברציפות מ-EBs במשך יותר מ-3 חודשים, אספו אותם כל 4-7 ימים (אל תאפשרו למדיום לשנות את צבעו לגוון צהוב) כמתואר בשלבים 1.2.3.7 ו-1.2.3.8.
        הערה: למרות שניתן לאסוף PMPs במשך מספר חודשים, הם עשויים לשנות את הפנוטיפ שלהם עם הזמן.
    4. בידול ל-iMGs
      1. הכינו מדיום בסיס iMG (טבלת חומרים), סננו סטרילי ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שבועות.
      2. לאחר שה-PMPs נאספו לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל, צנטריפוגה שלהם ב-200 × גרם למשך 4 דקות. שאפו את הסופר-נאטנט והחזירו את ה-PMPs באמצעות 1-2 מ"ל של מדיום בסיסי iMG. לספור את התאים באמצעות hemocytometer על ידי לקיחת aliquot קטן דילול 1:1 עם כחול טריפאן.
        הערה: 0.5-1.5 × 106 PMPs מתקבלים בדרך כלל מדי שבוע בהתאם לקו iPSC ולגיל של תרבות EB.
      3. צנטריפוגה של שאר התאים שוב ב 200 × גרם במשך 4 דקות. לדלל את ה-PMPs לריכוז הרצוי כך שהתאים מצופים בצפיפות של ~105/ס"מ2 על צלחות שטופלו בתרבית תאים באמצעות מדיום iMG שלם שהוכן טרי. בצעו החלפה חצי-בינונית באמצעות iMG Complete Medium טרי כל 3-4 ימים במשך 10-12 ימים כדי לאפשר בידול מסוף.
        הערה: בשלב זה, התאים צריכים לרכוש מורפולוגיה דמוית מיקרוגליה. כדי לאשר את המחויבות של PMPs לגורל המיקרוגליה, ניתוח אימונופלואורסצנטי מבוצע כדי לאמת את הביטוי של סמנים מועשרים במיקרוגליה כגון קולטן פורינרגי P2RY12 וחלבון טרנסממברנה 119 (TMEM119)9.
      4. כדי לשמור על בריאות התאים ועל הכדאיות, בצע את כל הניסויים בין הימים 10 עד 12 של התמיינות iMG.

2. בדיקת פאגוציטוזה באמצעות סינפטוזומים אנושיים שמקורם בנוירונים מוטוריים

  1. התמיינות בתיווך גורם שעתוק של נוירונים מוטוריים נמוכים שמקורם ב-iPSC (i3LMNs)
    הערה: קו WTC11 עם הכנסה יציבה של קלטת גורם השעתוק האינדוקטיבי hNIL המכילה את גורמי השעתוק של הנוירוגנין-2 (NGN2), האיון-1 (ISL1) והומיאובוקס 3 (LHX3) של LIM לתוך לוקוס נמל מבטחים CLYBL שימש לתהליך ההתמיינות כפי שתואר קודם לכן17. קו ה-iPSC נשמר כמתואר בשלב 1.1.1 אך עם תנאי הציפוי המתוארים בשלב 1.2.1. כל מגיב ציפוי מטריצה חוץ-תאית יכול לשמש לגידול iPSCs שישמשו להתמיינות עצבית מכיוון שאין צורך בלמינין 521. כל אמצעי התקשורת מאוזנים לטמפרטורת הסביבה למשך שעה אחת לפחות לפני השימוש.
    1. צלחת מעיל 10 ס"מ עם 5 מ"ל של תמיסת ציפוי סטנדרטית כמתואר בשלב 1.2.1.
      הערה: כאן, 3-4 מנות 10 ס"מ שימשו לכל הבחנה.
    2. הכינו בסיס אינדוקציה בינוני, מסנן סטרילי, ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שבועות.
    3. הכינו נוירון בינוני, מסנן סטרילי, ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
    4. הכינו את חיץ הבוראט על ידי ערבוב של 100 mM חומצה בורית, 25 mM נתרן טטרבורט ו-75 mM נתרן כלורי במים סטריליים. התאם את ה-pH ל-8.5 וסנן אותו בצורה סטרילית.
    5. לאחר שה-iPSCs הגיעו למפגש של 80%, שטפו את התאים עם DPBS ונתקו את המושבות על ידי הוספת 0.5 mM EDTA.
      הערה: שתי בארות מספיקות בדרך כלל לכל צלחת בקוטר 10 ס"מ.
    6. דגירה של התאים במשך 4-5 דקות בטמפרטורת הסביבה. הסר את EDTA והוסף 3 מ"ל של DMEM / F12 עם HEPES לכל באר.
    7. לגרד את התאים באמצעות מרים תאים ולהשתמש פיפטה 10 מ"ל כדי להסיר את התאים מתחתית הבאר על ידי pipetting בעדינות למעלה ולמטה 2-3x.
    8. לאסוף את התאים בצינור חרוטי 15 מ"ל צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 3 דקות.
    9. יש לתלות את התאים ב-3 מ"ל של מדיום iPSC המכיל מעכב ROCK של 10 מיקרומטר ולספור אותם באמצעות המציטומטר.
    10. צלחת 1.5 × 106 iPSCs בצלחת מצופה מראש 10 ס"מ עם 12 מ"ל של מדיום iPSC המכיל מעכב 10 μM ROCK.
    11. למחרת, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם DPBS. הוסף 12 מ"ל של מדיום אינדוקציה מלאה שהוכן טרי כדי לגרום לביטוי של גורמי השעתוק.
    12. ביום השני, מצפים כלים בקוטר 10 ס"מ עם תמיסת ציפוי נוירונים של 5 מ"ל שהוכנה בנפחים שווים של 0.1 מ"ג/מ"ל של פולי-D-ליזין ו-1 מ"ג/מ"ל של פולי-ל-אורניתין מדולל בחיץ בוראט. דגירה לילה ב 37 °C ו 5% CO2.
    13. ביום השלישי, שטפו את הכלים המצופים במים סטריליים פי 3, שאפו את המים לחלוטין, ותנו לכלים להתייבש על ידי הטיית הצלחות והשארתם חשופים חלקית בתוך ארון בטיחות ביולוגית למשך שעה לפחות בטמפרטורת הסביבה.
    14. לאחר שהמנות התייבשו לחלוטין, צפו אותן ב-6 מ"ל של מדיום אינדוקציה מלאה בתוספת 15 מיקרוגרם/מ"ל של למינין ו-40 μM BrdU למשך שעה אחת לפחות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
      הערה: טיפול BrdU מומלץ לחסל תאים פעילים מיטוטית ובכך לשפר את טוהר התרביות העצביות. ההשפעות של BrdU על בריאות הנוירונים הן מינימליות.
    15. טפל בתאים המתמיינים עם 3 מ"ל של מגיב דיסוציאציה לכל צלחת 10 ס"מ ודגרה במשך 3-4 דקות בטמפרטורת הסביבה.
    16. הוסף 6 מ"ל של DPBS לצלחת מבלי להסיר את מגיב הדיסוציאציה ופיפט את התאים בתמיסה למעלה ולמטה 4-5x עם פיפטה של 10 מ"ל כדי לנתק את התאים.
    17. לאסוף את מתלה התא ולהעביר אותו דרך מסננת תאים 40 μm לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. יש להוסיף 1 מ"ל של מדיום בסיס אינדוקציה כדי לשטוף את המסננת.
    18. צנטריפוגה התאים ב 300 × גרם במשך 5 דקות. שאפו את המדיום והחזירו את התאים ב-3 מ"ל של מדיום אינדוקציה מלאה המכיל 40 μM BrdU.
    19. לספור את התאים עם hemocytometer. צלחת כ 2.5 × 10 6 תאים לכל צלחת 10 ס"מ לתוך כלים מצופים מראש על ידי דילול התאיםב 6 מ "ל של מדיום אינדוקציה מלאה המכיל 40 μM BrdU מבלי להסיר את תמיסת הציפוי הוסיף בשלב 2.1.14.
    20. ביום הרביעי, שאפו את המדיום, שטפו את התאים פי 1 עם DPBS והוסיפו מדיום אינדוקציה מלא טרי המכיל 40 μM BrdU.
    21. ביום 6, שאפו את המדיום, שטפו את התאים פי 1 עם DPBS, והוסיפו מדיום נוירון בתוספת 1 מיקרוגרם/מ"ל של למינין.
    22. ביום התשיעי, החליפו 1/3 מהמדיום על ידי החלפתו במדיום נוירון טרי בתוספת 1 מיקרוגרם/מ"ל של למינין.
    23. שמור על i 3 LMNs במשך 25 ימים נוספים על ידי ביצוע שינויים בינוניים למחצה עם נוירון בינוני בתוספת 1 מיקרוגרם / מ"ל טרי של laminin כל3-4ימים.
      הערה: בנקודת זמן זו, i3LMNs צריך להציג מורפולוגיה עצבית עם תהליכים ארוכים. נוירונים גם נוטים ליצור גושים או אשכולות של תאים. תיאור מפורט יותר של איך לאמת את ההבחנה של i3LMNs ניתן למצוא במקום אחר17.
  2. טיהור ותיוג סינפטוזום
    הערה: שמור על תנאים סטריליים ובצע את כל השלבים בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
    1. לשטוף i3 LMNs פעמיים עם DPBS.
    2. הוסיפו 2 מ"ל של מגיב תזה של תאים קרים כקרח לבידוד של סינפטוזומים, דגרו על קרח למשך 2 דקות, וגרדו היטב את הנוירונים.
    3. מעבירים את הליזאט למספר מיקרו-צינוריות של 2 מ"ל (~1.5 מ"ל ליזאט לכל צינור) וצנטריפוגה ב-1,200 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: שמור את הצינורות על קרח לאורך כל הליך זה.
    4. לאסוף את supernatant (להשליך את הכדור) צנטריפוגה ב 15,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שמור והשהה את הכדור המכיל את הסינפטוזומים בנפח דומה (כמו הליזאט המקורי) של 5% DMSO ב- DPBS.
      הערה: ניתן לסמן את הסינפטוזומים באופן מיידי עם פלואורופור או לאחסן אותם בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי.
    5. בצע בדיקת חלבון של חומצה ביסינצ'ונית (BCA) עבור כל הצינורות כדי להעריך את התפוקה הכוללת של חלבון בתכשיר הסינפטוזום.
      הערה: ניתן להשתמש במבחנים אחרים למדידת ריכוז החלבון. תפוקת החלבון הכוללת המתקבלת מתכשירים שונים נכללה בטבלה 1 כהפניה. מומלץ לבצע ניתוח כתם מערבי של הכנת הסינפטוזום כדי לאשר את נוכחותם של חלבונים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים. כאן נבחרו הסמן הקדם-סינפטי, סינפטופיזין (SYP), והסמן הפוסט-סינפטי, חלבון הצפיפות הפוסט-סינפטית 95 (PSD95) לניתוח כתמים מערביים כפי שתואר קודםלכן 19.
    6. הכינו תמיסה של 100 mM סודיום ביקרבונט במים, התאימו את ה-pH ל-8.5 ופילטר סטרילי.
    7. יש להפוך 1 מ"ג של אבקה ליופילית של הצבע הרגיש ל-pH לשימוש ב-150 מיקרוגרם של DMSO. הכינו אליקוטים חד-פעמיים ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    8. צנטריפוגה הסינפטוזומים ב 15,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    9. יש לדלל עד 1 מ"ג של סינפטוזומים ב-100 μL של תמיסת סודיום ביקרבונט של 100 mM.
    10. כדי לסמן את הסינפטוזומים, יש להוסיף 1 μL של הצבע הרגיש ל-pH המשוחזר לכל 1 מ"ג של סינפטוזומים ולכסות את התגובה ברדיד אלומיניום כדי להימנע מחשיפה לאור. יש לנער בטמפרטורת החדר למשך שעתיים באמצעות שייקר צינור.
    11. הוסף 1 מ"ל של DPBS לצינור וצנטריפוגה את הסינפטוזומים המסומנים ב 15,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C.
    12. יש להסיר את הסופר-נטנט ולבצע ארבע כביסות נוספות כמתואר בשלב 2.2.11.
    13. לאחר השטיפה והסיבוב הסופיים, הסר את הסופרנטנט ככל האפשר מבלי להפריע לכדור ושלח מחדש את הסינפטוזומים המסומנים עם 5% DMSO ב- DPBS בנפח לריכוז הרצוי (0.7 מיקרוגרם / μL המשמש כאן). מכינים אליקוטים חד-פעמיים ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. הקפידו להימנע מחשיפה לאור לסינפטוזומים המסומנים.
  3. בדיקת פאגוציטוזה של תאים חיים
    1. צלחת 20-30 × 104 PMPs לתוך 96-באר צלחות ב 100 μL של iMG מדיום שלם ולעקוב אחר תהליך ההבחנה במשך 10 ימים כפי שמצוין בשלב 1.2.4.
    2. ביום הבדיקה, הכינו את תמיסת הצביעה הגרעינית על ידי הוספת טיפה אחת של כתם גרעיני לתאים חיים ל-2 מ"ל של מדיום בסיסי iMG.
    3. הסר 40 μL של בינוני לכל באר של צלחת 96 באר ולהוסיף 10 μL של תמיסת צביעה גרעינית באמצעות פיפטה רב ערוצית. לדגור את הצלחת ב 37 °C ו 5% CO 2 במשך2 שעות.
    4. הפשירו את הסינפטוזומים המסומנים על הקרח וסוניקו בעדינות באמצעות סוניק מים למשך דקה אחת. מעבירים מיד את הסינפטוזומים בחזרה לקרח. לדלל את הסינפטוזומים המסומנים בתווך שלם iMG ביחס של 1 μL של סינפטוזומים לכל 50 μL של מדיום.
      הערה: ריכוז הסינפטוזום תלוי בבדיקה ועשוי לדרוש אופטימיזציה. כדי לשמור על אחוז נמוך יחסית (כלומר, 0.1% או פחות) של DMSO במדיום, מומלץ לא להוסיף יותר מ -2 μL של סינפטוזומים לכל באר.
    5. כבקרה שלילית, יש לטפל בחלק מהבארות עם ציטוכלזין D כדי לעכב פילמור אקטין ובכך פאגוציטוזה. הכן פתרון של 60 μM ציטוכלזין D במדיום שלם iMG. הוסף 10 μL של תמיסה זו לכל באר לריכוז סופי של 10 μM ודגירה ב 37 °C ו 5% CO2 במשך 30 דקות.
    6. הסר את הצלחת מהאינקובטור ודגירה ב 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. שמרו את הצלחת על קרח והוסיפו 50 μL של מדיום המכיל סינפטוזומים שהוכנו כמתואר בשלב 2.3.4.
    7. צנטריפוגה של הצלחת ב 270 × גרם במשך 3 דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולשמור את הצלחת על קרח עד רכישת הדמיה.
  4. רכישה וניתוח הדמיה
    1. הכנס את הצלחת לקורא הדמיה של תאים חיים ובחר את הבארות לניתוח.
    2. בחר עדשה אובייקטיבית של 20x .
    3. כוונן את המיקוד, עוצמת הדיודה פולטת האור (LED), זמן האינטגרציה והרווח של ערוצי השדה הבהיר והכחול (4',6-diamidino-2-פנילינדול [DAPI]). הפלואורסצנציה הסינפטוזומית צריכה להיות זניחה בנקודת הזמן הראשונית. כדי להתמקד בערוץ האדום (RFP), השתמש בערוץ שדה בהיר כהפניה. זמן האינטגרציה והרווח יכולים להשתנות בין ניסויים; השתמש בהגדרות ראשוניות אלה עבור הערוץ האדום: LED: 4, זמן אינטגרציה: 250, ורווח: 5.
    4. בחר את מספר האריחים הבודדים שיירכשו במונטאז' לכל באר (רכשו 16 אריחים במרכז הבאר, ובכך הדמיינו כ-5% משטח הבאר הכולל). הגדר את הטמפרטורה ל- 37 °C ואת מרווח הזמן הרצוי להדמיה.
      הערה: תמונות נרכשו כל 1 - 2 שעות במשך עד 16 שעות במחקר זה.
    5. פתח את תוכנת הניתוח.
      1. פתח את הניסוי המכיל את התמונות. לחץ על סמל הפחתת נתונים.
      2. בתפריט, בחר תפירת הדמיה תחת עיבוד הדמיה כדי ליצור תמונה מלאה מהאריחים הבודדים בגודל 4 x 4 במונטאז' עם הפרמטרים המתוארים בטבלה 2.
      3. לאחר יצירת התמונות התפורות, הגדר סף עוצמה באמצעות ערוצי DAPI ו- RFP עבור תמונות אלה. פתח תמונה ולחץ על נתח; תחת ניתוח, בחר ניתוח סלולארי, ותחת ערוץ זיהוי, בחר תמונה תפורה בערוצי DAPI או RFP. עבור אל הכרטיסייה מסיכה ראשית וספירה וקבע ערך סף וערכי גודל אובייקט שבוחרים כראוי את גרעיני התא בערוץ DAPI או את אות הסינפטוזום בערוץ RFP. חזור על התהליך עם תמונות שונות עד למיטוב פרמטרים שניתן להחיל על הניסוי כולו.
        הערה: ניתן למצוא ערכים מוצעים בטבלה 2.
      4. כדי לספור את מספר הגרעינים, עבור אל תפריט הפחתת נתונים , ותחת ניתוח תמונה, בחר ניתוח סלולארי. עבור אל הכרטיסיה מסיכה ראשית וספירה ותחת ערוץ, בחר את התמונות התפורות של DAPI והשתמש בפרמטרים המתוארים בטבלה 2.
      5. עבור אל הכרטיסיה מדדים מחושבים ובחר ספירת תאים. כדי לקבל את האזור של אות הסינפטוזום, עבור אל תפריט הפחתת נתונים ותחת ניתוח, בחר ניתוח סלולרי.
      6. עבור אל הכרטיסיה מסיכה ראשית וספירה ותחת ערוץ, בחר תמונות תפורות RFP והשתמש בפרמטרים המפורטים בטבלה 2.
      7. עבור אל הכרטיסיה מדדים מחושבים ובחר אזור סכום אובייקט. בכרטיסייה הפחתת נתונים , לחץ על אישור ואפשר לתוכנה לנתח את כל התמונות שנרכשו.
      8. יצא את הערכים ' סכום אובייקטים ' ו'ספירת תאים' עבור כל נקודת זמן. חלק את האזור 'סכום אובייקט ' בספירת התאים כדי לחשב את האזור המנורמל לכל נקודת זמן. אם משווים מספר טיפולים או גנוטיפים, חשבו את מדד הפאגוציטוזה באמצעות משוואה (1):
        figure-protocol-1 (1)
      9. שמור את התוצאות ושלב את הנתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי ליצור iMGs באמצעות פרוטוקול זה, חשוב להתחיל עם iPSCs לא מובחנים שמראים מורפולוגיה של מושבה קומפקטית עם קצוות מוגדרים היטב (איור 2A). iPSCs מנותקים המוחזקים כמתואר בסעיף היווצרות EB ייצרו אגרגטים כדוריים, המכונים EBs, אשר יגדלו בגודלם עד ליום 4 של ההתמיינות (איור 2B). לאחר שה-EBs נאספים ומצופים בתנאים המתאימים ליצירת PMP, הם מתחברים ללוחות המצופים במטריגל, ושכבת תאים תתפשט ותקיף את האגרגטים הכדוריים (איור 2C). EBs לא בריאים יתנתק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול ההתמיינות המתואר כאן מספק שיטה יעילה להשגת תאים דמויי מיקרוגליה שמקורם ב-iPSC תוך ~6-8 שבועות בטוהר גבוה ובתפוקה מספקת לביצוע ניסויים אימונופלואורסצנטיים ומבחנים אחרים הדורשים מספר גבוה יותר של תאים. פרוטוקול זה הניב עד 1 × 106 iMGs בשבוע אחד, המאפשר מיצוי חלבונים ורנ"א וניתוחים תואמים במורד הזרם (למשל, RNASeq, qRT-PCR, כתם מערבי, ספקטרומטריית מסה). עם זאת, מגבלה של פרוטוקול זה היא שהתפוקה של iMGs עשויה להגביל יישומים מסוימים. ניתן ליישם שינויים נוספים כדי לצבור PMPs משבועות שונים ולשמור על תרבות הומו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים למייקל וורד על אספקת קו ה- iPSC של WTC11 hNIL להתמיינות נוירונים מוטוריים ולמעבדות ג'קסון על אספקת קו ה- KOLF2.1J WT clone B03 iPSC המשמש להבחנה במיקרוגליה. אנו מודים גם לדורותי שפר על תמיכתה במהלך יישום הפרוטוקולים, אנתוני גיאמפטרוצי וג'ון לנדרס על עזרתם במערכת ההדמיה של תאים חיים, כמו גם להיידן גאד על תרומתו הטכנית במהלך התיקונים ולג'ונתן יונג על שיתוף הפעולה שלו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן דן ודיאן ריצ'יו למדעי המוח מבית הספר לרפואה UMASS Chan וקרן אנג'ל בע"מ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<נוגדנים חזקים>נוגדנים לניתוח אימונופלואורסצנטי
נוגדן ארנב נגד IBA1Wako Chemical USANC9288364 1:350 דילול
נגד P2RY12 נוגדן ארנבסיגמא-אולדריץ'HPA0145181:50 דילול
נוגדן ארנב נגד TMEM119סיגמא-אולדריץ'HPA0518701:100 דילול
<נוגדנים חזקים>נוגדנים לניתוח כתמים מערביים
אנטי-ובטא;-נוגדן ארנב טובוליןAbcamab60461:500 דילול
אנטי-סינפטופיזין (SYP) נוגדן ארנבAbclonalA63441:1,000 דילול
נגד PSD95 נוגדן עכברMilliporeMAB15961:500 דילול
<חזק>בוראט מאגר רכיבים
בורית (100 מ"מSigmaB6768
נתרן ביקרבונט (NaHCO<תת>3) BioXtraSigma-AldrichS6297-250G
נתרן כלורי (75 מ"מ)סיגמא  S7653
נתרן טטרבוראט (25 מ"מ)סיגמא221732
<חומרי תרבית תאים חזקים>
6 בארותגריינר ביו-וואן657160
40 μ מסנני תאים  Falcon352340
100 מ"מ x 20 מ"מ טיפול בתרבית רקמותCELLTREAT229620
מרים תאים, קצה כפול, להב שטוח & להב צר, סטריליCELLTREAT229305
הדבקה נמוכה עגול-תחתון 96 בארות צלחתקורנינג7007
פרימריה 24 בארות משטח תחתון שטוח שונה צלחת תרבית תאים מרובת בארותקורנינג353847,
פרימריה 6 בארות צלחת תחתונה שטוחה שונה-שונה צלחת תרבית רב-בארות353846
פרימריה 96 בארות שטוחות קורנינג מיקרופלייט תחתון353872
<ריאגנטים לדיסוציאציה של תאים>
אקוטאז  ריאגנטים25058CIהמשמשים להתמיינות נוירונים מוטוריים תחתונים
מגיב TrypLELife Technologies12-605-010ריאגנטים לדיסוציאציה המשמשים להתמיינות מיקרוגליה
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
<חזק>ריאגנטים לציפוי לתרבית תאים
מטריג'ל GFR מטריצת ממברנהקורנינג וסחר;354230מתייחס לראגנט ציפוי מטריצה חוץ-תאי
CellStick Laminin-521טכנולוגיית STEMCELL77004מתייחס ללמינין 521
Poly-D-LysineSigmaP7405מרכיב מחדש ל-0.1 מ"ג/מ"ל במאגר בוראט
Poly-L-OrnithineSigma  P3655להרכיב מחדש ל-1 מ"ג/מ"ל במאגר בוראט
<חזק>רכיבים של iPSC media
  ערכת mTeSR Plusטכנולוגיית STEMCELL100-0276להכנת מדיה iPSC ערבב את הרכיבים ל<1xחזקים
>רכיבים של EB media
BMP-4Fisher ScientificPHC9534ריכוז סופי 50 ננוגרם/מ"ל
iPSC מדיהריכוז סופי 1x
מעכב ROCK Y27632Fisher ScientificBD 562822ריכוז סופי 10 ומיקרו; M
SCFPeproTech300-07ריכוז סופי 20 ננוגרם/מ"ל
VEGFPeproTech100-20Aריכוז סופי 50 ננוגרם/מ"ל
<חזק>רכיבים של PMP בסיס מדיה
GlutaMAXGibco35050061ריכוז סופי 1x
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)גיבקו15140122ריכוז סופי 100 U/mL
X-VIVO 15לונזה12001-988ריכוז סופי 1x
<חזק>רכיבי PMP מדיה מלאה
55 מ"מ 2-מרקפטואתנולג'יבקו21985023ריכוז סופי 55 ומיקרו; M
IL-3PeproTech200-03ריכוז סופי 25 ננוגרם/מ"ל
M-CSFPeproTech300-25ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל
PMP בסיס מדיהריכוז סופי 1x
<חזק>רכיבי iMG בסיס מדיה
מתקדם DMEM/F12Gibco12634010ריכוז סופי 1x
GlutaMAXGibco35050061ריכוז סופי 1x
תוסף N2, 100xGibco17502-048ריכוז סופי 1x
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)גיבקו15140122ריכוז סופי 100 U/mL
<חזק>רכיבים של iMG מדיה שלמה
55 מ"מ 2-מרקפטואתנולגיבקו21985023 ריכוז סופי 55 ומיקרו; M
IL-34PeproTech או Biologend200-34 או 577904ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"
iMG בסיס מדיהריכוז סופי 1x
M-CSFPeproTech300-25ריכוז סופי 5 ננוגרם/מ"ל
TGF-βPeproTech100-21ריכוז סופי 50 ננוגרם/מ"ל
<חזק>רכיבי מדיית בסיס אינדוקציה
DMEM/F12 עם HEPESGibco11330032 ריכוז סופי 1x
GlutaMAXGibco35050061ריכוז סופי 1x
תוסף N2, 100xGibco17502-048סופי ריכוז 1x
חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 100xGibco11140050ריכוז סופי 1x
רכיבים של אמצעי אינדוקציה מלאים
תרכובת ECalbiochem565790ריכוז סופי 0.2 μ M ולהרכיב מחדש מגיב מלאי ל -2 מ"מ באתנול 1: 1 ו- DMSO
דוקסיציקליןסיגמאD9891ריכוז סופי 2 μ גרם/מ"ל ומשחזרים מגיב מלאי ל-2 מ"ג/מ"ל בריכוז סופי של DPBS
אינדוקציה
מעכב סופי 1x ROCK Y27632Fisher ScientificBD 562822ריכוז סופי 10 μ M
Components of Neuron media
B-27 Plus Neuronal Culture SystemGibcoA3653401ריכוז סופי 1x למדיה ותוסף
GlutaMAXGibco35050061 ריכוז סופי 1x
תוסף N2, 100xGibco17502-048ריכוז סופי 1x
חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 100xGibco11140050ריכוזים סופיים
1xiPSC קווים ששימשו במחקר זה
KOLF2.1J: WT clone B03The Jackson Laboratories
WTC11 hNILהמכון הלאומי לבריאות
Synaptosome בידוד ריאגנטים
ערכת בדיקת חלבון BCAThermo Scientific Pierce23227
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)SigmaD2650
Syn-PER מגיב מיצוי חלבון סינפטיThermo Scientific87793המכונה מגיב ליזיס תאים לבידוד של סינפטוזומים
<חזקים>צבעי בדיקת פגוציטוזיס
ריאגנט NucBlue Live ReadyInvitrogen  R37605
pHrodo אדום, אסתר סוקסינימידילThermoFisher Scientific  P36600המכונה צבע רגיש ל-pH
<חזק>ריאגנטים אחרים לתרבית תאים
טריפן כחול, 0.4% תמיסהAMRESCO INCK940-100ML
אלבומין בסרום בקר (BSA)Sigma22144-77-0
BrdUSigmaB9285להרכיב מחדש ל-40 מ"מ במים סטריליים
Cytochalasin DSigmaריכוז סופי 10 ומיקרו; M
DPBS עם סידן ומגנזיוםCorning21-030-CV
DPBS ללא סידן ומגנזיוםCorning21-031-CVהמכונה DPBS
KnockOut  DMEM/F-12Gibco12660012המכונה DMEM-F12 מותאם לגידול של תאי גזע עובריים אנושיים ומושרים פלוריפוטנטיים
חלבון עכבר למינין,23017015 טבעי Gibcoהמכונה למינין
<חזק>תוכנה וציוד
צנטריפוגהEppendorfדגם 5810R
Cytation 5 הדמיית תאים חיים קוראBiotek
Gen5 Microplate Reader and Imager SoftwareBiotekגרסה 3.03
Multi-Therm Heat-ShakeBenchmarkמתייחס לשייקר צינורות
סוניקטור מיםElmaMode Transsonic 310
) לדיסוציאציה של Corning ל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254(2021).
  2. Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065(2021).
  3. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  4. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  5. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  6. Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  7. Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
  8. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  9. McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
  10. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  11. Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
  12. Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098(2013).
  13. Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486(2015).
  14. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144(2018).
  15. Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545(2015).
  16. Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138(2014).
  17. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51(2018).
  18. Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808(2020).
  19. Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
  20. Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
  21. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western Blot

מאמרים קשורים