פענוח המנגנון המולקולרי והתפקוד של רעלנים יוצרי נקבוביות באמצעות לישמניה מז'ור

Summary

מוצג כאן פרוטוקול המשתמש בפרומסטיגוטים גדולים של לישמניה כדי לקבוע את הקשירה, הציטוטוקסיות והאיתות המושרים על ידי רעלנים היוצרים נקבוביות. הוכחת היתכנות עם סטרפטוליזין O מסופקת. רעלנים אחרים יכולים לשמש גם כדי למנף את המוטציות הגנטיות הזמינות בל' מז'ור כדי להגדיר מנגנונים חדשים של עמידות לרעלנים.

Abstract

הבנת התפקוד והמנגנון של רעלנים יוצרי נקבוביות (PFTs) היא מאתגרת מכיוון שהתאים עמידים בפני נזקי הממברנה הנגרמים על-ידי PFTs. בעוד שגישות ביופיזיות עוזרות להבין את היווצרות הנקבוביות, לעתים קרובות הן מסתמכות על גישות רדוקציוניסטיות חסרות את ההשלמה המלאה של שומנים וחלבונים של הממברנה. תאים אנושיים בתרבית מספקים מערכת חלופית, אך המורכבות והיתירות שלהם במנגנוני התיקון מקשות על זיהוי מנגנונים ספציפיים. לעומת זאת, הפתוגן הפרוטוזואני האנושי האחראי ללישמניאזיס עורי, לישמניה מז'ור, מציע איזון אופטימלי בין מורכבות לרלוונטיות פיזיולוגית. L. major ניתנת למתיחה גנטית וניתן לתרבת אותה לצפיפות גבוהה במבחנה, וכל השפעה של הפרעות על זיהום ניתנת למדידה במודלים מבוססים של מורין. בנוסף, L. major מסנתז שומנים שונים ממקביליהם היונקים, מה שיכול לשנות את הדינמיקה של הממברנה. שינויים אלה בדינמיקה של הממברנה ניתנים לבדיקה באמצעות PFTs ממשפחת הרעלנים המאופיינים ביותר, ציטוליזין תלויי כולסטרול (CDC). CDCs נקשרים לארגוסטרול בקרום לישמניה ויכולים להרוג את L. major promastigotes, מה שמצביע על כך ש- L. major היא מערכת מודל מתאימה לקביעת המנגנונים התאיים והמולקולריים של תפקוד PFT. עבודה זו מתארת שיטות לבדיקת תפקוד PFT בפרומסטיגוטים גדולים של L. , כולל תרבית טפילים, כלים גנטיים להערכת רגישות לשומנים, מבחני קשירת ממברנות ומבחני מוות של תאים. מבחנים אלה יאפשרו שימוש מהיר ב- L. major כמערכת מודל רבת עוצמה להבנת תפקוד PFT במגוון אורגניזמים מגוונים אבולוציונית ומשותפים בארגון השומנים.

Introduction

רעלנים יוצרי נקבוביות (PFTs) הם המשפחה הגדולה ביותר של רעלנים חיידקיים¹, אך המנגנונים שבאמצעותם הם מנקבים והורסים תאים אינם מובנים היטב. המשפחה הנחקרת ביותר של רעלנים יוצרי נקבוביות היא זו של ציטוליזין תלויי כולסטרול (CDC). CDCs מסונתזים בעיקר על ידי חיידקים גראם חיוביים, כולל הגורם הסיבתי של דלקת החיתולית הנמקית, סטרפטוקוקוס פיוגנס². S. pyogenes מפריש את הסטרפטוליזין O (SLO) של CDC, אשר נקשר לסטרולים בקרום הפלזמה של התאים המארחים כמונומרים, אוליגומריז, ומכניס ~ 20-30 ננומטר נקבוביות לתוך הממברנה¹. התפקיד כי שומנים לשחק בתהליך זה נשאר נקבע היטב.

גישה אחת לחקר אינטראקציות שומנים-CDC היא שימוש בליפוזומים המוגדרים כימית. בעוד שליפוזומים מוגדרים מספקים מידע על ערכי הסף הדרושים של שומנים כדי לקיים קשירת רעלנים והיווצרות נקבוביות ^3,4, הם אינם משחזרים באופן מלא את תפקודי התא. לדוגמה, ליפוזומים משוחזרים חסרים את אסימטריית השומנים של פונדקאים של יונקים ושינויים בשומנים בתגובה לרעלנים⁵. חלופה אחת לליפוזומים היא שימוש בקווי תאים של יונקים. בעוד שקווי התאים האלה רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית, יש מידה רבה של יתירות במנגנוני חישת רעלנים והתנגדות². כתוצאה מכך, מסלולי התיקון המשמשים להתנגדות ל-CDC נותרים לא מוגדרים היטב. יש לציין כי זרם Ca²⁺ הוא המפעיל העיקרי של תיקון ממברנה¹. במורד הזרם של זרם^{Ca 2+}, מסלולים מרובים מעורבים, כולל תיקון תלוי סרמיד ^6,7 ומסלול תיקון תלוי MEK⁶. מסלולים אלה מתקשרים עם אפקטים אחרים של חלבונים, כולל קומפלקס המיון האנדוזומלי הנדרש להובלה (ESCRT)⁸, ונספחים ^6,9,10. ניתוח מסלולים אלה בתאי יונקים הוא מאתגר בשל היתירות, אשר מבלבלת את פענוח הנתונים.

אחת הדרכים לאזן את המורכבות עם פשטות לניתוח מסלולי תיקון היא השימוש באורגניזמים פשוטים יותר, כגון פתוגנים פרוטוזואנים בסוג לישמניה. לישמניה sp. גורמת ללישמניאזיס בבני אדם ובבעלי חיים אחרים. לישמניאזיס נע בין לישמניאזיס עורית (נגעים בעור מוגבלים בעצמם) ללישמניאזיס הקרביים הקטלניים (hepatosplenomegaly), בהתאם למין ולגורמים אחרים¹¹. לישמניה מייג'ור, הגורם הסיבתי של לישמניאזיס עורי, מועברת לבני אדם באמצעות וקטור חול ומשמשת להבנת תפקוד לישמניה וזיהום¹². בנוסף, לישמניה sp. הם digenic¹². הם קיימים כטפילי מקרופאגים תוך-תאיים המכונים אמסטיגוטים וכפרומסטיגוטים בעלי חיים חופשיים ומסומנים בחול¹². L . פרומסטיגוטים עיקריים יכולים להיות מתורבתת במדיה עם תוספת סרום כגון M199 לצפיפות גבוהה¹³. פרומסטיגוטים ניתנים גם למתיחה גנטית; קיימים נוקאאוטים גנטיים רבים, כולל אלה המכוונים למסלולי ביוסינתזה של שומנים¹³. ניתן להעריך נוקאאוטים אלה לגדילה ולהבדלים בהדבקה ובהתפתחות הנגעים באמצעות זיהום של עכברי Balb/c¹³.

בנוסף לקלות היחסית של תרבית לישמניה ומגוון הנוקאאוטים של ביוסינתזה של שומנים, לטפיל יש גנום פשוט יותר מאשר ליונקים. המין המאופיין ביותר של לישמניה הוא L. major, שיש לו כלים גנטיים קיימים רבים, כגון מוטנטים עם מטבוליזם שומנים פגום¹⁴. יש לציין כי חלבוני תיקון רבים נעדרים. ל-L. major אין הומולוגים שזוהו עד כה עבור חלבוני תיקון מרכזיים של יונקים כגון נספחים. זה מאפשר אפיון של מסלולי תיקון משומרים אבולוציונית ללא המורכבות של מערכות יונקים. עם זאת, מסלולי תיקון לא אופיינו בלישמניה עד כה. יחד עם זאת, מסלולי איתות מרכזיים המעורבים בתיקון, כגון מסלול MEK⁶, נשמרים בלישמניה sp.15,16^, אם כי יש לאמת הומולוגים. מסלול החלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK) נחקר היטב ב-L. mexicana, שם הוא תורם להישרדות תוך-תאית וליציבות תרמו-תאית בתאי יונקים ושולט במטה-ציקלוגנזה¹⁶. בליישמניה sp., 10 מתוך 15 MAPKs אופיינו¹⁷. LmMAPK9 ו-LmMAPK13 צפויים להיות הדומים ביותר ליונקים ERK1/2 בהתבסס על זהותם ברצף שפתי הזרחון המשומר. רצף שפתי הזרחון הוא TEY הן עבור יונקים ERK1/2 והן עבור LmMAPK9 ו- LmMAPK13. עם זאת, לשמונה מה-MAPKs של לישמניה יש מוטיב זרחון TDY¹⁵. לפחות שני הומולוגים של MEK זוהו בלישמניה sp., LmxMKK¹⁸ וקינאז הקשור ל-MEKK (MRK1)¹⁹. זה מצביע על כך שתובנות שזוהו בלישמניה יכולות להיות מתורגמות למערכות יונקים. כאשר הם אינם מתורגמים למערכות יונקים, הם מייצגים מטרות טיפוליות לטיפול בלישמניאזיס.

על מנת להשתמש ב- L. promastigotes כדי לחקור תיקון ממברנות ואינטראקציות עם רעלים, יש צורך בטכניקות של תפוקה בינונית . בעוד שהדמיית תאים חיים ברזולוציה גבוהה מאפשרת הדמיה של חלבונים וממברנות מסומנים בזמן אמת, התפוקה נמוכה וייתכן שהיא אינה מודדת את הישרדות התאים. מבחני כדאיות בתפוקה בינונית כוללים ספיגת צבע הנמדדת על ידי ציטומטריה של זרימה, מדידת פעילות מיטוכונדריאלית או שחרור חלבונים תאיים כמו לקטט דהידרוגנאז (LDH). בתאי יונקים, מבחני LDH אינם מודדים באופן כמותי מוות תאי²⁰. יתר על כן, מבחנים מבוססי אוכלוסייה כמו שחרור LDH או פעילות מיטוכונדריאלית אינם מאפשרים ניתוח חד-תאי או רב-ממדי חזק²⁰. לעומת זאת, מבחנים מבוססי ציטומטריה של זרימה מאפשרים אנליזה רב-פרמטרית של תא יחיד²⁰. עם זאת, מבחנים אלה לא יושמו להבנת הביולוגיה של רעלנים או לתגובות לרעלנים ב - L . major promastigotes.

במחקר זה, SLO משמש ככלי להבנת ההפרעה של קרום הפלזמה של מוטציית ה-sphingolipid null של L. major בשני חוצצים שונים - המדיה M199 המשמשת באופן שגרתי לתרבות L. promastigotes גדולים והמאגר הפשוט יותר של Tyrode. בדיקת ציטומטריה של זרימה בתפוקה בינונית מתוארת ומשמשת ליצירת עקומות מינון-תגובה של רעלן. נתונים מהמבחן הציטומטרי של הזרימה ממודלים לעקומה לוגיסטית כדי לקבוע את ערכי LC₅₀. בעזרת מידע זה, ניתן לקבוע מינון תת-ליטי של SLO כך שניתן יהיה לאמת נוגדני MAPK באמצעות כתם מערבי.

Protocol

כל ההנחיות המתאימות והפרקטיקות המיקרוביולוגיות, הבטיחות ותרביות התאים הסטנדרטיות שימשו לשימוש ולטיפול בדנ"א העיקרי והרקומביננטי של הפתוגן RG2 לישמניה . כל הניסויים עם ל. מייג'ור חי בוצעו בארון בטיחות ביולוגית במעבדה מוסמכת BSL-2. העבודה נוהלה על ידי הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית של אוניברסיטת טקסס טק.

הערה: מנקודת מבט בטיחותית, פרומסטיגוטים חיים של L. הם פתוגנים מקבוצת סיכון 2. טפל תוך שימוש בהכלה, אמצעי זהירות ופיקוח מתאימים של הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית (IBC). לטפל בחומרים רעילים וכימיקלים בהתאם לנהלים מוסדיים לחומרים רעילים. אם נעשה שימוש ברעלנים רקומביננטיים, ייתכן שיהיה צורך באישור ובפיקוח של IBC לצורך עבודת דנ"א רקומביננטי.

1. טיפוח והכנה של L. promastigotes גדול

1. להשיג, או ליצור ולאמת, L. מוטציות גנטיות עיקריות כפי שתואר קודם לכן באמצעות רקומבינציה הומולוגית או שיטות מבוססות קריספר^13,21. השתמש בנוקאאוטים המשלימים עם הגן שנוסף בחזרה על פלסמיד כדי להבטיח ספציפיות של הנוקאאוט.
2. תרבות פראית מסוג L. מז'ור ו- spt2^- פרומסטיגוטים בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס במדיום M199 שלם. תרבית את תאי התוספת האפיזומליים (spt2-/+SPT2) ^ב-M199 שלם בתוספת 10 מיקרוגרם/מ"ל G418 (ראו טבלה 1 וטבלת חומרים).
   הערה: כל מערך הניסויים הכולל ניסויים עם תאי L. עיקריים חייב להתבצע בארון בטיחות ביולוגית בעל אישור BSL2.
3. מטפחים את הפרומסטיגוטים ב-M199 בינוני^{שלם 22} עד שהם מגיעים לשלב היומן (2-8 x 10^{6 תאים}/מ"ל), כפי שנקבע על ידי L. מבחני עקומת גדילה גדולים שנעשו בעבר²³. תכננו 1 x 10 5 תאים עבור כל באר עבור ציטוטוקסיות, ועוד 5 x 10^{5 תאים} לבקרת צביעה. עבור כתם מערבי, תוכנית 2 x 10^{7 תאים} לכל באר.
   הערה: בצע בדיקת ציטוטוקסיות עם שני שכפולים טכניים.
4. כדי לוודא את צפיפות התאים הנכונה, מערבבים אליקוט (10-40 μL) של פרומסטיגוטים עם נפח שווה של קיבוע (3.7% paraformaldehyde ב 1x PBS). טען 10 μL של הדגימה הקבועה על כל צד של hemacytometer.
   אזהרה: פורמלדהיד הוא כימיקל רעיל. טיפול בהתאם למדיניות המוסדית לכימיקלים מסוכנים.
5. בצע ספירת תאים באמצעות מיקרוסקופ בהגדלה של פי 20. ספרו את כל התאים ב-25 הריבועים הקטנים במרכז ההמיציטומטר. חוזרים על הפעולה עבור הריבועים משני הצדדים וממוצעים של הספירות.
   הערה: אם השונות בין הספירות היא >10, ספר מחדש וממוצע. אם הספירה הממוצעת היא <10 או >100, שנה את הדילול וספר מחדש ולאחר מכן חשב את צפיפות התרבות באמצעות הנוסחה הבאה:
   (eq 1)
   לדוגמה, אם יש בממוצע 250 לישמניה ב-25 ריבועים, צפיפות התרבית היא 5 x 10^{6 תאים} למ"ל.
6. לאחר הספירה, העבירו 5 x 10^{6 תאים} לצינור חרוטי של 15 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 1,500 x g למשך 8 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלגל את התאים.
7. השליכו את הסופר-נטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל ומערבבים לזמן קצר את כדור התא. הוסף 5 מ"ל של 1x PBS לאותו צינור ושטוף את התאים על ידי היפוך עדין 3-6x. צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר כדי לזרוק את התאים.
8. השליכו את הסופר-נאטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל והחזירו את הכדור 5 x 10^{6 תאים} ב-5 מ"ל בינוני (למשל, M199 או חיץ של 1x Tyrode) ששימש לניסויים עם פיפטה של 5 מ"ל כדי לתת ריכוז סופי של 1 x 10⁶ תאים למ"ל.

2. בדיקת ציטוטוקסיות

1. הכנה ניסיונית
   1. לטהר את הרעלן כפי שתואר קודם^{לכן 24}, או לרכוש את הרעלן מספק. Aliquot לתוך aliquots חד פעמי ולאחסן −80 °C למשך עד 1 שנה. הימנעו ממחזורי הפשרה מרובים בהקפאה.
   2. קבעו את הפעילות ההמוליטית של כל רעלן באמצעות תאי דם אדומים אנושיים (ראו טבלת חומרים)²⁴.
      הערה: פעילות המוליטית משמשת מכיוון שהיא שולטת בהבדלים בפעילות עקב טיהור, מוטציות וכו '. בחירת המינים של אריתרוציטים עשויה לשנות את הפעילות ההמוליטית (למשל, אינטרמדיליזין דורש תאי דם אדומים אנושיים).
   3. תכנן שני שכפולים טכניים עבור כל מצב, שבעה דילולים עבור עקומת המינון-תגובה, ובקרה ללא רעלן.
      הערה: עם פרומסטיגוטים מסוג פרא (WT), spt2 ו-spt2-/+SPT2, ניתן לבדוק שני טיפולים בלוח V-תחתון אחד ^96-well. לדוגמה, ניתן להשוות את הרגישות למדיה (איור 1). במקום צלחת V-bottom, ניתן להשתמש בצינורות מיקרוטיטר בגודל 1.2 מ"ל (ראו טבלת חומרים). בשל זמני הרכישה על הציטומטר, הפעלת יותר מצלחת אחת בכל פעם אינה מומלצת.
   4. קבע באיזה מאגר בדיקה להשתמש בהתבסס על תנאי הבדיקה הדרושים ומטרת הניסוי.
      הערה: בדוגמה זו, משווים שני מאגרי בדיקה: M199 והמאגר של Tyrode בתוספת צבע הכדאיות פרופידיום יודיד (PI). כולסטרול בסרום יפריע לפעילות CDC²⁴.
   5. חשב את כמות הרעלן הדרושה בהתבסס על התנאים ומספר הגנוטיפים המטופלים. ודא ש-50% תסיסה ספציפית מתרחשת באמצע עקומת הדילול.
      הערה: עבור CDC, דילול סדרתי כפול ייתן טווח טוב עבור מודלים לוגיסטיים מאוחרים יותר. עבור spt2^- promastigotes, 4,000 HU/mL SLO הוא דילול ההתחלה המומלץ. כאשר משתמשים ברעלים לא פעילים, ניתן להשתמש במקום זאת במסה השווה למינון הגבוה ביותר.
   6. תכנן נפח סופי של 200 μL לכל באר, והוסף נפח קטן נוסף (50-100 μL) כדי להסביר את שגיאת הפיפטה.
      הערה: עם שלושה גנוטיפים, שכל אחד מהם נעשה בשכפול, יהיו שש דגימות לדילול סדרתי.
   7. קבע את הכמות הכוללת של הרעלן הדרוש באמצעות הנוסחה הבאה:
      (eq 2)
      כאשר ActivityMax הוא הריכוז הגבוה ביותר בשימוש (HU/mL); TotalFinalVolume הוא הנפח הכולל (עבור שש דגימות, 200 x 6 + 100 = 1,300 μL); ActivityStock היא הפעילות של מלאי הרעלן (HU/mL); ו- VolStockToxin הוא נפח מלאי הרעלנים הדרוש.
   8. הכינו מאגר בדיקה מספיק הדרוש לניסוי. השלימו את המדיום הבסיסי עם צבע כדאיות וכל Ca 2+ או EGTA הדרושים לשליטה ברמות Ca²⁺. מערבולת לערבב.
      הערה: לדוגמה, עבור כל חיץ של 10 מ"ל Tyrode, הוסף 50 μL של 2 מ"ג / מ"ל PI ו 200 μL של 100 mM CaCl₂, נותן ריכוזים סופיים של 10 מיקרוגרם / מ"ל ו 2 mM, בהתאמה.
   9. ודא שצבע הכדאיות PI אינו מתנגש עם בדיקות אחרות המשמשות, כגון עבור בדיקות קשירה פלואורסצנטיות באמצעות Cy5 או AlexaFluor647-רעלים מצומדים^20,25.
   10. תכנן דילולי רעלנים כדי ליצור תמיסה של פי 2 של רעלן. הוסיפו חיץ בדיקה לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל וצננו על קרח. יש להוסיף את הרעלן רק מיד לפני תחילת הבדיקה.
       הערה: בדוגמה זו, 1.3 מ"ל של מאגר בדיקה יתווספו עבור הדילול העליון, ו- 650 μL יתווספו עבור דילולים סדרתיים כדי להכין את תמיסת הרעלן 2x.
2. ניסוי
   1. שמור 0.5 מ"ל של promastigotes מעובד משלב 1.8 בצינור נפרד כמו "שליטה מוכתמת".
      הערה: דוגמה זו תשמש להגדרת גידור על ציטומטר הזרימה.
   2. יש להוסיף 2 מ"ג/מ"ל PI לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל לשאר הפרומסטיגוטים. וורטקס במשך 3 שניות.
      הערה: לאחר הוספת PI לפרומסטיגוטים המעובדים, ניתן להשתמש בתאים אלה רק למשך פרק זמן של 2.5 שעות. לאחר 2.5 שעות, התאים מתחילים למות, והתוצאות הופכות שגויות.
   3. הוסיפו 1 x 10⁵ (ב-100 μL/well) פרומסטיגוטים מעובדים לכל באר של צלחת V-bottom 96-well או 1.2 mL microtiter tubes (איור 1). הניחו את הצלחת או את מתלה הצינורות על קרח בזווית של כ-45° מהצפייה. בצע את העבודה בארון בטיחות ביולוגית בעת טיפול בפרומסטיגוטים של לישמניה .
   4. הוסף 100 μL של מאגר בדיקה עם PI לכל פקד ללא רעלן (שורה אחרונה). ודא שהפקד נוסף כהלכה על-ידי זיהוי חזותי של צינורות עם נפח כולל של 200 μL שנראים בצבע כהה יותר.
   5. מוציאים את הרעלן מ-80 מעלות צלזיוס, מפשירים על קרח וממלאים לפי הצורך. הוסף את נפח הרעלן המחושב בשלב 2.1.5 לדילול הגבוה ביותר (שהוכן בשלב 2.1.10). לאחר מכן, דיללו את הרעלן באופן סדרתי (איור 1). פיפטה למעלה ולמטה לפחות 8x כדי להבטיח ערבוב.
      הערה: יש לבצע את המבצע על קרח מכיוון ש-CDC מושבת במהירות בטמפרטורת החדר.
   6. החל מריכוז הרעלנים הנמוך ביותר, הוסיפו במהירות 100 μL של רעלן לשורה הנכונה (איור 1 ואיור 2) והמשיכו עד שכל הרעלן נוסף לתאים.
   7. אטמו את הצלחת עם סרט איטום. דגירה ב-37°C למשך 30 דקות. לאחר תקופת הדגירה, לארוז ולהעביר את הצלחת לציטומטר הזרימה.
3. איסוף נתונים
   1. הגדר את ציטומטר הזרימה (ראה טבלת חומרים) ותוכנת רכישה בהתאם להוראות היצרן ובהתאם למדיניות המתקן. אין לבצע את הליך הציטומטריה של הזרימה ללא הכשרה מוקדמת על הציטומטר.
      הערה: בדוגמה זו, נעשה שימוש ב- Attune NxT בעל 4 לייזרים. PI נאסף בערוץ YL-1 (נרגש על ידי לייזר 561 ננומטר, עבר דרך LP 577, משתקף מ-600 DLP, ומסונן דרך פס פס 585/16), אם כי הספקטרום הרחב של PI מאפשר איסוף בערוצים אחרים.
   2. באמצעות דגימת L. major promastigote שלא הוכתמה, קבעו את השערים לפיזור קדימה ולצד ואת הפרמטרים הפלואורסצנטיים הראשוניים בהתבסס על הצבעים שנבחרו.
   3. כלול פרמטר אחד נוסף אם תרצה עבור חלקות נקודה כדי לבדוק את ה-autofluorescence (לדוגמה, "ללא כתם") (איור 3).
      הערה: בדוגמה זו, נעשה שימוש בערוץ BL-1 (נרגש על ידי לייזר של 488 ננומטר, עבר דרך 495 DLP ו- 503 LP, משתקף מ- 555 DLP ומסונן דרך פס פס 530/30).
   4. באמצעות בקרות מוכתמות בודדות, הגדר את השערים לצבע הכדאיות (PI במחקר זה) ולכל רעלנים המסומנים באופן פלואורסצנטי. נטר את הפיזור קדימה לעומת הזמן עבור מיקרו-סתימות.
      הערה: PI יכתים במעומעם את כל התאים שמעל לפקדים שאינם מוכתמים. תאים מתים יהיו ניתנים להפרדה בקלות, עם תאים מחלחלים באופן ארעי בין אוכלוסיות.
   5. רכוש >10,000 אירועים מגודרים עבור כל דגימה בציטומטר.
      הערה: מומלץ לקרוא מרגישות ביותר לפחות רגישה, אך ניתן להפוך את סדר הרכישה כדי לקבוע כל השפעה של סדר הקריאה על תוצאות המדגם.
   6. שמור את הנתונים וייצא לפי הצורך לניתוח.
4. ניתוח נתונים
   הערה: במחקר זה, Excel עם תוסף Solver (ראה טבלת חומרים) שימש לניתוח נתונים (ראה קובץ משלים 1).
   1. סה"כ שער, תא בודד L. פרומסטיגוטים עיקריים על ידי פיזור קדימה וצד וזמן לפי הצורך (איור 3). השתמש בגובה או באזור לפי המומלץ עבור ציטומטר הזרימה.
      הערה: עבור ציטומטר הזרימה המשמש כאן, גובה הוא הפרמטר המומלץ במקום שטח.
   2. זהה ושער תאים מתים כ"PI גבוה". שער תאי ביניים כמו "PI נמוך". תאים גבוהים של PI הם תאים מתים, בעוד שתאים נמוכים של PI מחלחלים באופן חולף²⁶.
      הערה: תאים גבוהים PI מציגים בדרך כלל הסטה של 2-3 לוגים מתאים שליליים.
   3. ייצא את הנתונים ל- Excel. השג את שם/מזהה המדגם ו-%PI גבוה כדי לקבוע הרג.
      הערה: אם נעשה שימוש ברעלים פלואורסצנטיים, יהיה צורך בעוצמה הפלואורסצנטית החציונית (MFI) של אוכלוסיות חיות, חדירות ארעיות ושליליות. ניתן לייצא %PI נמוך לצורך חלחול חולף.
   4. קבע את רמת ה-PI הגבוהה הממוצעת עבור כל מצב בין שני המשכפלים הטכניים.
      הערה: אם יש צורך ב-MFI ממוצע עבור רעלנים פלואורסצנטיים, חשב גם זאת.
   5. חשב %Lysis ספציפי מתוך %PI גבוה באמצעות הנוסחה הבאה^24,25:
      (eq 3)
      כאשר PIhighxpt הוא % PI גבוה עבור מצב הניסוי; ו-PIhighctl הוא אחוז ה-PI הגבוה לשליטה ללא רעלים.
   6. תרשים %ליזיס ספציפי נגד ריכוז רעלן עבור עקומת המינון-תגובה (איור 4).
   7. ארגן את עקומת המינון-תגובה ב- Excel לצורך מידול לוגיסטי. כלול ריכוז רעלנים וממוצע %ליזיס ספציפי יחד עם פרטי ניסוי ו/או חישובים גבוהים של %PI גולמי (טבלה 2).
   8. ודא שהתוספת Solver זמינה.
      הערה: כדי להפוך את Solver לזמין בגירסת שולחן העבודה של Excel, עבור אל אפשרויות > קובץ > תוספות וסמן את התיבה Solver . הפעל מחדש את Excel.
   9. תייג ארבע עמודות נוספות כ"מעוצב", "שיורית", "פרמטרים" ו"ערכי פרמטרים". ודא שהעמודות הראשונות תואמות לפרמטרים הניסוייים, לריכוז הרעלן ול-%Lysis ספציפי (טבלה 2).
   10. הוסף את הפרמטרים הבאים בעמודה "פרמטרים": L, k, c, SUM ו- LC50. אתחל את הפרמטרים L, k ו- c על-ידי הזנת הערכים הבאים בעמודה "ערכי פרמטרים": 100, 0.05, 1,000.
   11. בעמודה "מודל", צור את המודל הלוגיסטי באמצעות הנוסחה הבאה:
       (eq 4)
       הגדר את L, k ו- c לתאים המכילים פרמטרים אלה בעמודה "ערכי פרמטרים".
       הגדר x לתא המכיל את ריכוז הרעלן.
       הערה: עבור טבלה 2, תא G4, הנוסחה היא כדלקמן: =$J$3/(1+EXP(-$J$4*(D4-$J$5)))
   12. החל משוואה זו על כל ערכי %Lysis ספציפיים, למעט הפקד ללא רעלים.
   13. בעמודה "שיורית", חשב את ריבוע ההפרש בין המספר הממודל לבין התזה הספציפית בפועל באמצעות המשוואה הבאה:
       (סעיף 5)
       כאשר y הוא הניסוי %Lysis ספציפי; ו- m הוא הערך המתאים בעמודה "ממודל" המחושב בשלבים 2.4.10-2.4.11.
   14. בעמודה "ערכי פרמטרים" לצד "SUM", סכם את כל הערכים בעמודה שיורית.
   15. בעמודה "ערכי פרמטרים" לצד "LC50", אתחל את המשוואה כדי לחשב את LC₅₀ מהערכים שנקבעו. פעולה זו פותרת את Eq 4 עבור x כאשר m = 50.
       (eq 6)
       עבור טבלה 2, הנוסחה של Excel היא כדלקמן: =J5-(LN(J3/(50)-1))/J4
   16. פתח את הפותר מהכרטיסיה נתונים. בחר באפשרות Set Purpose (הגדר מטרה) כתא המכיל את סכום השאריות שחושבו. הגדר אותו למינימום.
   17. שנה את תאי המשתנים עבור ערכי הפרמטרים של L, k ו- c.
       הערה: הפותר עשוי להתנהג טוב יותר אם "הפוך משתנים בלתי מוגבלים ללא שליליים" נותר מסומן.
   18. עבור ערכי k שליליים, שנה את Eq 4 ו- Eq 6 על-ידי חישוב −1 מ- k כדי לשנות את k לחיובי. השתמש בשיטת הפתרון הלא ליניארית GRG. לחץ על פתור.
   19. בדוק את העקומה ושה- LC₅₀ מחושב באופן אוטומטי באמצעות Eq 6 (טבלה 2). אמת את ההתאמה על-ידי התוויית %תזה ספציפית ומידול כנגד ריכוז רעלנים באופן גרפי.
       הערה: ניתן לבדוק זאת גם על ידי חישוב R² עבור העקומה.

3. אנליזת חלבונים של פרומסטיגוטים גדולים L. מאותגרים רעלן

1. הכן ל . פרומסטיגוטים עיקריים כמתואר בסעיף 1.
2. יש להשעות 2 x 10⁷ WT, spt2-, ו- spt2^-/+SPT2 L. פרומסטיגוטים עיקריים ב-2 מ"ל של מאגר הבדיקה הרצוי באמצעות פיפטה של 5 מ"ל (למשל, M199 ללא סרום). יש להוסיף רעלן לריכוז התת-ליטי הסופי ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   הערה: לדוגמה, מינון תת-ליטי של SLO עבור spt2^- promastigotes הוא 500 HU/mL.
3. כלול גנוטיפים אחרים ובקרות ללא רעלנים.
4. צנטריפוגה של הפרומסטיגוטים בגודל 1,500 x גרם למשך 10 דקות כדי להמטיר את התאים. השליכו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל. הפעל את הצינור הסגור המכיל את כדור התא במהירות שלוש פעמים על פני משטח לא סדיר, כגון הגריל של ארון הבטיחות הביולוגית, כדי לפרק את כדור התא.
   הערה: כדור התא כמעט בלתי נראה לעין בלתי.
5. שחזרו מאגר דגימת SDS-PAGE אחד עם 2-mercaptoethanol מיד לפני השימוש וחממו ל-95°C למשך 10 דקות לפני התוספת לכדור התא. השהה את גלולת התא במאגר דגימה חם 1x SDS-PAGE, וערבב היטב על-ידי צנרת למעלה ולמטה. מחממים את גלולת התא המחודשת במאגר דגימה אחד בטמפרטורה של 95°C למשך 10 דקות.
   הערה: לאחר משענות במאגר הדגימה, אחסן את הדגימות לטווח ארוך ב- −20 °C במידת הצורך.
6. הכינו את ג'ל הפירוק. דגה את כל הרכיבים למעט אמוניום פרסולפט (APS) ו- TEMED למשך 15 דקות.
7. הוסיפו APS ו-TEMED מיד לפני יציקת הג'ל. בזהירות לכסות את ג'ל פתרון עם מים. אפשר לג'ל הפותר להתפלמר, ~ 30-45 דקות.
8. מסננים את המים ומכינים את ג'ל הערימה. מוסיפים את ג'ל הערימה, תוך הקפדה על מניעת בועות. הכנס מסרק עם המספר הרלוונטי של בארות, ולאפשר פולימריזציה במשך 5 דקות. עקוב אחר פילמור באמצעות כל שאריות ג'ל הערימה.
9. הרכיבו את הג'ל להפעלת SDS-PAGE והוסיפו מאגר מאגר לתא.
10. טען 10 μL מכל דגימה לכל באר, או 8 μL של סולם החלבון. הפעל ב 180 V עד שהדגימות נכנסות לג'ל הפירוק, ולאחר מכן להפחית את המתח ל ~ 160 V ולהפעיל עד חזית הצבע הוא ~ 0.5 ס"מ מקצה הצלחת.
    הערה: הזמן שלוקח לדגימות להגיע לתחתית עשוי להשתנות בין 1-1.5 שעות. ניתן להאריך את הזמן על ידי הפחתת המתח. לעולם אל תפחית את המתח לאפס. מתחים גבוהים יותר עלולים להגביר את הג'ל "מחייך" ולפצח את הצלחות.
11. מעבירים את הג'ל לכתם קומאסי (לצביעת חלבונים) או למאגר העברה פי 1 (להכתמה מערבית). לצביעת Coomassie, יש להכתים למשך הלילה, ולאחר מכן לטשטש, להצטלם ולייבש.
12. עבור כתם מערבי, להכין את מערכת ההעברה על פי הוראות היצרן.
13. להעברה רטובה, השתמש במאגר העברה קר פי 1 ובפדים רטובים מראש, נייר סינון וניטרוצלולוז. עבור מערכת Bio-rad Protean III (ראו טבלת חומרים) המשמשת כאן, ניתן לחתוך את נייר הסינון ל-10 ס"מ על 7.5 ס"מ. חותכים את הניטרוצלולוז ל-9 ס"מ על 6.75 ס"מ.
    הערה: ניטרוצלולוז דליק מאוד. הימנע מלהבות פתוחות ומקורות פוטנציאליים אחרים של הצתה.
14. הניחו את קלטת ההעברה עם רפידות, נייר סינון וניטרוצלולוז. גלגלו בועות אוויר. מוסיפים את הג'ל בזהירות.
15. הוסיפו את נייר הסינון ופרשו בועות אוויר. מוסיפים את הפד, סוגרים את הקלטת ומכניסים למחזיק בכיוון הנכון (ודאו שניטרוצלולוז פונה אל ההד האדום). מוסיפים מוט ערבוב וחבילת קרח בצד, וממלאים את המאגר בחיץ העברה קר פי 1. העברה ב 110 V למשך 90 דקות.
    הערה: החום שנוצר במהלך ההעברה עלול להשפיע לרעה על ההעברה. כדי להבטיח העברה טובה, השתמש תמיד במאגר העברה קר 1x.
16. הסר את הניטרוצלולוז והכתם עם תמיסת פונסו למשך ~ 5 דקות. יש לשטוף במים טהורים במיוחד. מסמנים את סולם החלבון בעיפרון וחותכים את הכתם לפי הצורך. נטרל את הכתם באמצעות מאגר העברת שאריות.
    הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בפונסו פעמים רבות.
17. חסום את הניטרוצלולוז ב-25 מ"ל של 5% BSA ב-1x TBST ב-4 מעלות צלזיוס, עם רעידות, למשך הלילה. לאחר מכן, השליכו את תמיסת החסימה והוסיפו נוגדן ראשי (1:1,000) ב-1% BSA ב-1x TBST. יש לנער בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
    הערה: ניתן לשמור את הנוגדן העיקרי בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס ולעשות בו שימוש חוזר מספר פעמים.
18. שטפו את הניטרוצלולוז 3x במשך 10 דקות כל אחד ב-1x TBST עם רעידות. יש להשליך את הכביסה ולהוסיף 10 מ"ל של נוגדן משני מצומד HRP (1:10,000) ב-1% BSA ב-1x TBST. יש לנער בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. שטפו את הניטרוצלולוז 3x במשך 10 דקות כל אחד ב-1x TBST עם רעידות.
19. הכינו מגיב ECL מיד לפני הדמיית הניטרוצלולוז. מיד לפני ההדמיה, decant את TBST ולהוסיף את מגיב ECL ניטרוצלולוז. יש לנער במשך דקה אחת. דמיינו את הג'ל.

Results

רגישות פרומסטיגוטה מוגברת ל-SLO במאגר של Tyrode בהשוואה ל-M199
רגישות ה- SLO של L. promastigotes גדולים הושוותה בין מאגרי בדיקה שונים. פרומסטיגוטים מסוג Wild, spt2 ^ו-spt2-/+SPT2 אותגרו עם SLO ב-M199 ללא סרום או במאגר של Tyrode בתוספת 2 mM CaCl₂ למשך 30 דקות לפני ניתוח על ציטומטר זרימה. טפילים מתאימים לניתוח היו תאים בודדים שזוהו על ידי פרופילי פיזור קדימה/צד (איור 3A,B). הנתונים נאספו באמצעות ערו...

Discussion

במחקר זה תוארו שיטות לחקר המנגנונים והתפקודים המולקולריים של PFTs, תוך שימוש בפתוגן האנושי לישמניה מייג'ור כמערכת מודל. פותחה בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת ציטוטוקסיות של זרימה בתפוקה בינונית למדידת כדאיות של תא בודד. הכדאיות היא כמותית ברמת האוכלוסייה מכיוון שניתן לחשב ערכי LC₅₀ מעקומת המינון-תגובה באמצעות מודלים לוגיסטיים. כהוכחה עקרונית, נעשה שימוש בבדיקה ציטומטרית של זרימה כדי להמחיש שבחירת המדיה יכולה לשנות את הרגישות של L.major מסוג בר וחסר ספינגוליפידים ל-SLO ולקבוע את מינון הרעלן התת-ליטי ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צינורות מיקרוטיטר 1.2 מ"ל (מארש)	פישר	02-681-376	בדיקת ציטוטוקסיות
1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה	פישר	05-408-129	דילול רעלנים
15 מ"ל צינור צנטריפוגה	Avantor VWR (Radnor, PA)	89039-666	להחזקת תאים ומדיה
1x מי מלח חוצץ פוספט (PBS)	Fisher	BP399	לעיבוד תאים
3% H2O2	וולמארט  (פייטוויל, ארקלנד)	N/A	עבור ECL
5x M199	Cell-gro	11150067	מצע גידול בזאלי עבור L. פרומסטיגוטים גדולים
ארון בטיחות ביולוגית	אופה		לתרבית תאים בתנאים סטריליים
אלבומין בסרום בקר (BSA)	Fisher	BP1605-100	Fraction V טוהר מקובל
CaCl2	Fisher	BP510-100	ריכוז מלאי 100 מ"מ
צנטריפוגה	תרמו פישר	Heraeus Megafuge 40R	כדי לגלול את התאים מתרבית
Cy5 חבילת צבע מונו-ריאקטיבית	Cytiva (מרלבורו, MA)	PA25031	תווית פלואורופור לרעלים
אמבט יבש דיגיטלי	בנצ'מרק	BSH1002	לפגוע בדגימות חלבון
EGTA	Amresco	0732-100G	ריכוז מלאי 0.5 M
Excel	Microsoft (רדמונד, וירג'יניה)		ניתוח נתונים תוכנה
ציטומטר זרימה (4-לייזר Attune NxT)	פישר		ציטומטר לרכישת נתונים
FlowJo	BD (אשלנד, אורגון)		תוכנה
פורמלדהיד	פישר	BP531-500	מקבע לספירת תאים
G418	פישר	BP673-1	סוכן בחירה לתאים
Hellmanex III	Sigma	Z805939	לדלל 1:4 לניקוי ציטומטר
Hemacytometer	Fisher	0267151B	לספירת תאים
תאי דם אדומים אנושיים	Zen-bio (Durham, NC)	SER-10MLRBC	לאימות פעילות רעלן
דלי
מיקרוסקופ אור	Nikon	Eclipse 55i	להדמיית תאים
ניטרוצלולוזה	פישר	88018	לבדיקה חלבונים באמצעות נוגדנים
Pipettor וטיפים	Avantor VWR		להפצת ריאגנטים
אספקת חשמל	Bio-Rad		להפעלת SDS-PAGE והעברות
Propidium iodide	Biotium	40016	ריכוז מלאי 2 מ"ג/מ"ל במים
סולם חלבון	Bio-Rad	161-0373	לקביעת משקל מולקולרי של חלבונים
SDS-PAGE פועל מכשיר (מיני פרוטיאן III)	Bio-Rad	165-3302	להפרדת חלבונים על פי גודלם
סרט איטום	R& D	DY992	כדי לאטום צלחות עם תאים
סטרפטוליזין O C530A פלסמיד			הכנס משובט לתוך וקטור pBAD-gIII (התייחסות: 7)
סטרפטוליזין O C530A רעלן	מעבדה מטוהר		פעילות ספציפית  4.34 x 105 HU/mg
רוטור דלי מתנדנד	Thermo Fisher	75003607	לתאי צנטריפוגה
צלחת תחתונה V	גריינר ביו-וואן	651206	לבדיקת ציטוטוקסיות
Vortex	Benchmark	BV1000	לערבב תאים
מערכת הדמיית כתם מערבי (Chemi-doc)	Bio-Rad		להמחשת חלבונים על ידי כתם
מערבי מנגנון העברת כתם מערבי (Mini Protean III)	Bio-Rad	170-3930	Transfer חלבונים לניטרוצלולוז
Whatman נייר סינון	GE Healthcare מדעי החיים	3030-700	משמש בהעברת חלבונים לניטרוצלולוז
<חזק>נוגדן
נוגדנים נגד ERK	טכנולוגיות איתות תאים	Cat# 9102S	ארנב (דילול 1:1000)
נוגדן נגד ליפופוספוגליקאן (גפ"מ)	CreativeBioLabs	עכבר Cat# WIC79.3	(1: 1000)
טכנולוגיות איתות תאים	נגד נוגדנים נגד MEK	Cat# 9122L	ארנב (1:1000)
IgG נגד עכברים, HRP מצומד	ג'קסון Immunoresearch	Cat#715-035-151	חמור (1:10000)
אנטי-פוספו-ERK	נוגדנים טכנולוגיות איתות תאים	Cat# 9101S	ארנב (1:1000)
אנטי-pMEK	נוגדנים טכנולוגיות איתות תאים	חתול # 9121S	ארנב (1:1000)
אנטי ארנב IgG, HRP מצומד	ג'קסון מחקר חיסוני	Cat#711-035-152	חמור (1:10000)
נוגדן נגד טובולין	Sigma	Cat# T5168	עכבר (1: 2000)
Leishmania major Genotypes			התייחסות: 13
Episomal addback (spt2-/+SPT2)&			Delta; spt2::HYG/&דלתא; spt2:PAC/+pXG-SPT2
סרין פלמיטואיל טרנספראז תת-יחידה 2 נוקאאוט (spt2-)&			Delta; spt2::HYG/&דלתא; spt2::P AC
סוג פרא (<חזק>WT)			LV39 שיבוט 5 (Rho/SU/59/P)