מאמר שיטה

כימות הפעילות האנטי פטרייתית של פפטידים נגד קנדידה אלביקנס

DOI:

10.3791/64416

⸱

13 בינואר 2023

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקבלת נתונים כמותיים על הפעילות האנטי-פטרייתית של פפטידים ותרכובות אחרות, כגון חומרים אנטי-פטרייתיים בעלי מולקולות קטנות, כנגד קנדידה אלביקנס. השימוש בו בצפיפות אופטית במקום לספור יחידות יוצרות מושבה כדי לכמת עיכוב גדילה חוסך זמן ומשאבים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות מסורתיות לביצוע בדיקות רגישות אנטי פטרייתיות לקנדידה אלביקנס גוזלות זמן רב וחסרות תוצאות כמותיות. לדוגמה, גישה נפוצה מסתמכת על ציפוי תאים המטופלים בריכוזים שונים של מולקולות אנטי פטרייתיות על לוחות אגר ולאחר מכן ספירת המושבות כדי לקבוע את הקשר בין ריכוז מולקולות ועיכוב גדילה. שיטה זו דורשת לוחות רבים וזמן ניכר לספירת המושבות. גישה נפוצה נוספת מבטלת את הצלחות ואת ספירת המושבות על ידי בדיקה חזותית של תרבויות שטופלו בחומרים אנטי פטרייתיים כדי לזהות את הריכוז המינימלי הדרוש לעיכוב הצמיחה; עם זאת, בדיקה חזותית מניבה תוצאות איכותיות בלבד, ומידע על גדילה בריכוזים תת-מעכבים הולך לאיבוד. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת הרגישות של C. albicans לפפטידים אנטי פטרייתיים. על ידי הסתמכות על מדידות צפיפות אופטיות של תרביות, השיטה מפחיתה את הזמן והחומרים הדרושים להשגת תוצאות כמותיות על גידול תרביות בריכוזי פפטידים שונים. הדגירה של הפטרייה עם פפטידים מתבצעת בצלחת של 96 בארות באמצעות חיץ מתאים, כאשר בקרות אינן מייצגות עיכוב גדילה ועיכוב גדילה מלא. לאחר הדגירה עם הפפטיד, מתלי התאים המתקבלים מדוללים כדי להפחית את פעילות הפפטיד ואז גדלים בן לילה. לאחר גדילה בין לילה, הצפיפות האופטית של כל באר נמדדת ומושווה לבקרות החיוביות והשליליות כדי לחשב את עיכוב הצמיחה המתקבל בכל ריכוז פפטידים. התוצאות באמצעות בדיקה זו דומות לתוצאות בשיטה המסורתית של ציפוי התרבויות על צלחות אגר, אך פרוטוקול זה מפחית את פסולת הפלסטיק ואת הזמן המושקע בספירת מושבות. למרות שהיישומים של פרוטוקול זה התמקדו בפפטידים אנטי פטרייתיים, השיטה תהיה ישימה גם לבדיקת מולקולות אחרות עם פעילות אנטי פטרייתית ידועה או חשודה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קנדידה אלביקנס היא חלק מהמיקרוביוטה האנושית שמאכלסת מקומות רבים, כולל חלל הפה, העור, מערכת העיכול והנרתיק1. עבור חולים מדוכאי חיסון עקב מחלות כגון וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) וטיפולים מדכאי חיסון, הנשאות של C. albicans עלולה להוביל לקנדידה מקומית או מערכתית 2,3. השימוש בטיפולים אנטי-פטרייתיים במולקולות קטנות הזמינות כיום, כגון אמפוטריצין B, אזולים או אכינוקנדינים, יכול להיות מסובך על ידי בעיות מסיסות ורעילות ועל ידי עמידות של זיהומים לטיפולים 4,5. בשל המגבלות של חומרים אנטי פטרייתיים הנוכחיים, החוקרים מחפשים ללא הרף מולקולות אנטי פטרייתיות חדשות עם פעילות נגד C. albicans.

פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs) הם חלופה פוטנציאלית לחומרים האנטי-פטרייתיים הנוכחיים של מולקולות קטנות 6,7,8 ומוצעים להיות פחות רגישים להתפתחות עמידות בהשוואה לתרופות בעלות מולקולות קטנות 9. AMPs הם קבוצה מגוונת של פפטידים, אבל הם לעתים קרובות קטיוניים, עם ספקטרום רחב של פעילות10,11,12. AMPs עם פעילות נגד C. albicans כוללים פפטידים ידועים ממשפחות היסטטין וצקרופין 13,14,15, יחד עם פפטידים שתוארו לאחרונה כמו ToAP2, NDBP-5.7, וגרסת היסטטין 5 K11R-K17R 16,17. בשל הפוטנציאל שלהם לטיפול בזיהומי קנדידה, זיהוי ועיצוב AMPs חדשים המכוונים ל- C. albicans הוא יעד חשוב עבור קבוצות מחקר רבות.

כחלק מהתהליך לפיתוח AMPs יעילים (וחומרים אנטי פטרייתיים אחרים) המכוונים ל- C. albicans, בדיקות חוץ גופיות משמשות בדרך כלל לזיהוי פפטידים מבטיחים. שיטות לבדיקת פעילות אנטי-פטרייתית נגד C. albicans כוללות בדרך כלל דגירה של תאים עם דילול סדרתי של AMPs (בחיץ או בתווך) בלוחות 96 בארות. קיימות מספר שיטות להערכת הפעילות האנטי פטרייתית לאחר הדגירה. טכניקה שתוארה על ידי מכון התקנים למעבדה קלינית משתמשת בהערכה חזותית טהורה של עכירות הבארות כדי לקבוע את הריכוז המינימלי (MIC) לעיכוב מוחלט של הצמיחה (עיכוב של לפחות 50% עבור חומרים אנטי פטרייתיים נבחרים, כמו azoles ו echinocandins) ואינה מספקת כימות של צמיחה בריכוזים sub-MIC18 . גישה נפוצה נוספת כוללת כימות הכדאיות לאחר הדגירה עם AMPs על ידי ציפוי תכולת הבארות על לוחות אגר, דגירה על הצלחות, ולאחר מכן ספירת מספר יחידות יוצרות מושבה (CFUs) על הצלחת. שיטה זו שימשה להערכת מספר פפטידים, כולל פפטידים מבוססי היסטטין 5, LL-37, ולקטופריןאנושי 19,20,21. טכניקה זו דורשת נפח גדול יחסית של אגר ומספר גבוה של צלחות וכרוכה בספירה מייגעת של CFUs על הצלחות. כדי לקבל נתונים כמותיים יותר תוך יצירת פחות פסולת פלסטיק והימנעות מספירת CFUs, ניתן להשתמש בתכולת הבארות כדי לחסן מדיום טרי בצלחת נוספת בת 96 בארות. לאחר הדגירה על הצלחת שזה עתה חוסנה, ניתן לכמת את הגידול על ידי מדידת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600) בקורא לוחות ספיגה. שיטה זו שימשה לקביעת הפעילות האנטי פטרייתית של היסטטין 5 ומקטעי הפירוק שלו ופפטידים חודרי תאים 17,22,23,24,25.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבדוק את הפעילות האנטי-פטרייתית של פפטידים ומשתמש בשיטת OD600 כדי לכמת את הפחתת הכדאיות של C. albicans עקב פפטידים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקבל אישור מאוניברסיטת מרילנד, קולג 'פארק, ועדת בטיחות ביולוגית מוסדית (IBC) לעבודה עם C. albicans בפרוטוקול זה (PN 274). זן C. albicans SC5314 (ראה טבלת חומרים) שימש במחקר הנוכחי; עם זאת, ניתן להשתמש גם בכל זן אחר.

1. הכנת החיץ, המים הסטריליים ומדיום התרבית

  1. הכינו חיץ סטרילי של נתרן פוספט 0.1 מ' (NaPB)26 ב-pH 7.4, ודללו ל-2 מ"מ ו-1 מ"מ במים סטריליים. הכנת 100 מ"ל כל אחד של 2 mM NaPB ו 1 mM NaPB יהיה יותר ממספיק עבור רוב היישומים של פרוטוקול זה.
  2. הכינו שמרים נוזליים סטריליים-פפטון-דקסטרוז (YPD, ראו טבלת חומרים) בינוניים (10 גרם/ליטר תמצית שמרים, 20 גרם/ליטר דקסטרוז, 20 גרם/ליטר פפטון). הכנת 100 מ"ל של YPD יהיה יותר ממספיק עבור רוב היישומים של פרוטוקול זה.
  3. הכינו מים סטריליים טהורים במיוחד. הכנת 100 מ"ל מים תהיה די והותר לרוב היישומים של פרוטוקול זה.
    הערה: החוצצים, המדיה והמים מעוקרים על ידי autoclaving ב 121 ° C במחזור נוזלי לזמן מתאים בהתבסס על נפח במיכלים להיות autoclaved27. לדוגמה, עבור בקבוקים המכילים 500 מ"ל, זמן החשיפה צריך להיות 40 דקות.

2. חיסון, תרבית וטיפוח משנה של C. albicans

זהירות: עקוב אחר כל התקנות המוסדיות והממשלתיות לעבודה עם C. albicans, המסווג לעתים קרובות על ידי מוסדות מחקר אקדמיים כאורגניזם ברמת בטיחות ביולוגית (BSL) 2 ללא קשר לעמידות לתרופות ועל ידי אוסף תרביות הסוג האמריקאי (ATCC) כאורגניזם BSL1 או BSL2, בהתאם לעמידות לתרופות של הזן28.

הערה: בצע את חלקי החיסון והטיפוח של שלב זה (שלבים 2.1-2.2) יום לפני תחילת הבדיקה לפעילות אנטי פטרייתית. במידת האפשר, בצע את כל שלבי הפרוטוקול עם התאים (והתמיסות שיודגרו עם התאים) בארון בטיחות ביולוגית.

  1. יש לחסן את זן C. albicans הרצוי ל-10 מ"ל של תווך YPD בצינורית תרבית.
    הערה: ניתן לחסן את התרבית ממלאי מקפיא או מצלחת אגר, אך יש להשתמש במקור עקבי לכל הנתונים שיושוו.
  2. הגדל את התרבית בן לילה (~ 12-16 שעות) ב 30 ° C ו 230 סל"ד על שייקר סיבובי.
  3. תת-תרבות תרבות הלילה של C. albicans, ולגדול OD600 של ~ 1.0-1.2.
    1. מדוד את OD600 של תרבית הלילה באמצעות ספקטרופוטומטר UV (ראה טבלת חומרים).
    2. בהתבסס על OD 600 של תרבית הלילה, השתמש בתרבית הלילה כדי לחסן תת-תרבות ב OD600 של 0.1 ב10 מ"ל של YPD.
    3. גדל את תת-התרבות ב 30 ° C על שייקר סיבובי ב 230 סל"ד עד OD600 מגיע ~ 1.0-1.2, אשר צפוי לקחת 4-6 שעות. השלם את שלב 3 (הכנת תמיסות פפטידיות) בזמן שתת-התרבות גדלה; תת-התרבות תדולל לשימוש בבדיקה בשלב 4.

3. הכנת תמיסות הפפטיד בצלחת 96 בארות

הערה: שלב זה עשוי להיעשות מראש, אם פתרונות מלאי הפפטיד יציבים במהלך האחסון. בדרך כלל, תמיסות הפפטיד מאוחסנות בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש. ניתן להפשיר אותם באמבט מים בטמפרטורת החדר לפני שממשיכים לשלב הבא.

  1. לקבוע את הריכוז הגבוה ביותר של כל פפטיד להיבדק בבדיקה. זה ישתנה בהתאם לפפטידים שנבחרו. עבור הנתונים המוצגים בסעיף התוצאות המייצגות, נבדקו היסטטין 5 ואנלוגים מהונדסים22 , והריכוז הגבוה ביותר שנבדק היה 50 מיקרומטר.
    הערה: הריכוז הגבוה ביותר שיש לבדוק נקבע באמצעות נתונים המדווחים בספרות או על ידי ביצוע ניסויים מקדימים על פני טווח רחב של ריכוזי פפטידים. במידת האפשר, יש לבחור את הריכוז הגבוה ביותר לצפייה במישור להפחתה מלאה בכדאיות בריכוזים הגבוהים ביותר שנבדקו ומישור ללא ירידה בכדאיות בריכוזים הנמוכים ביותר שנבדקו, המאפשר כימות של כל טווח פעילות הפפטידים.
  2. ממיסים כל פפטיד במים סטריליים בריכוז כפול מהריכוז הגבוה הרצוי. עבור הנתונים המוצגים בסעיף התוצאות המייצגות, 150 μL של 100 מיקרומטר פתרונות של histatin 5 אנלוגים מהונדסים הוכנו במים סטריליים.
    הערה: אם פפטיד אינו מסיס במים, ייתכן שיהיה צורך במסיסות בממס אחר לפני שלב זה. דימתיל סולפוקסיד (DMSO) משמש בדרך כלל להמסת פפטידים בריכוז גבוה לפני דילול לריכוז העבודה. ודא כי הריכוז הסופי של DMSO הוא 1% (v/v) או נמוך יותר29 וכי ממסים חלופיים אינם משפיעים על הצמיחה של התאים. כמו כן, ודא כי ריכוז הממס נשמר קבוע בכל הבארות בשלבים 3.4-3.5.
  3. הוסף 40 μL של תמיסות מלאי הפפטיד הרצויות לבאר הראשונה (עמודה 1) של כל שורה בלוח תרבית בעל 96 בארות בעלות תחתית עגולה (ראה טבלת חומרים). צלחת זו היא צלחת 1 (איור 1).
    הערה: בכל לוח יש שמונה שורות המשמשות לבדיקת פפטידים. שורות אלה יכולות לשמש עבור פפטידים שונים או עבור העתקים של אותם פפטידים. כלול רק פפטיד אחד בכל שורה.
  4. הוסף 20 μL של מים סטריליים אולטרה-טהורים לעמודה 2 לעמודה 12 של השורות המכילות פפטיד (איור 1).
    הערה: אם מלאי הפפטיד הוכן עם ממס שאינו מים טהורים בשלב 3.2, יש להחליף את המים הסטריליים בשלב זה בממס הקיים במלאי הפפטיד שנוסף לעמודה הראשונה. לדוגמה, אם הפפטיד היה מסיס ב-DMSO ומלאי הפפטיד מכיל 1% (v/v) DMSO במים, יש להוסיף מים המכילים 1% DMSO לעמודה 2 לעמודה 12.
  5. דללו באופן סדרתי את תמיסות מלאי הפפטידים, לרוחב הצלחת לעמודה 10 (איור 1).
    הערה: במקום לבצע את הדילולים הסדרתיים בצלחת כמתואר להלן, ניתן לבצע את הדילולים גם בצינורות מיקרו-צנטריפוגות ולהעביר לצלחת בעלת 96 הקידוחים.
    1. מוציאים 20 μL מעמודה 1, מעבירים אותה לעמודה 2 ומערבבים על-ידי פיטום למעלה ולמטה. עמודה 2 מכילה כעת 40 μL של תמיסת פפטיד בדילול של 1:2 של הריכוז בעמודה 1.
    2. הסר 20 μL מעמודה 2, העבר אותה לעמודה 3, וערבב על-ידי פיפטציה למעלה ולמטה, כך שעמודה 3 מכילה כעת 40 μL של תמיסת פפטיד בדילול של 1:4 של הריכוז בעמודה 1.
    3. חזור על תהליך זה עד שעמודה 10 מכילה 40 μL של תמיסת פפטיד בדילול של 1:512 של הריכוז בעמודה 1.
    4. הסר 20 μL של תמיסת פפטיד מעמודה 10 והשלך אותה. כל עמודה מכילה כעת 20 מיקרוליטר של תמיסת פפטיד (עמודות 1-10) או מים (עמודה 11 ועמודה 12).
      הערה: הבארות בטור 11 משמשות כבקרות סטריליות, והבארות בטור 12 משמשות כבקרות שאינן מכילות פפטידים.

4. דילול תת-התרבות C. albicans

הערה: התחל שלב זה לאחר שתרבות המשנה הגיעה ל- OD600 של ~1.0-1.2 (שלב 2.3.3).

  1. מעבירים את תת-התרבית לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל, וצנטריפוגה במינון 3,900 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגרוף את התאים. הסר את supernatant על ידי pipetting או decanting.
  2. להשעות מחדש את הגלולה עם 1 מ"ל של 2 mM NaPB (שלב 1.1), ולהעביר את המתלה לצינור צנטריפוגה 1.7 מ"ל.
  3. גלולה את התאים (כמו בשלב 4.1), להשליך את supernatant, ושוב להשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של 2 mM NaPB.
  4. חזור על שלב 4.3 פעמיים נוספות כדי להשאיר את התאים שטופים ב 1 מ"ל של 2 mM NaPB.
  5. קבע את צפיפות התא של התרחיף השטוף, וחשב את גורם הדילול הדרוש לקבלת צפיפות תאים של 5 x 105 תאים / מ"ל. ריכוז זה יוביל בסופו של דבר להוספת 1 x 104 תאים לכל באר של צלחת 96 בארות.
    הערה: ניתן לקבוע את צפיפות התאים של המתלה באמצעות מספר שיטות, כולל המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעקומה סטנדרטית של צפיפות תאים לעומת OD600 עבור הזן המעניין שגדל בתנאים רלוונטיים. עקומה זו הוכנה באמצעות המוציטומטר (ראה טבלת חומרים) כדי לקבוע את צפיפות התאים של מתלים עם ערכי OD600 משתנים.
  6. לדלל את תרחיף התא ל 5 x 105 תאים / מ"ל ב 2 mM NaPB. הכנת 10 מ"ל של השעיה מדוללת זו תהיה די והותר להשלמת מחקר זה.

5. דגירה של C. albicans עם תמיסות פפטידיות והכנת התאים לכימות הכדאיות

  1. הוסף 20 μL של מתלה C. albicans המדולל (שלב 4.6) לעמודות 1-10 ולעמודה 12 של כל שורה (איור 1).
    הערה: ריכוז הפפטיד הסופי בעמודה הראשונה הוא כעת מחצית מריכוז מלאי הפפטידים. במחקר הנוכחי, ריכוז הפפטיד הסופי היה 50 מיקרומטר בשלב זה. תרחיף התא הסופי בכל באר מכיל 2.5 x 105 תאים / מ"ל. עמודות 1-10 משמשות כבארות ניסוי להערכת הפעילות האנטי-פטרייתית בריכוזי פפטידים שונים, ועמודה 12 משמשת כבקרה לגדילה ללא פפטידים.
  2. הוסף 20 μL של 2 mM NaPB לעמודה 11. לכל הבארות יש כעת ריכוז סופי של 1 mM NaPB. טור 11 משמש כבקרת סטריליות.
  3. מכסים את צלחת 1 (המכילה גם תאים וגם פפטידים), ודגרו עליה בטמפרטורה של 30°C למשך 30 דקות.
    הערה: זמן דגירה של 30 דקות מספיק לפפטידים רבים 17,21,22,30, אך ניתן להגדיל את זמן הדגירה ל-60 דקות אם רוצים לקחת בחשבון פפטידים שעשויים לדרוש זמן רב יותר כדי להפעיל את הפעילות האנטי-פטרייתית שלהם 25,31,32.
  4. הכינו צלחת תרבית חדשה בת 96 בארות (צלחת 2) לשימוש בכימות הכדאיות (איור 2).
    הערה: יש להכין את צלחת התרבית במהלך הדגירה של צלחת 1.
    1. הוסף 100 μL של YPD (שלב 1.2) לכל הבארות של הצלחת.
    2. הוסף 100 μL של 2 mM NaPB (שלב 1.1) לכל בארות הצלחת.
  5. מדללים את הדגימות בצלחת 1 (המכילה תאים ופפטידים), ומעבירים לצלחת 2 (המכילה תווך וחיץ).
    1. שלפו את צלחת 1 מהאינקובטור לאחר 30 דקות הדגירה.
    2. דללו כל באר של לוח 1 על-ידי הוספת 280 μL של 1 mM NaPB (שלב 1.1) לקבלת נפח כולל של 320 μL בכל באר (איור 2).
    3. ערבבו את כל הבארות המכילות תאים ופפטידים על ידי צנרת למעלה ולמטה כדי להבטיח שכל התאים מרחפים מחדש ולא נראים תאים מיושבים בתחתית הבארות.
    4. מעבירים 8 μL מכל באר בצלחת 1 לבאר המתאימה של צלחת 2. נפח זה מעביר כ-250 תאים מכל באר של לוח 1 לתוך לוח 2 (איור 2).
  6. מכסים את צלחת 2 ודגרים על שייקר צלחת מיקרוטיטר (ראו טבלת חומרים) ב-350 סל"ד למשך 17 שעות ב-30°C.

figure-protocol-1
איור 1: הכנת צלחת 1 לדגירת דילולים סדרתיים פפטידים עם תאים. דילולים סדרתיים של הפפטיד נעשים במים, ותאי C. albicans מתווספים לצלחת 1. צבע כחול מציין כי פפטיד נמצא בבאר, ואפור מציין באר עם מים וללא פפטיד . בארות המכילות תאים מסומנות בתבנית של נקודות שחורות. לאחר שלבים אלה, הצלחת מודגרת כדי לאפשר לפפטיד להפעיל את פעילותו האנטי פטרייתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-2
איור 2: הכנת צלחת 2 לכימות הירידה בכדאיות עקב הפפטיד. YPD בינוני ו- NaPB מתווספים לצלחת 2. לאחר דילול תכולת צלחת 1, אליקוט מכל באר מועבר מצלחת 1 לצלחת 2. לאחר מכן, לוח 2 מודגר כדי לאפשר לכל תא בר קיימא לגדול לצורך כימות על ידי מדידת OD600. עבור לוח 2, בארות המכילות רק YPD ו- NaPB מוצגות בכתום. בארות המכילות אליציטוטים מלוח 1 מעורבבים עם YPD ו-NaPB מוצגים בירוק. ראו את המקרא באיור 1 לתיאור הצבעים בלוח 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. קביעת פעילות אנטי פטרייתית

  1. השג קריאות OD600 עבור כל באר בלוח 2.
    1. מוציאים את צלחת 2 מהאינקובטור לאחר 17 שעות של דגירה.
    2. ערבבו את כל הבארות בצלחת 2 על ידי צנרת למעלה ולמטה כדי להבטיח שכל התאים מרחפים מחדש ולא נראים תאים מיושבים בתחתית הבארות.
      הערה: הימנע מיצירת בועות במהלך שלב זה, מכיוון שהן עלולות להפריע לקריאות OD600 . אם נוצרות בועות, לעתים קרובות ניתן להקפיץ אותן עם קצה פיפט יבש או להסיר אותן באמצעות שני קצוות פיפט כדי להרים אותן מהבאר.
    3. השתמש בקורא לוחות ספיגה (ראה טבלת חומרים) באורך גל של 600 ננומטר כדי לקבל את OD600 עבור כל באר.
  2. חשב את עיכוב הצמיחה (באחוזים), והתווה אותו כדי לקבוע את השפעת הפפטידים על צמיחת C. albicans.
    1. עבור כל באר, חשב את הירידה בכדאיות בהשוואה לבקרה (באחוזים) באמצעות המשוואה הבאה 17,22,23:
      figure-protocol-3
      כאשר OD עם פפטיד הוא OD 600 של באר המכילה ריכוז נתון של פפטיד , רקע OD הוא OD 600 של עמודה 11 באותה שורה (פקד שאינו מכיל תאים), וכן
      ODno peptide הוא OD600 של עמודה 12 באותה שורה (פקד המכיל תאים וללא פפטיד).
    2. לדוגמה, השתמש בביטוי הבא כדי לחשב את הפחתת הכדאיות בבאר B5 מערכי OD600 עבור שורה B:
      figure-protocol-4
  3. התווה את הירידה בכדאיות כפונקציה של ריכוז הפפטידים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש במדידות OD600 לכימות הירידה בגדילה כתוצאה מפפטידים אנטי פטרייתיים חוסך זמן משמעותי בהשוואה לציפוי דגימות וספירת CFU. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה דורשת השלמת השלבים בשלושה ימים שונים. ביום הראשון, יש צורך בכשעה כדי להכין את החוצצים והמדיה (לא כולל זמן העיקור) ולחסן את תרבית ההתחלה של C. albicans לדגירת לילה. ביום השני, השלבים דורשים 5-6 שעות (כולל זמן subculturing) כדי להכין צלחת 96 בארות עבור הדגירה 17 שעות. ביום השלישי, ניתן להשלים את השלבים תוך פחות משעה אחת. החלק של הפרוטוקול הכולל איסוף נתוני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר גישה יעילה לקבלת נתונים כמותיים על הפעילות האנטי פטרייתית של AMPs כנגד הפתוגן הפטרייתי C. albicans. גישה חלופית נפוצה אחת לבדיקת פפטידים וחומרים אנטי פטרייתיים אחרים היא מיקרודילול מרק המתואר בתקן M2718 של מכון התקנים למעבדות קליניות (CLSI), אך תקן זה מתמקד בהשגת תוצאות חזותיות איכותיות במקום בתוצאות כמותיות. גישה חלופית נוספת היא להשתמש בשיטה דומה לזו המתוארת בפרוטוקול זה כדי להכין פפטידים ולדגור עליהם עם תאים ולאחר מכן לצלחת את תכולת הבארות על אגר כדי לספור את מספר CFUs...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R03DE029270, T32AI089621B), הקרן הלאומית למדע (CBET 1511718), מחלקת החינוך (GAANN-P200A180093), ומענק זרעים חוצה קמפוסים של אוניברסיטת מרילנד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות 96 בארות (תחתית עגולה)VWR10062-902
קורא מיקרו-פלטות ספיגהN/AN/Aכל קורא מיקרו-פלטות זמין מספיק
C. אלביקנס זן SC5314ATCC MYA-2876C. albicans אחרים ניתן להשתמש גם
בהמוציטומטרN/AN/Aניתן להשתמש בו כדי ליצור עקומה סטנדרטית המתייחסת למספר התא לשייקר OD600
MicroplateVWR2620-926
פפטיד(ים)N/AN/Aכל ספק אמין יכול לסנתז פפטידים באופן מסחרי; טוהר של ≥ 95% וחומצה טריפלואורואצטית הסרת מלח למלח הידרוכלוריד מומלצים
מאגרי ריאגנטים לפיפטורים רב-ערוצייםVWR18900-320מפשט את הפיפטינג לצלחות מרובות בארות עם פיפטור רב-ערוצי
נתרן פוספט, דו-בסיסיפישר סיינטיפיקBP332-500להכנת NaPB
נתרן פוספט, מונו-בסיסיפישר סיינטיפיקBP329-500להכנת NaPB
ספקטרופוטומטר UVN/A N/Aכל ספקטרופוטומטר UV זמין מספיק
אבקה בינוניתYPD BD Life Sciences242820עשוי להיות עשוי גם מתמצית שמרים, פפטון ודקסטרוז

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  3. de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351(2018).
  4. Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
  5. Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
  6. Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875(2021).
  7. Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779(2020).
  8. Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature's reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532(2021).
  9. Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
  10. Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
  11. Mercer, D. K., O'Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177(2020).
  12. Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691(2021).
  13. Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
  14. Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
  15. Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
  16. do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327(2020).
  17. Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
  18. Clinical Laboratory Standards Institute. M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard - Third edition. , Clinical Laboratory Standards Institute. (2008).
  19. Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
  20. Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196(2016).
  21. den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
  22. Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
  23. Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529(2021).
  24. Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768(2019).
  25. Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
  26. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (2012).
  27. Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves. , Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022).
  28. American Type Culture Collection. , Available from: www.atcc.org (2022).
  29. Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
  30. Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383(2022).
  31. Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d'Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
  32. Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van't Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
  33. Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795(2019).
  34. Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
  35. Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
  36. Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
  37. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754(2012).
  38. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987(2021).
  39. Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

96

מאמרים קשורים