שיטה לחקר רעילות וצבירה של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי

Summary

מודל פיזיולוגי in vivo של α-סינוקלאין נדרש כדי לחקור ולהבין את הפתוגנזה של מחלת פרקינסון. אנו מתארים שיטה לניטור ציטוטוקסיות והיווצרות אגרגטים של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי.

Abstract

מחלת פרקינסון היא ההפרעה הנוירודגנרטיבית השנייה בשכיחותה ומאופיינת במוות תאי מתקדם הנגרם על ידי היווצרות גופי לוי המכילים α-סינוקלאין מקופלים ומצטברים. α-סינוקלאין הוא חלבון קדם-סינפטי בשפע המווסת את הסחר בשלפוחית הסינפטית, אך הצטברות התכלילים החלבניים שלו גורמת לרעילות עצבית. מחקרים אחרונים גילו כי גורמים גנטיים שונים, כולל מלווים חיידקיים, עשויים להפחית את היווצרותם של אגרגטים α-סינוקלאין במבחנה. עם זאת, חשוב גם לעקוב אחר אפקט אנטי צבירה בתא כדי ליישם את זה כטיפול פוטנציאלי עבור החולים. זה יהיה אידיאלי להשתמש בתאים עצביים, אבל תאים אלה קשה לטפל ולוקח הרבה זמן להציג את הפנוטיפ נגד צבירה. לכן, נדרש כלי in vivo מהיר ויעיל להערכה נוספת של פעילות אנטי-צבירה in vivo . השיטה המתוארת כאן שימשה לניטור וניתוח הפנוטיפ האנטי-צבירה בשמרים האנושיים Saccharomyces cerevisiae, שביטאו α-סינוקלאין אנושיים. פרוטוקול זה מדגים כלי in vivo שיכולים לשמש לניטור רעילות תאית הנגרמת על-ידי α-סינוקלאין, כמו גם להיווצרות אגרגטים α-סינוקלאין בתאים.

Introduction

מחלת פרקינסון (PD) היא בעיה רצינית עבור חברות מזדקנות ברחבי העולם. הצבירה של α-סינוקלאין קשורה קשר הדוק למחלת פרקינסון, ואגרגטים חלבוניים של α-סינוקלאין נמצאים בשימוש נרחב כסמן ביולוגי מולקולרי לאבחון המחלה¹. α-סינוקלאין הוא חלבון חומצי קטן (140 חומצות אמינו באורך) בעל שלושה תחומים, כלומר סליל α קושר שומנים N, התחום המרכזי קושר עמילואיד (NAC) והזנב החומצי C-terminal². קיפול שגוי של α-סינוקלאין יכול להתרחש באופן ספונטני ובסופו של דבר מוביל להיווצרות של אגרגטים עמילואידים הנקראים גופי לוי³. α-סינוקלאין עשוי לתרום לפתוגנזה של מחלת פרקינסון במספר דרכים. באופן כללי, הוא חשב כי צור....

Protocol

1. הכנת מדיה ופתרונות

1. היערכות למדיה
   1. כדי להכין מדיום YPD, יש להמיס 50 גרם של אבקת YPD ב-dH₂O כדי ליצור נפח סופי של 1 ליטר. יש לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
   2. כדי להפוך את האגר של YPD לבינוני, יש להמיס 50 גרם אבקת YPD ו-20 גרם אגר ב-1 ליטר של dH₂O. Autoclave לעיקור. לאחר שהתקרר, יוצקים על צלחות פטרי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   3. כדי ליצור SC עם רפינוז (SRd)-Ura בינוני, להמיס 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים עם אמוניום סולפט וללא חומצות אמינו ב 795 מ"ל של dH₂O. Autoclave לעיקור. לפני השימוש יש להוסיף 100 מ"ל של 20% רפינוז, 5 מ"ל של 20% גלוקוז ו-100 מ"ל של 10x -Ura לפני השימוש.
   <....

Results

הביטוי הגבוה של α-סינוקלאין ידוע כקשור למוות תאי עצב ולפרקינסון במערכות מודל של מחלת פרקינסון. מחקר זה מתאר שלוש שיטות לניטור ציטוטוקסיות של α-סינוקלאין והיווצרות מוקדים של α-סינוקלאין מצטברים בשמרים. כאן, הסינוקלאין α התבטא יתר על המידה בשמרים, ונבחנו הפנוטיפים של α-סינוקלאין מסוג בר ושלוש גרסאות של α-סינוקלאין הידועות כמוטנטים משפחתיים של PD (איור 1 וטבלת החומרים).

הביטוי α-סינוקלאין תחת מקדם GAL1 בווקטור pRS426 הראה פיגור גדילה משמעותי.......

Discussion

בהתחשב במורכבות של מערכות תאיות שונות בבני אדם, כדאי להשתמש בשמרים כמודל לחקר מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות. למרות שכמעט בלתי אפשרי לחקור את האינטראקציות התאיות המורכבות של המוח האנושי באמצעות שמרים, מנקודת מבט של תא בודד, לתאי שמרים יש רמה גבוהה של דמיון לתאים אנושיים במונחים של הומולוגיה של רצף גנומי ותהליכים תאיים אאוקריוטים בסיסיים ^8,13. יתר על כן, בהתחשב בקלות של מניפולציה גנטית, שמרים יכולים להקל על המחקר של מערכות אנושיות מורכבות ותובעניות. לכן, שמרים כבר .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 באר צלחת	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
לנשום קל	ביוטק מגוון	BEM-1	קרום איטום חדיר גז למיקרוטיטר צלחות
כיסוי משקפיים	Marienfeld		24 x 60 מ"מ
צינור תרבות	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-גלקטוז	סיגמא	G0625
D-(+)-גלוקוז	סיגמא	G8270
D-(+)-רפינוז פנטהידראט	Daejung	6638-4105
חממה (רועד)	לבטרון		: SHI1
אינקובטור (סטטי)	ראייה מדעית		דגם: VS-1203PV-O
LiAc	סיגמה	L6883
קורא מיקרופלייט	Tecan	30050303 01	דגם: פיפטה רב-ערוצית אינסופית 200 פרו
20-200 ומיקרו; ל	גילסון	FA10011
פיפטה רב ערוצית 2-20 ומיקרו; L	גילסון	FA10009
מיקרוסקופ אולימפוס אולימפוס		IX-53
PEG	סיגמא	P4338	ממוצע מול משקל 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			כריסטיאנסון, ט.ו., סיקורסקי, ר.ס., דנטה, מ., שרו, ג'יי.ה. & Hieter, P. וקטורי מעבורת שמרים רב תכליתיים עם מספר עותק גבוה. גן. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P			Outeiro, T. F. & לינדקוויסט, ס. תאי שמרים מספקים תובנה לגבי ביולוגיה ופתוביולוגיה של אלפא-סינוקלאין. מדע. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 מקדם α-synuclein A53T			Outeiro, T. F. & לינדקוויסט, ס. תאי שמרים מספקים תובנה לגבי ביולוגיה ופתוביולוגיה של אלפא-סינוקלאין. מדע. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K			Outeiro, T. F. & לינדקוויסט, ס. תאי שמרים מספקים תובנה לגבי ביולוגיה ופתוביולוגיה של אלפא-סינוקלאין. מדע. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT			Outeiro, T. F. & לינדקוויסט, ס. תאי שמרים מספקים תובנה לגבי ביולוגיה ופתוביולוגיה של אלפא-סינוקלאין. מדע. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
מאגר	SPL	23050
ספקטרופוטומטר	אפנדורף	6131 05560
W303a			מתנה מג'יימס בארדוול
בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו	Difco	291940
שמרים סינתטיים נשירה בינונית תוספי מזון ללא אורציל	סיגמא	Y1501
YPD	קונדלב	1547.00