הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקמת אורגנואידים 3D רירית הרחם מרחם העכבר

8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64448

⸱

6 בינואר 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות לביסוס אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם של עכברים לביטוי גנים וניתוחים היסטולוגיים.

תקציר

רקמת רירית הרחם מסדרת את החלל הפנימי של הרחם ונמצאת תחת שליטה מחזורית של אסטרוגן ופרוגסטרון. זוהי רקמה המורכבת מאפיתל לומינלי ובלוטתי, תא סטרומלי, רשת כלי דם ואוכלוסיית תאי חיסון מורכבת. מודלים של עכברים היו כלי רב עוצמה לחקר רירית הרחם, וחשפו מנגנונים קריטיים השולטים בהשתלה, בהשליה ובסרטן. הפיתוח האחרון של תרביות אורגנואידיות רירית הרחם התלת-ממדיות מציג מודל חדשני לניתוח מסלולי האיתות העומדים בבסיס הביולוגיה של רירית הרחם. ביסוס אורגנואידים של רירית הרחם ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית, ניתוח התמלילים שלהם והדמיה של המורפולוגיה שלהם ברזולוציה של תא בודד הם כלים חיוניים לחקר מחלות רירית הרחם. מאמר זה מתווה שיטות לביסוס תרביות תלת-ממדיות של אפיתל רירית הרחם מעכברים ומתאר טכניקות לכימות ביטוי גנים ולניתוח ההיסטולוגיה של האורגנואידים. המטרה היא לספק משאב שניתן להשתמש בו כדי לבסס, לתרבת ולחקור את ביטוי הגנים והמאפיינים המורפולוגיים של אורגנואידים אפיתליאליים רירית הרחם.

מבוא

רירית הרחם - רקמת הרירית הפנימית של חלל הרחם - היא רקמה ייחודית ודינמית מאוד הממלאת תפקידים קריטיים בבריאות הרבייה של האישה. במהלך חיי הרבייה, רירית הרחם טומנת בחובה פוטנציאל לעבור מאות מחזורים של התפשטות, התמיינות ופירוק, המתואמים על ידי הפעולה המרוכזת של הורמוני השחלות - אסטרוגן ופרוגסטרון. מחקרים על עכברים מהונדסים גנטית חשפו מנגנונים ביולוגיים בסיסיים העומדים בבסיס תגובת רירית הרחם להורמונים ובקרה על השתלת עוברים, דצידואליזציה של תאים סטרומליים והריון1. עם זאת, מחקרים במבחנה היו מוגבלים בשל קשיים בשמירה על רקמות רירית הרחם העיקריות של עכברים שלא עברו טרנספורמציה בתרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות 2,3. ההתקדמות האחרונה בתרבית של רקמות רירית הרחם כמערכות איברים תלת-ממדיות, או אורגנואידים, מהווה הזדמנות חדשה לחקור מסלולים ביולוגיים השולטים בהתחדשות והתמיינות תאי רירית הרחם. מערכות אורגנואידיות של רירית הרחם של עכברים ובני אדם פותחו מאפיתל רירית הרחם טהור עטוף במטריצות שונות4,5, בעוד רירית הרחם האנושית תורבית כתרביות אפיתל/סטרומליות ללא פיגומים6,7, ולאחרונה כמכלולי אפיתל/סטרומלים ללא קולגן8 . פוטנציאל הצמיחה וההתחדשות של תרביות אפיתל אורגנואידיות נתמך על ידי קוקטייל מוגדר של גורמי גדילה ומעכבי מולקולות קטנות שנקבעו אמפירית כדי למקסם את הצמיחה וההתחדשות של האורגנואידים 4,5,9. יתר על כן, היכולת להקפיא ולהפשיר אורגנואידים של רירית הרחם מאפשרת בנקאות ארוכת טווח של אורגנואידים רירית הרחם מעכברים ובני אדם למחקרים עתידיים.

עכברים מהונדסים גנטית חשפו את מסלולי האיתות המורכבים השולטים בתחילת ההריון ובדצידוליזציה, ושימשו כמודלים של אובדן הריון, סרטן רירית הרחם ואנדומטריוזיס. מחקרים גנטיים אלה הושגו במידה רבה עם מחיקה ספציפית לתאים של אללים מסוג loxP ("floxed") באמצעות רקומבינאזות cre הפעילים במיוחד ברקמות הרבייה הנשיות. מודלים אלה של עכברים כוללים את קולטן הפרוגסטרון-cre10 הנמצא בשימוש נרחב, בעל פעילות רקומבינאז חזקה ברקמות אפיתל רירית הרחם והסטרומלית, לקטופרין i-cre, הגורם לרקומבינציית אפיתל רירית הרחם בעכברים בוגרים 11, או Wnt7a-cre, המעורר מחיקה ספציפית לאפיתל ברקמות שמקורן במולריאן12 . גידול רקמות רירית הרחם ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית כאורגנואידים תלת-ממדיים סיפק הזדמנות מצוינת לחקור את הביולוגיה של רירית הרחם ולהקל על זיהוי גורמי גדילה ומסלולי איתות השולטים בחידוש תאי רירית הרחם ובהתמיינות13,14. שיטות לבידוד ותרבית של רקמת רירית הרחם של העכבר מתוארות בספרות ומדווחות על שימוש באסטרטגיות אנזימטיות שונות לבידוד אפיתל הרחם להתרבות הבאה של אורגנואידים אפיתל רירית הרחם4. בעוד שספרות קודמת מספקת מסגרת קריטית לפרוטוקולים של תרביות אפיתל רירית הרחם 4,5,6, מאמר זה מספק שיטה ברורה ומקיפה ליצירה, שמירה, עיבוד וניתוח של אורגנואידים אלה. סטנדרטיזציה של טכניקות אלה חשובה להאצת ההתקדמות בתחום הביולוגיה של הרבייה של נשים. כאן אנו מדווחים על מתודולוגיה מפורטת לטיהור אנזימטי ומכני של רקמת אפיתל רירית הרחם של עכבר עבור התרבית הבאה של אורגנואידים רירית הרחם בפיגום מטריצת ג'ל. אנו מתארים גם את המתודולוגיות לניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים במורד הזרם של אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם של עכבר עטוף במטריצת ג'ל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

טיפול בעכבר ומחקרים ניסיוניים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מכללת ביילור לרפואה והנחיות שנקבעו על ידי מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. בידוד אפיתל הרחם מעכברים בשיטות אנזימטיות ומכניות

הערה: סעיף זה מתאר את השלבים הנדרשים כדי ליצור, לעבור, להקפיא ולהפשיר אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם מעכברים באמצעות פיגום מטריצת ג'ל. מחקרים קודמים קבעו כי תרביות אופטימליות של אורגנואידים רירית הרחם של עכברים נקבעות מעכברים במהלך שלב4 estrus, אשר ניתן לקבוע על ידי בדיקה ציטולוגית של ספוגית נרתיק15. נקבות עכברי WT בוגרות (בנות 6-8 שבועות, C57BL/6J היברידי ו-129S5/SvEvBrd) שימשו לכל הניסויים. העכברים הומתו באופן הומני על פי הנחיות שאושרו על ידי IACUC באמצעות טשטוש איזופלורן ואחריו דיסארטיקולציה של צוואר הרחם. לאחר הרדמת העכברים, יש לבצע את השלבים הבאים. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לחומרים ולפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

  1. יש להפשיר את מטריצת הג'ל על הקרח למשך כ-1-2 שעות לפני השימוש.
  2. כדי לנתח את העכבר, השתמש במספריים כדי לבצע חתך בקו האמצע על הבטן ולקלף בעדינות את העור בחזרה כדי לחשוף את שכבת הצפק שמתחת. השתמש מלקחיים כדי להחזיק את שכבת הצפק ולעשות חתכים לרוחב עם מספריים כדי לחשוף את תוכן הבטן.
    1. אתר את קרני הרחם על ידי הזזה עדינה של כריות שומן הבטן הצידה. נתחו אותם על ידי החזקתם תחילה בצומת צוואר הרחם ושימוש במספריים כדי לחתוך לאורך השומן המזנטרי. לאחר כריתה של רחם העכבר, להסיר ביסודיות רקמת שומן מן קרן הרחם עם מספריים קטנים.
      הערה: שמור על סטריליות במהלך בידוד התאים על ידי עיקור כל כלי הניתוח לפני השימוש, רסס את בטן העכבר ב-70% אתנול ובצע את כל השלבים שלאחר כריתה תחת מכסה מנוע של תרבית רקמה סטרילית.
  3. חותכים כל קרן רחם לשברים קטנים, כל אחד בגודל של כ 4-5 מ"מ.
  4. מניחים את כל שברי הרחם מרחם אחד לבאר אחת של צלחת בת 24 בארות המכילה 0.5 מ"ל של 1% טריפסין. אפשר את הפתרון האנזימטי להיכנס לומן הרחם, גרימת הפרדה אנזימטית של אפיתל רירית הרחם מן stroma התחתון.
  5. לדגום את צלחת 24 באר בחממה תרבית רקמה לחה של 37 מעלות צלזיוס במשך כשעה.
  6. לאחר הדגירה של שעה, מעבירים את שברי הרחם לצלחת תרבית רקמה בקוטר 35 מ"מ המכילה 1 מ"ל של תמיסת אגירת פוספטים (DPBS) של דולבקו.
  7. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש מלקחיים עדינים פיפטה 1 מ"ל כדי להפריד מכנית את אפיתל הרחם מן צינור הרחם. תוך כדי החזקת קצה אחד של שבר הרחם עם המלקחיים, הפעל בעדינות את קצה הפיפטה לאורך השבר, וסוחט את האפיתל מהקצה השני של צינור הרחם. שימו לב ליריעות האפיתל המופרדות מקטע הרחם תחת מיקרוסקופ הדיסקציה.
  8. השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לאסוף ולהעביר בעדינות את יריעות האפיתל לתוך צינור 1.5 מ"ל.
  9. חזור על התהליך עבור שברי הרחם הנותרים, העברת כל יריעות האפיתל לאותו צינור איסוף.
  10. גלולה את יריעות האפיתל המנותקות על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 375 × גרם.
  11. הסר בזהירות את הסופרנטנט כדי למנוע הפרעה לכדור התא.
  12. יש להשהות את גלולת התא ב-0.5 מ"ל של קולגן במינון 2.5 מ"ג/מ"ל + תמיסת DNase של 2 מ"ג/מ"ל. פיפטה למעלה ולמטה בערך פי 10, או עד להשגת השעיה של תא בודד.
  13. יש להוסיף 0.5 מ"ל של DMEM/F12 + 10% סרום בקר עוברי (FBS) + אנטיביוטיקה, ולבצע צנטריפוגה בתאים למשך 5 דקות ב-375 × גרם.
    הערה: למידע נוסף על האנטיביוטיקה רחבת הטווח המשמשת לתרבית תאים, עיין בטבלת החומרים.
  14. הסר בזהירות את הסופרנטנט והושיע מחדש את התאים ב-1 מ"ל של DMEM/F12 + 10% FBS + אנטיביוטיקה. צנטריפוגה של התאים במשך 5 דקות ב 375 × גרם.

2. עיבוד של תא stromal

הערה: סעיף זה מתאר את הפרוטוקולים הדרושים לבידוד התא הסטרומלי של רירית הרחם של העכבר. לאור העניין הגובר בניסויים בתרבית אפיתל/סטרומלית, חשוב להיות מסוגלים לעבד את אוכלוסיות התאים הסטרומליים בנוסף לתאי האפיתל שייצרו אורגנואידים.

  1. לאחר שכל האפיתל הופרד באופן אנזימטי ומכני משברי הרחם, המבנים דמויי הצינור הנותרים הם התאים "הסטרומלים/מיומטריים". אסוף רקמה זו בקולגן של 2.5 מ"ג/מ"ל + 2 מ"ג/מ"ל DNase בתמיסת HBSS.
  2. דגרו את הדגימה הסטרומלית/מיומטרלית על שייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  3. לאחר הדגירה, יש להוסיף 500 μL של DMEM/F12 + 10% FBS + אנטיביוטיקה לכל עכבר, ולסנן את השברים שאינם מנותקים דרך מסנן תאים של 40 מיקרומטר.
  4. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 375 × גרם.
  5. הסר בזהירות את הסופרנטנט ושלח מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של DMEM/F12 + 10% FBS + אנטיביוטיקה. הוסיפו את התערובת ל-10 מ"ל של DMEM/F12 + 10% FBS + אנטיביוטיקה בצלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ. לדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית תאים לחות.
  6. כדי ליצור תרביות משותפות של תאי אפיתל רירית הרחם של עכברים ותאי סטרומל, בצע את השיטות המתוארות עבור אורגנואידים אנושיים של רירית הרחם באמצעות מערכות נטולות פיגומים או מטריצת קולגן 6,8.
    הערה: בעוד שטכניקות אלה טרם פורסמו עבור עכברים, ניתן להתאים אותן על סמך הפרוטוקולים שפורסמו עם רירית הרחם האנושית.

3. אנקפסולציה של אפיתל הרחם לתוך מטריצת ג'ל כדי ליצור אורגנואידים

הערה: יש לשמור את מטריצת הג'ל על קרח עד שהיא מוכנה לשימוש.

  1. הסר את הסופר-נאטנט ושלח מחדש את כדור התא בנפח של מטריצת ג'ל שהוא פי 20 מזה של כדור התא (כלומר, אם כדור התא הוא 20 μL, להשעות את התאים עם 400 μL של מטריצת ג'ל). יש להשעות את הכדור בזהירות כדי למנוע החדרת בועות.
  2. אפשרו למטריצת הג'ל/מתלה התא לשקוע בטמפרטורת החדר למשך ~10 דקות.
  3. ברגע שמטריצת הג'ל/תרחיף התא הופכת לג'ל מוצק למחצה, השתמש במיקרופיפט P200 עם קצה רחב של 200 μL כדי לשאוף בעדינות 25 μL של מטריצת הג'ל / תרחיף התא. יש לפזר שלוש כיפות נפרדות של 25 μL לכל באר של צלחת 12 בארות, ולאפשר למטריצת הג'ל לרפא במשך 15 דקות באינקובטור תרבית רקמה לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר שמטריצת הג'ל נרפאה, הוסף 750 μL של מדיום אורגנואידי לכל באר המכילה כיפות מטריצת ג'ל. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמה לחות.
    הערה: נוסחת המדיה האורגנואידית מצוינת בטבלת החומרים. אורגנואידים נוצרים בדרך כלל תוך 4 ימים מהתרבית הראשונית.

4. ניתוח ביטוי גנים של אורגנואידים רירית הרחם לאחר טיפול באסטרדיול

הערה: סעיף זה מתאר את השיטות המשמשות לפרופיל ביטוי הגנים של אורגנואידים אפיתליאליים רירית הרחם באמצעות qPCR בזמן אמת לאחר טיפול באסטרדיול (E2; ראה טבלה 1). מכיוון שהאנדומטריום נמצא תחת שליטה מחזורית של הורמון השחלות E2, בדיקת ההיענות של האורגנואידים ל- E2 היא מדד חשוב לתפקוד הפיזיולוגי. השגנו RNA באיכות גבוהה ויצרנו מספיק mRNA כדי ליצור פרופיל של ביטוי גנים באמצעות qPCR ו/או ריצוף RNA מהאורגנואידים האפיתליאליים של רירית הרחם שלנו. חלק זה מתאר כיצד לאסוף אורגנואידים ולעבד אותם לניתוח במורד הזרם של ביטוי גנים. מדיום הטיפול שנבחר משקף את זה המשמש לטיפול בתאי רירית הרחם בתרבית. עם זאת, יש לציין כי אמצעי טיפול זה יכול להיות מותאם בהתאם, כפי שנעשה לטיפול של תרביות 3D רירית הרחם האנושית עם הורמונים 8,16,17.

  1. תרבית את האורגנואידים רירית הרחם כמתואר לעיל.
  2. הסר את המדיום האורגנואידי והחלף אותו עם 750 μL של מדיום רעב ארבעה ימים לאחר הזריעה. לדגור לילה.
  3. למחרת בבוקר, הסר את מדיום הרעב. הוסף 750 μL של אמצעי טיפול המכיל את הרכב או 10 nM E2. דגירה במשך 48 שעות.
  4. המשך בבידוד RNA בהתאם לפרוטוקול של יצרן הערכה.

5. ניתוח היסטולוגי של אורגנואידים רירית הרחם

הערה: הדמיית התכונות המורפולוגיות של אורגנואידים רירית הרחם היא קריטית להערכת ההשפעה התאית של גורמי גדילה, מניפולציות גנטיות או מעכבי מולקולות קטנות. חלק זה מתאר את הטכניקות המשמשות לתיקון, עיבוד והדמיה של אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם באמצעות כתמים היסטולוגיים וכתמים אימונופלואורסצנטיים של נוגדנים.

  1. הכינו צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכילים 1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד ב-PBS אחד. מניחים אותם על קרח.
  2. שאפו את המדיום מהבארות של צלחת 12 הבאר המכילה את האורגנואידים.
  3. באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל עם קצה חיתוך, העבר 500 μL של 4% paraformaldehyde לכל באר בעדינות לנתק את כיפות מטריצת ג'ל מתחתית הצלחת.
  4. שאפו בעדינות את כל כיפות מטריצת הג'ל לתוך קצה הפיפטה והעבירו לצינור המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  5. תקן את האורגנואידים על ידי הנחתם על מסובב ב 4 מעלות צלזיוס לילה.
  6. למחרת בבוקר, צנטריפוגה את הצינור ב 600 × גרם במשך 5 דקות כדי לזרוק את האורגנואידים. הסר בעדינות את תמיסת 4% paraformaldehyde עם פיפטה והשלכו. לשטוף את האורגנואידים 2x עם 70% אתנול.
  7. לאחר הכביסה האחרונה, הסר את כל מלבד 50-100 μL של אתנול מן הצינור. מניחים את הצינור בצד.
  8. מניחים צינור של ג'ל לעיבוד דגימות באמבט מים ובמיקרוגל למשך ~ 30 שניות כדי להמיס את הג'ל. ודא שג'ל עיבוד הדגימה אינו רותח על ידי ניטור עקביות הג'ל.
    הערה: לאחר שג'ל עיבוד הדגימה נמס, אך לא רותח חם, יש לעבוד במהירות כדי לעטוף את האורגנואידים.
  9. מעבירים מספיק ג'ל לעיבוד דגימות כדי לכסות את כל פני השטח של התבנית (כ-250 μL).
  10. בעוד ג'ל עיבוד הדגימה עדיין מותך, להעביר במהירות את 50 μL של 70% אתנול פתרון המכיל את האורגנואידים. ודא כי האורגנואידים שקועים או נדחפים לחלק התחתון של התבנית.
  11. מניחים את התבנית ההיסטולוגית על דלי קרח ומאפשרים לג'ל עיבוד הדגימה להתקרר ולהתמצק.
  12. לאחר שג'ל עיבוד הדגימה יבש לחלוטין, העבירו בזהירות את ריבוע ג'ל עיבוד הדגימה לשקית דגימה, תוך מעקב אחר המטוס שבו נמצאים האורגנואידים.
  13. מניחים את השקית בקלטת היסטולוגיה ומעבדים בשיטות סטנדרטיות המשמשות לקיבוע פורמלין והטמעת פרפין של רקמות18.
  14. לאחר קיבוע והטמעה בפרפין, חתך למקטעים של 5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום19. המשך עם הליכי צביעה סטנדרטיים של המטוקסילין ואאוזין (H&E) או אימונוסטינינג, כמפורט להלן.

6. המטוקסילין וכתמי אאוסין

  1. Deparaffinize את הסעיפים כדלקמן: קסילן, 2 x 10 דקות; 100% אתנול, 2 x 3 דקות; 80% אתנול, 3 דקות; 60% אתנול, 3 דקות; dH 2 O,2x 3 דקות; 1 דקות בהמטוקסילין; מי ברז (3 x 5 שניות); דקה אחת באוסין.
  2. לייבש את החלקים כדלקמן: 60% אתנול, 3 דקות; 80% אתנול, 3 דקות; 95% אתנול, 3 דקות; 100% אתנול, 2 x 3 דקות; קסילן, 2 x 15 דקות
  3. הרכב באמצעות מדיום הרכבה.

7. מכתים אימונופלואורסצנטיים

  1. לפרק את הסעיפים כמתואר בשלב 6.1.
  2. ביצוע שליפת אנטיגן
    1. טבלו את השקופיות בתמיסת אחזור אנטיגן במיכל בטוח לשימוש במיקרוגל.
    2. יש לחמם במיקרוגל בחום גבוה למשך 20 דקות, תוך שימוש במרווחים של 5 דקות כדי להבטיח שהתמיסה לא תרתח.
  3. לאחר השלמת שלב אחזור האנטיגן בן 20 הדקות, אפשרו למגלשות להתקרר על הקרח למשך 40 דקות ועדיין שקועות במאגר שליפת אנטיגן.
  4. שטפו את השקופיות עם 1x TBST למשך 3 דקות
  5. חסום את השקופיות על ידי דגירה ב-3% BSA ב-TBST למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  6. דגירה ראשונית של נוגדנים
    1. לדלל את הנוגדן ב-3% BSA ב-TBST (1:50-1:1,000, תלוי ב-Ab).
    2. לדגור לילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר לחות.
    3. לשטוף 3 x 5 דקות עם TBST.
  7. דגירה משנית של נוגדנים
    1. יש לדלל את הנוגדן ב-3% BSA (ב-TBST) (1:250), או ב-5% סרום חמור רגיל.
    2. דגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT) בחושך, שכן הנוגדן מצומד לפלואורופור.
  8. צביעה גרעינית
    1. דילול 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) 1:1,000 ב-TBST.
    2. דגירה במשך 5 דקות ב- RT.
    3. לשטוף 2 x 5 דקות עם TBST.
  9. הרכבה
    1. השתמש בטיפה אחת של מדיום הרכבה כדי להרכיב את הכיסוי.
    2. יש לאטום את הכיסוי באמצעות לק למחרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תמונות ניגודיות פאזה של אורגנואידים רירית הרחם של עכבר
יצרנו אורגנואידים מאפיתל רירית הרחם של עכבר WT, כפי שמתואר בפרוטוקול המצורף (ראו תרשים באיור 1). בעקבות דיסוציאציה אנזימטית של אפיתל רירית הרחם של העכבר, יריעות האפיתל הופרדו מכנית מהתאים הסטרומליים של הרחם ונותקו עוד יותר עם קולגן כדי ליצור תרחיף חד-תאי. אם היא מבוצעת נכון, שיטה זו של הפרדת תאים אפיתל וסטרומלי אמורה להניב דגימות עם זיהום של לא יותר מ-10%-15% מסוג התא ההפוך (ראו תמונות אימונופלואורסצנציה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במאמר זה נתאר שיטות ליצירת אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם מרירית הרחם של עכברים ואת הפרוטוקולים המשמשים באופן שגרתי לניתוח שלהם במורד הזרם. אורגנואידים רירית הרחם הם כלי רב עוצמה לחקר המנגנונים השולטים במחלות הקשורות לרירית הרחם, כגון אנדומטריוזיס, סרטן רירית הרחם וכשל בהשתלה. מחקרים פורצי דרך שפורסמו בשנת 2017 דיווחו על התנאים לתרבית תרביות ארוכות טווח ומתחדשות של אורגנואידים רירית הרחם מאפיתל עכברים ואנושיים 4,5. למרות שאורגנואידים היו בשימוש נרחב לחקר מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

אנו מודים לד"ר סטפני פנגס ולד"ר מרטין מ. מצוק (M.M.M.) על הקריאה הביקורתית והעריכה של כתב היד שלנו. המחקרים נתמכו על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם ע"ש יוניס קנדי שרייבר R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) ו-R01-HD110038 (M.M.M.), ועל ידי מענק התמיכה של מרכז הסרטן NCI- P30 (NCI-CA125123). דיאנה מונסיוויס, Ph.D. מחזיקה בפרס הריון מהדור הבא מקרן בורוז וולקום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ניסוח מדיה אורגנואידית
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>ריכוז סופי
קורנינג גורם גדילה מופחת (GFR) מטריג'ל מטריג'ל מטריצת ממברנת בסיס, *קורנינג ללא LDEV354230100%
טריפסין מלבלב בקרסיגמא אולדריץ'T1426-1G1%
מתקדם DMEM/F12Life Technologies12634010תוסף 1X
N2 LifeTechnologies175020481X
B-27 ומסחר; תוסף תזונה (50X), מינוס ויטמין ALife Technologies125870101X
פרימוציןInvivogenant-pm-1100 ומיקרו; גרם/מ"ל
N-אצטיל-L-ציסטאיןסיגמא אולדריץ'A9165-5G1.25 מ"מ
L-גלוטמיןLife Technologies250300242 מ"מ
ניקוטינאמידסיגמא אולדריץ'N0636-100G10 ננומטר
ALK-4, -5, מעכב -7, A83-01Tocris2939500 ננומטר
רקומביננטי אנושי EGFPeprotechAF-100-1550 ננוגרם/מ"ל
רקומביננטי אנושי NogginPeprotech120-10C100 ng/mL
רקומביננטי אנושי Rspondin-1Peprotech120-38500 ng/mL
רקומביננטי אנושי FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
רקומביננטי אנושי HGFPeprotech100-3950 ng/mL
WNT3aR& D systems5036-WN200 ננוגרם/מ"ל
<חזק>אספקה וריאגנטים אחרים
<חזק>שם<חזק>חברה><חזק>מספר קטלוגי<חזק>ריכוז סופי
קולגנאז מ-Clostridium histolyticumSigma AldrichC0130-1G5 מ"ג/ מ"ל
דאוקסיריבונוקלאז I מלבלב בקרסיגמא אולדריץ'DN25-100 מ"ג2 מ"ג/מ"ל
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםThermoFisher14190-2501X
HBSS, ללא סידן, ללא מגנזיוםThermoFisher141701121X
Falcon  מיקרופלטות פוליסטירן (24-Well)פישר סיינטיפיק#08-772-51
פלקון  מיקרופלטות פוליסטירן (12 בארות)Fisher Scientific#0877229
מסנני תאי פלקון, 40 ומיקרו; mפישר סיינטיפיק#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 ומיקרו; ז)Genesee Scientific11-331
טריזול ריאגנטInvitrogen15596026
DMEM/F-12, HEPES, ללא פנול אדוםThermoFisher11039021
סרום בקר עוברי, סיגמאאולדריץ'F6765-500 מ"ל2%
אסטראטיול (E2)סיגמא אולדריץ'E1024-1G10 ננומטר
פורמלדהיד 16% במימי פתרון, EM כיתהVWR157104%
קלטת Epredia 1 קלטות רקמות מחוררותFisher Scientific1000961
Epredia תבניות בסיס הטמעת נירוסטהFisher Scientific64-010-15 
אתנול, 200 הוכחה (100%)פישר סיינטיפיק22-032-601 
HistoclearFisher Scientific50-899-90147
Permount הרכבה בינוניתפישר סיינטיפיק50-277-97
שקיות ביופסיה ניילון Epredia FisherScientific6774010
ג'ל לעיבוד דגימת HistoGelVWR83009-992
תמיסת המטוקסילין פרימיוםVWR95057-844
תמיסת Eosin Y (צהבהבה) PremiumVWR95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4GenDEPORTT80541X
TBST (10X), pH 7.4GenDEPORTT80561X
חומצת לימון סיגמא אולדריץ'C0759-1KG
נתרן ציטראט טריבייס דיהידראטסיגמא אולדריץ'S4641-500G
Tween20פישר סיינטיפיקBP337-500 
סרום בקר אלבומין (BSA)Sigma AldrichA2153-100G3%
DAPI Solution (1 מ"ג/מ"ל)ThermoFisher622481:1000 דילול
VECTASHIELD Antifade הרכבה בינוניוקטור מעבדותH-1000-10
לק שקוףפישר מדעיNC1849418
פישרברנד סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופ שקופיותפישר Scientific22037246
משקפי מיקרו כיסויVWRVWR 48393-106
SuperScript VILO Master MixThermoFisher11755050
SYBR Green PCR Master MixThermoFisher4364346
Krt8 נוגדן (TROMA-I) DSHBTROMA-I דילול 1:50
Vimentin AntobodyCell Signaling5741S1:200 דילול
חמור נגד חולדה IgG (H+L) נוגדן משני
נספג מאוד, Alexa Fluor 594		ThermoFisherA-212091:250 דילול
חמור אנטי Rabbin IgG (H+L) נוגדן משני
נספג מאוד, Alexa Fluor 488		ThermoFisherA-21206דילול 1:250
ZEISS Stemi 508 סטריאו מיקרוסקופZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 מיקרוסקופ שגרתי הפוך עם מצלמה דיגיטליתZEISS
strong>Primer Sequence>Forward (5'-3')הפוך (5'-3')_
Lipocalin 2 (Lcn2)GCAGGTGGGTGTTGTGGGCTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
לקטופרין (Ltf)TGAGGCCCTTGGACTCTGTGTACCCACTTTCTCTCTCTCGTTC
פרוגסטרון (Pgr)CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTCTAACTTCAGACATTTCCGG
גליצרלדהיד 3 פוספט דהידרוגנאז (Gapdh)CAATGTGTCCGTCGTCGTGGATCTGCCTGCTTCACCACCCTCTT
<

מקורות

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84(2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384(2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603(2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623(2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378(2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760(2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making - A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12(2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088(2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102(2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863(2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid". Biology. 11 (7), 987(2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138(2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Developmental Biology. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042(2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610(2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125(2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הקמת אורגנואידים 3D רירית הרחם מרחם העכבר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.