כאן אנו מציגים פרוטוקול לטיפוח תאי IDG-SW3 במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית (תלת-ממדית).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תרבית תאים IDG-SW3 במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אוסטיאוציטים נחשבים לתאים לא מתרבים המתמיינים באופן סופני מאוסטאובלסטים. אוסטאובלסטים המשובצים במטריצה החוץ תאית של העצם (אוסטיאואיד) מבטאים את הגן Pdpn ליצירת דנדריטים תאיים והופכים לפראוסטיאוציטים. מאוחר יותר, פראוסטיאוציטים מבטאים את הגן Dmp1 כדי לקדם מינרליזציה של מטריצה ובכך להפוך לאוסטיאוציטים בוגרים. תהליך זה נקרא אוסטיאוציטוגנזה. IDG-SW3 הוא קו תאים ידוע למחקרי מבחנה של אוסטיאוציטוגנזה. שיטות קודמות רבות השתמשו בקולגן I כמרכיב העיקרי או היחיד של מטריצת התרבית. עם זאת, בנוסף לקולגן I, האוסטאואיד מכיל גם חומר טחון, שהוא מרכיב חשוב בקידום גדילה, היצמדות ונדידה של תאים. בנוסף, חומר המטריצה שקוף, מה שמגביר את השקיפות של הג'ל שנוצר על ידי קולגן, ובכך מסייע לחקר היווצרות הדנדריטים באמצעות טכניקות הדמיה. לפיכך, מאמר זה מפרט פרוטוקול ליצירת ג'ל תלת-ממדי באמצעות מטריצה חוץ-תאית יחד עם קולגן I להישרדות IDG-SW3. בעבודה זו, היווצרות דנדריטים וביטוי גנים נותחו במהלך אוסטאוציטוגנזה. לאחר 7 ימים של תרבית אוסטאוגנית, נצפתה בבירור רשת דנדריטים נרחבת תחת מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי. PCR בזמן אמת הראה כי רמות mRNA של Pdpn ו - Dmp1 עלו ללא הרף במשך 3 שבועות. בשבוע 4, המיקרוסקופ הסטריאוסקופ גילה ג'ל אטום מלא בחלקיקים מינרליים, התואם את בדיקת קרני רנטגן פלואורסצנטיות (XRF). תוצאות אלה מצביעות על כך שמטריצת תרבית זו מקלה בהצלחה על המעבר מאוסטאובלסטים לאוסטיאוציטים בוגרים.
מבוא
אוסטיאוציטים הם תאים ממוינים סופניים שמקורם באוסטאובלסטים 1,2. ברגע שהאוסטאובלסט נקבר על ידי האוסטאואיד, הוא עובר אוסטיאוציטוגנזה ומבטא את הגן Pdpn ליצירת פרה-אוסטיאוציטים, את הגן Dmp1כדי להפוך את האוסטיאואיד למינרליזציה, ואת הגנים Sost ו-Fgf23 לתפקד כאוסטיאוציטים בוגרים ברקמת עצם3. כאן, מערכת תרבית תלת ממדית מוצגת כדי לזהות הרחבת דנדריט וביטוי גנים סמן בתהליך אוסטיאוציטוגנזה.
תאי IDG-SW3 הם קו תאים ראשוני אימורטלי שמקורו בעכברים טרנסגניים ויכולים להרחיב או לשכפל אוסטאובלסטים להתמיינות אוסטיאוציטים מאוחרת כאשר הם....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה מתאים לגידול תאים בארבע בארות של לוחות 24 בארות. אם מכינים מספר דגימות או צלחות, יש להגדיל את כמויות הריאגנטים בהתאם.
1. הכנת תערובת קולגן I
הערה: קולגן I וג'ל מטריצת קרום מרתף במהירות בטמפרטורת החדר. לכן, קולגן צריך להיות מטופל על קרח (2 ° C עד 8 ° C). כל הטיפים והצינורות המשמשים חייבים להיות מקוררים אלא אם כן צוין אחרת. כל ההליכים צריכים להתבצע במכסה מנוע.
- מניחים את כל הריאגנטים וצינורות הצנטריפוגות על קרח.
- פיפטה איטית 0.48 מ"ל של קולגן I (5 מ"ג/מ"ל) ו-0.1 מ"ל של 10x מדיום חיוני מינימלי (MEM) (עם פנול אדום) לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל השמור על קרח. מערב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לאחר צביעת תאים חיים/מתים, התאים הודגמו באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. כל התאים היו קלצין AM-חיובי (צבע ירוק), וכמעט ולא היו תאים חיוביים ל-EthD-1 (צבע אדום) בשדה, מה שמצביע על כך שמערכת הג'ל המיוצרת בשיטה זו מתאימה מאוד לאוסטאוציטוגנזה (איור 1A, משמאל). כדי לקבוע טוב יותר את ההתפלגות המרחבית של התאים, נבחרה תמונה פסאודו-צבעונית שתציג את הדנדריטים של התא בעומקים שונים של הג'ל; אדום מראה את הדנדריטים בתחתית הג'ל, וכחול מראה את הדנדריטים בחלק העליון. התוצאות הצביעו על כך שתאי IDG-SW3 גדלו ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
נקודה קריטית בפרוטוקול זה היא שיש לבצע את שלבים 1 ו-2 על קרח כדי למנוע קרישה ספונטנית. בשיטה זו, הריכוז הסופי של קולגן I היה 1.2 מ"ג/מ"ל. לפיכך, יש לחשב נפח אופטימלי של ddH2O כך שיתאים לקולגן השונים של יצרנים שונים.
In vivo, אוסטאוציטוגנזה כוללת תנועה קוטבית של אוסטאובלסטים מפני השטח אל פנים העצם הטרבקולרית14. פרוטוקול זה משחרר תאים מצמיחה במטריצה ללא קוטביות כיוונית. כמובן, זריעת תאי IDG-SW3 על משטח מטריצת הג'ל ללא תאים היא אופציונלית. עם זאת, ריכוז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים לד"ר לינדה פ. בונוולד על הענקת קו התאים IDG-SW3 במתנה. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82070902, 82100935 ו-81700778) ופרויקט השייט "חדשנות מדעית וטכנולוגית" בשנגחאי (21YF1442000).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.25% חומצה טריפסין-אתילנדיאמין-טראצטית | Hyclone | SH30042.01 | |
| צינורות 15 מ"ל | קורנינג, ניו יורק, ארה"ב | 430791 | |
| 7.5% (w/v) נתרן ביקרבונט | סיגמא-אולדריץ', מיזורי, ארה"ב | S8761 | |
| חומצה אסקורבית | סיגמא-אולדריץ', מיזורי, ארה"ב | A4544 | |
| קולגן I | תרמו פישר סיינטיפיק | A10483-01 | |
| סרום בקר עוברי | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| הומוגנייזר | BiHeng ביוטכנולוגיה, שנחאי, סין | לייזר SKSI | |
| Carl Zeiss, Oberkochen, גרמניה | LSM 800 | ||
| ערכת הדמיה של תאים חיים/מתים | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| מטריצת מטריג'ל | קורנינג, ניו יורק, ארה"ב | 356234 | |
| MEM (10X), ללא גלוטמין | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, ארה"ב | 158127 | |
| מלח חוצץ פוספט | היקלון | SH30256. | |
| Carl Zeiss, Oberkochen, גרמניה | Zeiss Axio ZOOM. V16 | ||
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| פלואורסצנטי רנטגן | EDAX, USA | EAGLE III & | |
| ;-GLYCEROPHOSPHATE | Sigma-Aldrich, MO, ארה"ב | G9422 |
מקורות
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The osteocyte: An endocrine cell ... and more. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- Bonewald, L. F.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
