מאמר שיטה

שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae

DOI:

10.3791/64580

⸱

11 באוקטובר 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University, 2Stowers Institute for Biomedical Research

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה בהילוך מהיר היא כלי רב ערך לחקר מיוזה בשמרים ניצנים. פרוטוקול זה מתאר שיטה המשלבת סנכרון מחזור התא, מיקרוסקופיה בהילוך מהיר ודלדול מותנה של חלבון מטרה כדי להדגים כיצד לחקור את תפקודו של חלבון מסוים במהלך הפרדת כרומוזומים מיוטיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר חוללה מהפכה בהבנת אירועי מחזור תאים מיוטיים על ידי מתן נתונים טמפורליים ומרחביים שלעתים קרובות אינם נראים על ידי הדמיה של תאים קבועים. שמרים ניצנים הוכיחו את עצמם כאורגניזם מודל חשוב לחקר הפרדת כרומוזומים מיוטיים מאחר שגנים מיוטיים רבים נשמרים מאוד. מיקרוסקופיה בהילוך מהיר של מיוזה בשמרים ניצנים מאפשרת ניטור של מוטציות מיוטיות שונות כדי להראות כיצד המוטציה משבשת תהליכים מיוטיים. עם זאת, חלבונים רבים מתפקדים בנקודות מרובות במיוזיס. השימוש במוטנטים ריקים של אובדן תפקוד או מיוטי יכול אפוא לשבש תהליך מוקדם, לחסום או להפריע לתהליך המאוחר יותר ולהקשות על קביעת הפנוטיפים הקשורים לכל תפקיד בנפרד. כדי לעקוף את האתגר הזה, פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן לרוקן את החלבונים מהגרעין בשלבים ספציפיים של מיוזה תוך ניטור אירועים מיוטיים באמצעות מיקרוסקופיה בהילוך מהיר. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר כיצד התאים מסונכרנים ב-prophase I, כיצד טכניקת ה-anchor away משמשת לדלדול חלבונים מהגרעין בשלבים מיוטיים ספציפיים, וכיצד נעשה שימוש בהדמיה בהילוך מהיר כדי לעקוב אחר הפרדת כרומוזומים מיוטיים. כדוגמה לתועלת הטכניקה, חלבון הקינטוצ'ור Ctf19 התרוקן מהגרעין בנקודות זמן שונות במהלך המיוזיס, ומספר מסות הכרומטין נותח בסוף המיוזה השנייה. באופן כללי, ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי לרוקן חלבונים גרעיניים שונים מהגרעין תוך ניטור החטיבות המיוטיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר היא כלי רב ערך לחקר הדינמיקה של הפרדת כרומוזומים מיוטיים בשמרים ניצנים 1,2. ניתן לגרום לתאי שמרים ניצנים לעבור מיוזה באמצעות הרעבה של חומרים מזינים חיוניים3. במהלך מיוזה, תאים עוברים סבב אחד של הפרדת כרומוזומים ולאחר מכן שתי חטיבות כדי ליצור ארבעה תוצרים מיוטיים הארוזים בנבגים (איור 1). ניתן לדמיין תאים בודדים לאורך כל שלב של מיוזה, אשר מייצר נתונים מרחביים וזמניים שניתן לפספס בקלות על ידי הדמיה של תאים קבועים. פרוטוקול זה מראה כיצד ניתן להשתמש בשילוב של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר עם שתי שיטות שנקבעו בעבר, מערכת NDT80 (NDT80-in) וטכניקת ה-anchor away, כדי לחקור את תפקודם של חלבונים ספציפיים בשלבים מיוטיים שונים.

מערכת NDT80-in היא כלי רב עוצמה לסנכרון מחזור תא מיוטי המסתמך על הביטוי הבלתי ניתן להשראה של גורם שעתוק המיוזה האמצעי NDT80 4,5. ביטוי NDT80 נדרש עבור prophase I יציאה 6,7. עם מערכת NDT80-in, NDT80 נמצא תחת שליטתו של מקדם GAL1-10 בתאים המבטאים את גורם השעתוק Gal4 שהתמזג עם קולטן אסטרוגן (Gal4-ER)4,5. מאחר ש-Gal4-ER נכנס לגרעין רק כאשר הוא קשור ל-β-אסטרדיול, תאי NDT80-in נעצרים בפרופאזה I בהיעדר β-אסטרדיול, מה שמאפשר סנכרון של תאים בפרופאזה I (איור 1). תוספת β-אסטרדיול מקדמת את הטרנסלוקציה של גורם השעתוק Gal4-ER לתוך הגרעין, שם הוא קושר את GAL1-10 כדי להניע ביטוי של NDT80, מה שמוביל לכניסה סינכרונית לחטיבות המיוטיות. למרות שניתן לבצע מיקרוסקופיה בהילוך מהיר ללא סנכרון, היתרון בשימוש בסנכרון הוא היכולת להוסיף מעכב או תרופה בזמן שהתאים נמצאים בשלב מסוים של מיוזה.

טכניקת ה-anchor away היא מערכת אינדוקטיבית, שבאמצעותה ניתן לרוקן חלבון מהגרעין בתוספת של רפמיצין8. טכניקה זו אידיאלית לחקר חלבונים גרעיניים במהלך חלוקת התא בשמרים ניצנים מכיוון שתאי שמרים עוברים מיטוזה סגורה ומיוזה, שבה מעטפת הגרעין אינה מתפרקת. יתר על כן, טכניקה זו שימושית מאוד עבור חלבונים שיש להם פונקציות מרובות לאורך מיוזה. שלא כמו במחיקות, אללים מוטנטיים או אללים ריקים מיוטיים, הסרת חלבון מטרה מהגרעין בשלב מסוים אינה פוגעת בפעילות חלבון המטרה בשלבים מוקדמים יותר, ומאפשרת פרשנות מדויקת יותר של התוצאות. מערכת ה-anchor away משתמשת בסגירה של תת-יחידות ריבוזומליות בין הגרעין לציטופלסמה המתרחשת עם ההבשלה הריבוזומלית8. כדי לרוקן את חלבון המטרה מהגרעין, חלבון המטרה מתויג עם תחום הקישור FKBP12-rapamycin (FRB) בזן שבו תת-היחידה הריבוזומלית Rpl13A מתויגת עם FKBP12. ללא רפמיצין, FRB ו- FKBP12 אינם מתקשרים, והחלבון המתויג FRB נשאר בגרעין. עם הוספת רפמיצין, הרפאמיצין יוצר קומפלקס יציב עם FKBP12 ו-FRB, והקומפלקס מועבר אל מחוץ לגרעין עקב האינטראקציה עם Rpl13A (איור 1). כדי למנוע מוות של תאים עם תוספת רפמיצין, התאים מכילים את המוטציה tor1-1 של הגן TOR1 . בנוסף, תאים אלה מכילים fpr1Δ , אלל ריק של החלבון S. cerevisiae FKBP12, אשר מונע Fpr1 אנדוגני מ Rpl13A-FKBP12 מתחרה עבור FRB ו rapamycin קשירת. העוגן הרחק מוטציות רקע, tor1-1 ו- fpr1Δ, אינן משפיעות על תזמונים מיוטיים או על הפרדת כרומוזומים2.

כדי להדגים את התועלת של טכניקה זו, חלבון הקינטוצ'ור Ctf19 התרוקן בנקודות זמן שונות במהלך המיוזיס. Ctf19 הוא מרכיב של קינטוצ'ור הניתן לחלוקה במיטוזה אך נדרש להפרדה תקינה של כרומוזומים במיוזה 9,10,11,12,13. במיוזיס, הקינטוצ'ור נשפך בפרופאזה I, ו- Ctf19 חשוב להרכבה מחדש של קינטוצ'ור 9,14. עבור פרוטוקול זה, תאים עם מערכת NDT80-in היו מסונכרנים, וטכניקת ה-anchor away שימשה כדי לרוקן את חלבון המטרה Ctf19 מהגרעין לפני ואחרי השחרור מ-prophase I, ואחרי הפרדת כרומוזומים של meiosis I (איור 1). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לרוקן חלבונים אחרים בעלי עניין בכל שלב של מיוזה ומיטוזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת החומרים הדרושים

  1. הכן ריאגנטים לצמיחה ו sporulation של תאי שמרים.
    הערה: אם זני שמרים ניצנים הם ade2 - ו- trp1-, יש להשלים את כל המדיה בשלבים 1.1.1-1.1.3 עם ריכוז סופי של 0.01% אדנין ו-0.01% טריפטופן ממניות 1%. אם אתם מעקרים את המדיה על ידי אוטוקלב, הוסיפו את חומצות האמינו הללו רק לאחר שהריאגנטים עברו אוטוקלאב והותרו להתקרר לטמפרטורת החדר.
    1. לצמיחה וגטטיבית, יש להכין 2x חומר סינתטי שלם + דקסטרוז בינוני (2XSC) על ידי המסת 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 2 גרם של תערובת חומצות אמינו מלאה, ו 20 גרם של דקסטרוז ב 500 מ"ל של מים. לעקר את התערובת על ידי autoclaving במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס או סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר.
    2. לשלב הראשון של הספורולציה, יש להכין 2x מדיום סינתטי שלם + אצטט (2XSCA) על ידי המסת 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 2 גרם של תערובת חומצות אמינו מלאה, ו-20 גרם של אשלגן אצטט ב-500 מ"ל מים. לעקר את התערובת על ידי autoclaving במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס או סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר.
    3. לשלב האחרון של הספורולציה, יש להכין 1% אשלגן אצטט (1% KAc) על ידי המסת 5 גרם של KAc ב-500 מ"ל מים. לעקר את התערובת על ידי autoclaving במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס או סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר.
  2. הכינו תרופות וריאגנטים למיקרוסקופיה, סנכרון ועיגון משם.
    1. להדבקת תאים לכיסוי במהלך הדמיית קיטועי זמן, יש לייצר 1 מ"ג/מ"ל של קונקנאבלין A (ConA) ב-PBS אחד. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן של 0.2 מיקרומטר ולאחסן אליקוטים קטנים (~10 μL) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    2. כדי להשתמש במערכת NDT80-in, הפוך 2 מ"ל של 1 mM β-אסטרדיול מומס באתנול. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן של 0.2 מיקרומטר ולאחסן אליקוטים (~500 μL) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    3. עבור מערכת העוגן, יש להכין 1 מ"ג/מ"ל של רפמיצין מומס ב-DMSO. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן של 0.2 מיקרומטר ולאחסן אליקוטים קטנים (~10 μL) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: הכינו אליקוטים קטנים של רפמיצין כדי למנוע מחזורי הפשרה מרובים של התרופה.
  3. ליצור זני שמרים המכילים את מערכת NDT80-in (P GAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER/ GAL4-ER) וחלבון מטרה המתויג עם FRB ברקע הגנטי העוגן (tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)4,8. Ctf19-FRB שימש למחקר זה. בנוסף, עותק אחד של חלבון היסטון Htb2 תויג עם mCherry כדי לאפשר ניטור של התקדמות מיוטית והפרדת כרומטין.
  4. הכנת תא להדמיה בהילוך מהיר
    1. התחילו להכין את החדר 6 שעות עד 24 שעות לפני ההדמיה (איור 2). חתכו תא בגודל 18 מ"מ x 18 מ"מ מתיבת קצה הפיפטה באמצעות אזמל מחומם או להב חד אחר.
    2. השתמשו בקצה פיפטה מפלסטיק כדי לפזר שכבה דקה של חומר איטום מסיליקון סביב הקצוות התחתונים של התא שתידבק לכיסוי. הוסיפו מספיק חומר איטום כדי ששולי התא יהיו מכוסים לחלוטין (ראו איור 2).
    3. הדביקו את התא לכיסוי של 24 מ"מ על 50 מ"מ על-ידי הנחתו בעדינות של התא, חומר האיטום כלפי מטה, על הכיסוי. יש לוודא שאין פערים בחומר האיטום כדי שהתא לא ידלוף.
    4. יש למרוח 8-10 μL של ConA על הכיסוי. יש לטפטף את ה-ConA על מרכז הכיסוי ולהשתמש בקצה פיפטה כדי לפזר את ה-ConA לשכבה דקה כך שהיא מכסה את רוב הכיסוי המוקף בתא.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בתאי פלסטיק ללא הגבלת זמן. לאחר השלמת ההדמיה בהילוך מהיר, הסר את התא מכיסוי הכיסוי באמצעות סכין גילוח, נקה את חומר האיטום מסיליקון מהתא ושמור על התאים שקועים ב-95% אתנול לשימוש עתידי.

2. נקבוביות של תאי שמרים

  1. בצע את השלבים הבאים להרעבת תאי שמרים כדי לגרום לתוכנית המיוטית.
    הערה: שלבים אלה מיועדים לספורולציה של זן השמרים W303. זנים אחרים עשויים לדרוש פרוטוקולים שונים15. יעילות הספורולציה משתנה מאוד בין זני המעבדה, כאשר W303 מציג יעילות ספורולציה של ~60%16,17,18.
    1. לוקחים מושבה אחת של זן השמרים הדיפלואידי המתאים מצלחת ומחסנים 2 מ"ל של 2XSC ומניחים לגדול בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס על תוף רולר למשך 12-24 שעות עד לרוויה.
    2. דילול התרבית הרוויה ל-2XSCA על-ידי הוספת 80 μL של התרבית משלב 2.1.1 ל-2 מ"ל של 2XSCA. תן לו לגדול ב 30 מעלות צלזיוס על תוף רולר במשך 12-16 שעות. אין להשאיר ב-2XSCA יותר מ-16 שעות מכיוון שהתאים עלולים לחלות או להיות פלואורסצנטיים אוטומטית.
    3. בצעו שתי שטיפות על ידי סיבוב התרבית בטמפרטורה של 800 x גרם בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) למשך דקה אחת, השלכת הנוזל והחייאת הכדור ב-2 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים.
    4. לאחר הכביסה השנייה, להסיר את הנוזל ולתלות מחדש את הכדור ב 2 מ"ל של 1% KAc ולתת לו לגדול ב 25 מעלות צלזיוס על תוף רולר במשך 8-12 שעות. תאים שנכנסו למיוזה יעצרו בפכיטן של פרופאזה I.
  2. מערכת שחרור Prophase I
    1. הוסיפו β-אסטרדיול ישירות לתרבית הספורולציה לריכוז סופי של 1 מיקרומטר ומערבבים את צינור התרבית במהירות. האסטרדיול β ישחרר תאים מפרופזה I.

3. דלדול חלבון המטרה מהגרעין באמצעות טכניקת ה-anchor away

  1. הוסיפו רפמיצין לתאים כדי לרוקן את החלבון המתויג FRB מהגרעין בשלב מסוים.
    1. כדי לרוקן חלבונים מהגרעין ביציאה מפרופאזה I, הוסיפו רפמיצין לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל לצינור תרבית הספורולציה במקביל לתוספת β-אסטרדיול.
    2. כדי לרוקן חלבונים מהגרעין בשלב מסוים של מיוזה, עקוב אחר שלב מחזור התא החל מ-60 דקות לאחר תוספת β-אסטרדיול. כל 20 דקות, פיפטה 5 μL של תרבית על מכסה 24 מ"מ x 40 מ"מ לכסות את התאים עם כיסוי 18 מ"מ x 18 מ"מ. שמור על תרבויות מסתובבות על תוף הרולר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בין נקודות זמן.
    3. דמיינו את התאים באמצעות מסנן A594/mCherry והמטרה פי 60 של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הגדר את אחוז השידור ל-2% ואת זמן החשיפה ל-250 אלפיות השנייה. נוכחות של מסות דנ"א אחת, שתיים או ארבע תציין את השלב המיוט שבו התאים התקדמו. הוסיפו רפמיצין לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל בשלב המיוטי של העניין.
  2. שמור על התאים מסתובבים על תוף הגליל בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים להדמיה. דלדול גרעיני של חלבון מטרה מתרחש 30-45 דקות לאחר תוספת רפמיצין 2,8.

4. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר

  1. הכינו כרית אגר שתשמש ליצירת מונולאייר של תאים להדמיה (ראו שלב 4.2).
    1. חתכו והשליכו את המכסה ואת ה-1/3 התחתון של צינור מיקרופוגה בגודל 1.5 מ"ל כדי ליצור צילינדר. הצילינדר ישמש כתבנית לכרית האגר. הכינו שני צילינדרים כדי לקבל תוספת למקרה שהאגר לא יתפנמר כראוי בראשון.
    2. הניחו את גליל צינור המיקרופוגה החתוך על מגלשת זכוכית נקייה כאשר החלק העליון של הצינור הפוך יושב על המגלשה.
    3. הכינו 6 מ"ל מתמיסת אגר 5% (השתמשו ב-1% KAc כממס) בכוס של 50 מ"ל והכניסו אותה למיקרוגל עד שהאגר מומס במלואו.
      הערה: האגר ירתח בקלות במיקרוגל; צפו באגר והתחילו והפסיקו את המיקרוגל כאשר האגר מתחיל להרתיח ולסובב את הכוס. התחילו והפסיקו את השימוש במיקרוגל מספר פעמים כדי להמיס את האגר במלואו. תמיסת האגר מיוצרת מעבר לכמות הדרושה כדי להבטיח שהאגר יתמוסס במלואו.
    4. חותכים את קצה הפיפט כדי ליצור פתח גדול יותר ופיפט ~ 500 μL של אגר מומס לתוך כל גליל צינור microfuge. תנו לו לשבת בטמפרטורת החדר עד שהאגר יתמצק (~10-12 דקות).
  2. הכנת תאי שמרים להדמיה
    1. סובב למטה 200 μL של תרבית sporulation משלב 3.2 ב 800 x g במשך 2 דקות ב 1 מ"ל צינורות microcentrifuge. הסר והשלך 180 μL של supernatant. החזירו את הכדור לנוזל הנותר על ידי מערבולת והבהוב הצינור.
    2. Pipet 6 μL של התאים המרוכזים על הכיסוי במרכז התא עשוי בשלב 1.4.
    3. החזיקו את הצילינדר עם משטח האגר המיוצר בשלב 4.1 והחליקו אותו בזהירות ממגלשת הזכוכית. וודאו שהאגר שטוח לחלוטין בתחתית ובעזרת החלק התחתון של קצה הפיפטה, הפעילו לחץ קל על תבנית המיקרופוגה כך שמשטח האגר נדחף מעט מעל גבול הצינור.
    4. הפוך את התבנית כך שמשטח האגר פונה כלפי מטה לכיוון התא.
    5. בעזרת מלקחיים, מניחים בעדינות את כרית האגר (עדיין בתבנית צינור המיקרופוגה) על גבי התאים. השתמש בקצה פיפטה כדי להחליק בעדינות את כרית האגר סביב התא 10-20 פעמים כדי ליצור מונו-שכבה של תאים על הכיסוי.
    6. השאירו את כרית האגר בתא למשך 12-15 דקות. שלב זה יאפשר לתאים להיצמד ל- ConA על הכיסוי.
    7. מעבירים 2 מ"ל של תרבית ספורולציה משלב 3.2 לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה ומסתובבים ב-15,700 x גרם למשך 2 דקות. מעבירים את הסופר-נאטנט לצינורות מיקרופוגה נקיים ומסתובבים שוב ב-15,700 x גרם למשך 2 דקות. העבר את הסופר-נאטנט לצינורות מיקרוצנטריפוגה נקיים לשימוש בשלב הבא.
      הערה: חשוב להשתמש בסופרנטנט KAc מותנה מראש עם β-אסטרדיול ורפמיצין כדי להבטיח ספורולציה יעילה והמשך דלדול של החלבון המעניין.
    8. לאחר שפד האגר ישב בתא במשך 12-15 דקות, צף והסר את כרית האגר לפני ההדמיה. כדי לעשות זאת, הוסיפו 2 מ"ל של הסופר-נטנט משלב 4.2.7 טיפה לתא. לאחר שהנוזל הגיע לחלק העליון של התא, כרית האגר ככל הנראה תצוף.
      הערה: אם משטח האגר אינו צף באופן אוטומטי, המתן 1-2 דקות. אם כרית האגר עדיין לא צפה, הסר אותה בעדינות עם מלקחיים. באופן אידיאלי, כרית האגר תצוף מעצמה מכיוון שהסרתה לפני הציפה עלולה להוביל להסרת התאים.
    9. לאחר שמשטח האגר צף, הסר אותו בעדינות עם מלקחיים והשלך אותו. הניחו כיסוי בגודל 24 מ"מ על 50 מ"מ בחלק העליון של התא כדי למנוע אידוי במהלך ההדמיה.
  3. הגדרת סרט על המיקרוסקופ
    הערה: ההוראות שלהלן מיועדות למיקרוסקופ הפוך המצויד במחזיק שקופיות המתאים לכיסוי בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ (ראה טבלת חומרים לפרטי מיקרוסקופ, מצלמה ותוכנה). מטרת טבילת שמן פי 60 משמשת לרכישת תמונה. ייתכן שיהיה צורך לשנות פרוטוקול זה בעת שימוש במיקרוסקופים אחרים או במחזיקי שקופיות אחרים. השלבים המדויקים לביצוע שלב 4.3.2 עד שלב 4.3.16 ישתנו בהתאם למיקרוסקופ ולתוכנת ההדמיה שבה נעשה שימוש. ראה סעיף 4.4 לקבלת הוראות למיקרוסקופ אחר.
    1. הכנס את הכיסוי לתוך מחזיק ההחלקה. הדביקו את חימר היציקה לצד הכיסוי כדי לשמור עליו מאובטח במחזיק ההחלקה.
    2. פתח את התוכנה לרכישת תמונות. השתמש בידיות מסלול וכוונון עדין כדי למקד את התאים באמצעות DIC או שדה בהיר.
    3. בתפריט הראשי של תוכנת רכישת התמונות, לחץ על קובץ > לרכוש (לפתור 3D). שלושה חלונות יצוצו.
    4. בחלון בשם פתור 3D, לחץ על סמל Erlenmeyer Flask . פעולה זו תפתח חלון בשם Design/Run Experiment, המכיל את הפקדים להגדרת ניסוי להגדרת סרט עם קיטועי זמן.
    5. תחת הכרטיסיה עיצוב , נווט אל הכרטיסיה שכותרתה מקטע. בחר את התיבה לצד מקטע Z. הגדר את ערימות z באופן הבא: מרווח מקטעים אופטיים = 1 מיקרומטר, מספר מקטעים אופטיים = 5, עובי דגימה = 5.0 מיקרומטר.
    6. תחת הכרטיסייה ערוצים , לחץ על הסמל + כך שאפשרות ערוץ אחד מופיעה. בחר את הערוץ המתאים. עבור ניסוי זה, אנו בוחרים A594, המשמש להדמיה mCherry. בחר את התיבה שליד הפניה לתמונה והגדר את מיקום Z לאמצע הדגימה מהתפריט הנפתח.
    7. בחר ערך מהתפריט הנפתח הסמוך ל- %T ו- Exp. כדי להגדיר אחוזי שידור וזמן חשיפה, בהתאמה. עבור ניסוי זה, 2% שידור וזמן חשיפה של 250 אלפיות השנייה משמשים בערוץ A594, וזמן חשיפה של 10% וזמן חשיפה של 500 אלפיות השנייה משמשים לשדה בהיר.
      הערה: זמן החשיפה ואחוז השידור ישתנו עם מיקרוסקופים שונים. כדי להימנע מחשיפת יתר, השתמש באחוז השידור הנמוך ביותר ובזמן החשיפה הקצר ביותר האפשרי המאפשר הדמיה נכונה של החלבון המעניין.
    8. תחת הכרטיסיה קיטועי זמן, בחר את התיבה לצד קיטועי זמן. בטבלה שמופיעה, הזן 10 מתחת לעמודה min בשורה קיטועי זמן ו- 10 תחת העמודה שעות בשורת הזמן הכולל. זה יפעיל קורס זמן שלוקח תמונות כל 10 דקות במשך 10 שעות.
    9. בחר את התיבה לצד שמור על מיקוד עם מיקוד אולטימטיבי כדי למנוע סחף שלב במהלך הסרט. תחת הכרטיסיה נקודות, בחר את התיבה לצד רשימת נקודות בקר.
    10. בתפריט הראשי, לחץ על הצג > רשימת נקודות. חלון שנקרא רשימת נקודות יופיע. הזז את הבמה לאזור של החדר המציג מונולאייר של תאים. לחץ על סימון נקודה בחלון רשימת הנקודות.
    11. הזז את השלב כדי לבחור 25-30 נקודות ללא כל חפיפה כדי למנוע חשיפת יתר של התאים. כל שדה יצולם במהלך כל קורס.
    12. בחלון רשימת הנקודות, בחר כייל הכל כדי להגדיר את המיקוד האולטימטיבי עבור כל נקודה. תחת הכרטיסיה עיצוב בחלון Desgin/Run Experiment , הזן את טווח ערכי הנקודות (המתקבלים מחלון רשימת הנקודות) בתיבה שליד בקר ברשימת הנקודות. תחת הכרטיסיה הפעלה , שמור את הקובץ ביעד המתאים במחשב. בחלון עיצוב/הפעלת ניסוי , בחר בלחצן הפעל (סמל משולש ירוק) כדי להפעיל את הסרט.
  4. שיטה אופציונלית: הגדרת סרט על מיקרוסקופ
    הערה: הוראות אלה מיועדות למיקרוסקופ הפוך המצויד במחזיק שקופיות שיכול להכיל כיסוי של 24 מ"מ x 50 מ"מ. ראה טבלת חומרים לקבלת מפרטים אודות המיקרוסקופ, המצלמה ותוכנת ההדמיה שבהם נעשה שימוש. מטרת טבילת שמן פי 60 משמשת לרכישת תמונה.
    1. הכנס את הכיסוי לתוך מחזיק ההחלקה. פתח את התוכנה לרכישת תמונות. השתמש בידיות מסלול וכוונון עדין כדי למקד תאים באמצעות DIC או שדה בהיר. לחץ לחיצה ימנית בחלון הפתוח של התוכנה. יופיע תפריט נפתח.
    2. לחץ על בקרות רכישה > רכישה. לחץ על יישום > להגדיר / להפעיל ניסוי. פעולה זו תפתח חלון שכותרתו רכישת ND.
    3. בחלון שנפתח, סמן את התיבה לצד XY. הזז את הבמה למיקום הרצוי ולחץ על התיבה תחת שם נקודה כדי לבחור מיקום זה כנקודה. חזור על פעולה זו עד לבחירת 25-30 נקודות ללא כל חפיפה כדי למנוע חשיפת יתר של התאים. כל שדה יצולם במהלך כל קורס.
    4. הגדר אחוזי שידור עבור כל ערוץ פלואורסצנטי. מכיוון שהזנים מייצרים Htb2-mCherry, מסנן mCherry משמש כאן. תחת חלון הרכישה שנפתח בשלב 4.3.3, נווט אל לחצן 555 ננומטר. הגדר את אחוז השידור ל- 5% על-ידי התאמת סולם ההזזה מתחת ללחצן 555 ננומטר עד שהוא יקרא 5%.
    5. הגדר את זמן החשיפה עבור כל ערוץ פלואורסצנטי. תחת חלון הרכישה , בחר 200 אלפיות השנייה מהתפריט הנפתח חשיפה.
      הערה: זמן החשיפה ואחוז השידור ישתנו עם מיקרוסקופים שונים. כדי להימנע מחשיפת יתר, השתמש באחוז השידור הנמוך ביותר ובזמן החשיפה הקצר ביותר האפשרי המאפשר הדמיה נכונה של החלבון המעניין.
    6. לחץ על התיבה שליד Z בחלון רכישת ND . הניחו חמש ערימות z של תאי שמרים במרחק של 1.2 מיקרומטר זו מזו.
    7. לחץ על התיבה לצד λ. בחר את הערוצים המתאימים שישמשו לניסוי. עבור DIC, ודא שהאפשרות דף הבית נבחרה מהתפריט הנפתח תחת Z pos. עבור mCherry, ודא שהכל נבחר מהתפריט הנפתח תחת קופה Z. זה מבטיח שרק קטע אחד (באמצע ערימת z) נלקח עבור DIC.
    8. בחר את התיבה לצד זמן בחלון רכישת ND . בחר את התיבה תחת שלב. בתפריט הנפתח תחת מרווח, בחר 10 דקות. תחת משך, בחר 10 שעות (ים). זה ירוץ זמן קורס כך תמונות יצולמו כל 10 דקות במשך 10 שעות.

5. ניתוח הפרדת כרומטין

  1. פתח את תוכנת פיג'י. פתח שדה ראייה אחד בכל פעם: עבור כל שדה, פתח את ערוצי DIC ו- mCherry.
  2. קח את הקרנת העוצמה המרבית של ערוץ mCherry כדי לקבל תמונה בודדת: לחץ על Image > Stacks > Z Project, בחר עוצמה מרבית מהתפריט הנפתח.
  3. מזג את ערוצי DIC ו- mCherry בתמונה אחת: לחץ על תמונה > צבע > מיזוג ערוצים.
  4. עקוב אחר תא בודד באמצעות מיוזה. לאחר השלמת מיוזה II, רשום את מספר מסות הדנ"א.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לעקוב אחר הפרדת הכרומטין, חלבון היסטון Htb2 תויג עם mCherry. בפרופאזה I, הכרומטין מופיע כמסת Htb2 יחידה. לאחר שהכרומוזומים ההומולוגיים מופרדים בחלוקה המיוטית הראשונה, הכרומטין מופיע כשתי מסות נפרדות (איור 3A). לאחר שהכרומטידים האחים נפרדים, הכרומטין מופיע כארבע מסות. אם כרומוזומים מסוימים אינם מצליחים להתחבר למיקרוטובולים ציריים, ניתן לראות מסות נוספות לאחר מיוזה I או מיוזה II.

השיטה שתוארה לעיל שימשה לחקר תפקידו של רכיב הקינטוכורה Ctf19 בהבטחת הפרדה נכונה של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משלב את מערכת NDT80-in לסנכרון תאים, את טכניקת ה-anchor away לרוקן חלבונים מהגרעין, ואת המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית בהילוך מהיר כדי לדמות תאי שמרים ניצנים במהלך מיוזה. מערכת NDT80-in היא שיטה לסנכרון מחזור תאים מיוטי המשתמשת בפרופאזה I לעצור ולשחרר 4,8. למרות שתאים בודדים ישתנו מעט בכמות הזמן המושקעת בכל אחד מהשלבים המיוטיים הבאים, רוב התאים ישמרו על רמה גבוהה של סינכרוניזציה לאורך כל החלוקה המיוטית.

טכניקת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למרכז ההדמיה למיקרוסקופיית אור באוניברסיטת אינדיאנה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות (GM105755).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
&בטא;-אסטרדיולMillipore SigmaE8875הכינו מלאי 1mM ב-95% EtOH
0.22 uM מסנן בקבוק הברגהMillipore SigmaS2GPT02RE
100% EtOHFisher Scientific22-032-601
10X PBSFisher ScientificBP399500לדלל 1:10 לשימוש כממס עבור ConA
24 מ"מ x 50 מ"מ כיסוי מס' 1.5VWR צפון אמריקה48393241
25 מ"מ x 75 מ"מ שקופיות מיקרוסקופVWR צפון אמריקה48300-026
מלח אדנין המיסולפטMillipore SigmaA9126לתוספת SC, SCA ו-1% Kac
Bacto AgarBD214030
Concanavialin AMllipore SigmaC2010Make as 1mg/mL ב-1X PBS
CoolSNAP HQ2 CCD מצלמהפוטומטריההמשמשת בסעיף 4.3
D-גלוקוזפישר סיינטיפיקD16-10
Difco שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינוBD291920
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Millipore SigmaD5879
Eclipse Ti2 מיקרוסקופ מטרה הפוכהניקוןבשימוש בסעיף 4.4
פיג'יNIHהורד מ
https://fiji.sc/ GE Personal DeltaVision MicroscopeApplied Precisionהמשמש בסעיף 4.3
L-Tryptophan Millipore SigmaT0254להשלמת SC, SCA ו-1% Kac
דוגמנות חימרCrayola  2302880000כדי לאבטח את החלקת הכיסוי במחזיק שקופיות
NIS-Elements AR 5.30.04 תוכנת הדמיהNikonבשימוש בסעיף 4.4
מצלמת ORCA-Fustion BTHamamatsuC15440-20UPבשימוש בסעיף 4.4
מחזיק קצה פיפטה מפלסטיקDot ScientificLTS1000-HRחותכים קטע מרובע בגודל 4 x 4 מרובע של חלק המתלה של מוצר זה. 
Pottassium AcetateFisher ScientificBP264
RapamycinFisher ScientificBP29631הכינו מלאי של 1 מ"ג/מ"ל ב-DMSO
איטום סיליקוןAqueon100165001הידוע גם בשם דבק אקווריום.
רךWorx7.0.0  תוכנת הדמיהיישמה דיוקבשימוש בסעיף 4.3
תערובת שלמה סינתטית (קייזר) FormediumDSCK2500
סוג N שמן טבילה  ניקוןMXA22166

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
  2. Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136(2020).
  3. van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
  4. Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
  5. Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
  6. Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
  7. Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
  8. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  9. Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
  10. Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
  11. Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
  12. Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
  13. Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629(2009).
  14. Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
  15. Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
  16. Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
  17. Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195(2006).
  18. Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
  19. Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).
  20. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5(2014).
  21. Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
  22. Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
  23. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  24. Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
  25. Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
  26. Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
  27. Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Anchor AwayCtf19

מאמרים קשורים