Method Article

יישום של ורמימטריית זרימה לכימות וניתוח של מיקרוביום המעי Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/64605

⸱

March 31st, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research and Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Development, Disease Models and Therapeutics Program, Graduate School of Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans הוא מודל רב-עוצמה לבחינת הדטרמיננטים המולקולריים המניעים אינטראקציות בין המארח למיקרוביום. אנו מציגים צינור בתפוקה גבוהה המתאר את רמות ההתיישבות של מיקרוביום המעי בבעלי חיים בודדים יחד עם היבטים מרכזיים של הפיזיולוגיה של C. elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להרכב מיקרוביום המעי יכולה להיות השפעה דרמטית על הפיזיולוגיה של המאכסן לאורך ההתפתחות והחיים של החיה. מדידת השינויים בהרכב המיקרוביום חיונית לזיהוי הקשרים התפקודיים בין השינויים הפיזיולוגיים הללו. Caenorhabditis elegans התפתחה כמערכת מארחת רבת עוצמה לבחינת המניעים המולקולריים של אינטראקציות מיקרוביום מארח. בעזרת תוכנית הגוף השקופה שלו והמיקרובים הטבעיים המתויגים כפלואורסצנטיים, ניתן לכמת בקלות את הרמות היחסיות של מיקרובים בתוך מיקרוביום המעי של בעל חיים בודד מסוג C. elegans באמצעות ממיין חלקיקים גדול. כאן אנו מתארים את ההליכים להקמה ניסיונית של מיקרוביום, איסוף וניתוח של אוכלוסיות C. elegans בשלב החיים הרצוי, תפעול ותחזוקת המיון, וניתוחים סטטיסטיים של מערכי הנתונים המתקבלים. כמו כן, נדון בשיקולים לאופטימיזציה של הגדרות המיון בהתבסס על המיקרובים המעניינים, בפיתוח אסטרטגיות גטינג יעילות לשלבי החיים של C. elegans , וכיצד לנצל את יכולות המיון להעשרת אוכלוסיות בעלי חיים בהתבסס על הרכב מיקרוביום המעי. דוגמאות ליישומים פוטנציאליים יוצגו כחלק מהפרוטוקול, כולל פוטנציאל למדרגיות ליישומים בעלי תפוקה גבוהה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אבולוציה של בעלי חיים נמצאת תחת השפעה מיקרוביאלית מתמדת1. ממיקרובים מגוונים בסביבה, פונדקאים של בעלי חיים רוכשים שותפים ספציפיים2 המרחיבים את יכולותיו של הפונדקאי ומניעים את הפיזיולוגיה והרגישות שלו למחלות3. לדוגמה, ניתוחים מטאגנומיים של מיקרוביום המעי חשפו סוגים מטבוליים מועשרים של גנים מיקרוביאליים שעשויים להעניק קצירת אנרגיה גדולה יותר ואחסון בעכברים שמנים4, שרבים מהם נמצאים גם במיקרוביום המעי האנושי5. עדיין יש צורך גדול לבסס קשרים סיבתיים ולאתר את הגורמים המולקולריים של השפעת המיקרוביום, אם כי ההתקדמות עוכבה על ידי מורכבות המיקרוביום והיכולת של מערכות מארחות לבצע בדיקות סקר בקנה מידה גדול.

אורגניזם המודל C. elegans מספק פלטפורמה לקידום הבנה מולקולרית של הקשרים בין מיקרוביום ופיזיולוגיה של המאכסן. C. elegans בעל 20 תאי מעיים עם שכבה רירית ומבנים villi. תאים אלה מצוידים בשפע גנים כימורצפטורים החשים תוצרים מיקרוביאליים ומייצרים מולקולות אנטי-מיקרוביאליות שעשויות לווסת את מושבות המעיים שלהם 6,7. הביולוגיה השמורה הזו של C. elegans הובילה למספר עצום של תגליות באיתות מארח המווסתות את חיידקי המעי, כולל איתות אינסולין, TGF-beta ו-MAP Kinase 8,9,10.

C. elegans משתמשים במיקרובים הן כתזונה לגדילה במהלך ההתפתחות והן כמיקרוביום כמבוגרים. עם הזקנה, חלק מהחיידקים עלולים להצטבר יתר על המידה בלומן המעי והקשר בין הפונדקאי למיקרוב עובר מסימביוזה לפתוגנזה11. בבתי הגידול הטבעיים שלהם, C. elegans פוגש מגוון רחב של מיני חיידקים12,13. ריצוף rDNA 16S מדגימות מייצגות שנאספו בבתי גידול טבעיים (פירות רקובים, גזע צמח ווקטורים של בעלי חיים) גילה כי המיקרוביום הטבעי של C. elegans נשלט על ידי ארבעה פילות חיידקים: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, ו Actinobacteria. בתוך חלוקות אלה טמונה שונות רבה במגוון ובעושר של חיידקים המבוססים על בית הגידול12,13,14,15. מספר קהילות מוגדרות הוקמו, כולל אוספי 63 חברים (BIGbiome)16 ו-12 חברים (CeMbio) המייצגים את סוגי המיקרוביום המובילים שנוצרו עבור קהילת המחקר C. elegans 17. גם למיקרוביום וגם לזני רכיבים יכולה להיות השפעה מגוונת על הפיזיולוגיה של C. elegans, כמו גודל הגוף, קצב הגדילה ותגובות סטרס 9,16,17. מחקרים אלה מספקים משאבים ודוגמאות לביסוס C. elegans כמודל לחקר המיקרוביום.

כאן מוצג תהליך עבודה מבוסס ממיין חלקיקים גדול (LPS) (איור 1) המשתמש במערכת C. elegans כדי למדוד בו-זמנית את הרכב המיקרוביום ואת המדדים הבסיסיים של הפיזיולוגיה של המאכסן בקנה מידה של האוכלוסייה. מהצד המיקרוביאלי, זרימת העבודה ניתנת להתאמה כדי להרכיב מיקרוביום מוגדר או מיקרואורגניזמים בודדים כדי לבחון את החוסן והפלסטיות של הקהילה עם אינטראקציות מיקרוביאליות הולכות וגדלות. מהצד המארח, זרימת העבודה מאפשרת מבחני תפוקה גבוהה למדידת רמות הקולוניזציה של מיקרובים פלואורסצנטיים במיקרוביום וקריאה פיזיולוגית של המארח במונחים של התפתחות, גודל גוף ורבייה. יחד, מודל המיקרוביום של C. elegans מאפשר למסכים בעלי תפוקה גבוהה לאתר את הגורמים המטבוליים והגנטיים המווסתים את הפיזיולוגיה של המאכסן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תערובת מיקרוביום

  1. הטביעו או הוציאו חיידקים ממלאי גליצרול במקפיא על צלחת ציר ליזוגני (LB), או מדיום גידול מתאים, וגדלו במשך הלילה בטמפרטורה אופטימלית המבוססת על זני חיידקים מעניינים (בדרך כלל 25°C עבור חיידקים טבעיים של C. elegans ).
  2. מצלחת LB, השתמש במושבה אחת מכל מבודד חיידקי (למשל, 12 חיידקים מאוסף CeMbio) כדי לחסן 800 μL של מדיום LB בבארות נפרדות של צלחת באר עמוקה של 1 מ"ל. יש לדגור לילה בטמפרטורה האופטימלית עם רעידות ב-250 סל"ד.
    הערה: פרוטוקול זה ממוטב לשימוש עם מיקרוביום טבעי מוגדר (למשל, CeMbio), אך ניתן להתאים אותו בקלות למיקרובים בודדים על ידי גידול בתנאים מתאימים או כלי תרבית אחרים (צינורות).
  3. להעריך את הצמיחה של כל מיקרואורגניזם על ידי ספקטרופוטומטריה. מעבירים אליציטוט של 20 μL ל-80 μL של LB ומוסיפים את התמיסה לצלחת תחתונה שטוחה ושקופה בעלת 96 בארות. מדוד את OD600 בקורא לוחות.
  4. לאחר גידול לילה, צנטריפוגו את צלחת התרבית של באר עמוקה ב 4,000 x גרם במשך 10 דקות כדי להניף חיידקים ולהסיר את supernatant על ידי שאיפה באמצעות סעפת שאיפה 96 באר או פיפטה רב ערוצית.
  5. באמצעות ערכי OD 600, נרמלו את הריכוז של כל חיידק ל-OD600 סופי של 1.0 באמצעות תווך M9 סטרילי.
  6. אם אתם משלבים חיידקים, קבעו את כמות תרבית החיידקים הדרושה לניסוי וצרו תערובת מאסטר של מיקרוביום על ידי שילוב נפחים שווים של כל זן חיידקים לתוך צינור בגודל מספיק (למשל, צינורות של 5 מ"ל או 15 מ"ל).
  7. נקוב 30-50 μL של המיקרובים עם OD600 סופי של 1.0 על המרכז של כל מדיום גידול נמטודות (NGM) צלחת המכילה אגר או באר18. אפשרו למיקרוביום הזרעים לגדול במשך הלילה בטמפרטורה אופטימלית (25°C כאן).
    הערה: הכינו מראש צלחות אגר NGM בהתאם להוראות בספר התולעים או באמצעות אבקת NGM18 מעורבבת מראש. לדוגמה, 3 מ"ל של NGM מתווסף עבור לוחות 12 בארות, ו 1.5 מ"ל מתווסף עבור לוחות 24 באר.

2. הכנת C. elegans מסונכרנים לגדילה על המיקרוביום

  1. לגדל כ-100 תולעים על לוחות NGM (בקוטר 6 ס"מ) עם זרעי Escherichia coli OP50, עד שהתולעים מגיעות לבגרות גרבידית. לצורך פרוטוקול זה נעשה שימוש בזן C. elegans N2, אם כי ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לזני נמטודות אחרים.
  2. הוסף 6 מ"ל של חיץ M9 (בתוספת 0.01% טריטון X-100; M9-TX) לצלחת, מעלה ומטה כדי לשטוף כ-100 תולעים בוגרות גרבידיות לתוך צינור חרוטי בנפח 15 מ"ל.
  3. הכינו תמיסת אקונומיקה טרייה על ידי ערבוב שני חלקים של אקונומיקה עם חלק אחד של 5 M NaOH.
  4. צנטריפוגה את התולעים ב 3,000 x גרם במשך 30 שניות כדי לגלול את התולעים. שואפים להוריד את הנפח ל 4 מ"ל, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של תמיסת אקונומיקה.
  5. סגור את המכסה בחוזקה ונער את הצינור. נטרו את התולעים הבוגרות בתמיסה תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של פי 10. כאשר גופים בוגרים מתחילים להתפרק, בדרך כלל לאחר 3.5 דקות, להפסיק לרעוד ולצנטריפוגה ב 3,000 x גרם במשך 30 שניות.
  6. שואפים לנפח מינימלי עם פיפטה. השהיה, צנטריפוגה ושאפו ארבע פעמים ב-M9-TX לשטוף את האקונומיקה.
  7. יש להשהות מחדש ב-4-6 מ"ל של M9-TX ולהניח את הצינור על מסובב למשך הלילה, מה שמאפשר לביצים לבקוע ולהסתנכרן בשלב L1.
  8. למחרת, קח 10 μL של תולעי L1 ב- M9-TX מהצינור ושחרר אותם על צלחת פטרי נקייה. ספרו את מספר תולעי L1 החיות תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה כוללת של פי 20.
  9. בהתבסס על צפיפות L1, פיפטה את הנפח המתאים כדי להפיל ~ 50 זחלי L1 מסונכרנים על קצה לוחות זרעי המיקרוביום NGM ולדגור ב 20 ° C. אפשרו לתולעים לגדול עד לגיל הרצוי (יום 2 או יום 3 לבגרות).

3. איסוף אוכלוסיית תולעים לצורך ניתוח מיקרוביום המעי

  1. שטפו את התולעים מהדשא החיידקי עם 1-2 מ"ל של M9-TX לצלחת מעוקרת 2 מ"ל 96 באר עמוקה.
    הערה: עבור זנים מיקרוביאליים שיוצרים ביופילמים משמעותיים, נערו את הצלחת עם נוזל במשך 5 דקות כדי לפרק פסולת מיקרוביאלית.
  2. צנטריפואת צלחת באר עמוקה ב 300 x גרם במשך 1 דקות כדי pellet את התולעים, ולאחר מכן להסיר את הנוזל באמצעות סעפת שאיפה.
    הערה: משתמשים יכולים להשתמש בפיפט רב-ערוצי כדי להסיר את הנוזל באופן ידני אם סעפת שואפת אינה זמינה. ודא שקצות פיפטה אינם נוגעים בתחתית הבארות כדי למנוע אובדן של דגימות תולעים.
  3. הוסף 1.8 מ"ל של M9-TX לכל באר של צלחת באר עמוקה באמצעות פיפטה רב ערוצית 1.2 מ"ל. מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כמה פעמים, וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך דקה אחת. חזור על שלב זה ארבע פעמים כדי להסיר חיידקים בנוזל.
  4. לאחר השטיפה הסופית, מביאים את הנפח בכל באר ל -100 מיקרוליטר באמצעות סעפת השאיפה.
    הערה: כדי להפריד מבוגרים מהזחלים באמצעות כוח הכבידה, השאירו את הצלחת על הספסל למשך 30-60 שניות, ואפשרו לתולעים בוגרות לשקוע לתחתית הבאר. לאחר מכן, שואפים את הצלחת כדי להסיר זחלים מן ההשעיה.
  5. הוסף 100 μL של 10 mM levamisole ב- M9-TX לכל באר ואפשר לתולעים לשתק למשך 5 דקות. לאחר הטיפול בלבמיזול, יש להוסיף 4% מתמיסת האקונומיקה המתוארת בשלב 2.3 לכל באר למשך 2 דקות כדי להפחית את היווצרות החיידקים, במידת הצורך. יש לשטוף עם M9-TX פעמיים לאחר טיפול האקונומיקה ולשאוף לנפח סופי של 100μL לאחר השטיפה השנייה.
  6. מעבירים תולעים לצלחת שטוחה תחתונה בת 96 בארות המכילה 150 μL של 10 mM levamisole ב- M9-TX. שמרו על צפיפות התולעים על 50-100 לבאר ופצלו את התולעים למספר בארות אם האוכלוסייה צפופה מדי.

4. הגדרת סדרן החלקיקים הגדול והדוגם האוטומטי

  1. הפעל את מדחס האוויר, המחשב ומכשיר ה- LPS. בדוק ורוקן את מיכל האשפה. לאחר מכן, הוסף 500 מ"ל אקונומיקה למיכל הפסולת הריק. בדוק ומלא מחדש את הנדן ואת מיכלי המים אם הנפח נמוך. ודא שמכלול הליבה הנוזלית והאופטית (FOCA) של 250 מיקרומטר נמצא במקומו.
  2. הפעל את חלקיקי הבקרה לבקרת איכות. פתח את תוכנת מכשיר LPS. בחלון התוכנה, סמן את הפעל לייזרים כדי להפעיל את הלייזרים של 488 ננומטר ו- 561 ננומטר.
    הערה: ניתן לדלג על שלבים 4.2-4.5 אם חלקיקי הבקרה הופעלו במהלך השבועיים האחרונים ו-FOCA לא השתנה בזמן זה.
  3. בחר הגדר חלקיקי בקרה >. בחר לא בבקשה כדי לעבור להגדרות ברירת המחדל. מערבלים את חלקיקי הבקרה (10 מ"ל, dH,2O ו 10 מ"ל חלקיקי בקרה בצינור חרוטי 50 מ"ל) לפני כל שימוש וטוענים אותם על יציאת הדגימה.
  4. כאשר מוכן, לחץ על רכוש כדי להקליט 500 אירועים. ודא שקצב האירוע קורא בין 15 ל-30 אירועים/שניות.
    הערה: אם קצב האירועים אינו 15-30 אירועים/שנייה, יש ליצור קשר עם מהנדס כדי להתאים את הגדרות המכשיר.
  5. לבחון מקדם שונות (CV) עבור כל הפרמטרים. אם CV < 15%, בקרת האיכות מועברת וניתן לסגור את תוכנת LPS. אם CV > 15%, הפעל שוב והתאם מיקרומטרים עם חלקיקי בקרה טריים כדי ליישר את הלייזר עם תא הזרימה.
  6. חבר והפעל את הדוגם האוטומטי. פתח את תוכנת לוח המחוונים autosampler. פעולה זו פותחת את autosampler ואת תוכנת LPS. בחלון תוכנת LPS, עבור אל File > New Experiment ולאחר מכן File > New Sample. סמן את הפעל לייזרים כדי להפעיל לייזרים של 488 ננומטר ו- 561 ננומטר אם זה עדיין לא נעשה.
  7. צור תבניות עבור תרשימי נקודות רכישה באמצעות זמן טיסה (TOF), הכחדה (EXT) ותעלות פלואורסצנטיות בחלון התוכנה LPS. מספר מקסימלי התחלתי טוב ללכידת כל התולעים הוא 8,000 עבור TOF ו- EXT. קשקשי הפלואורסצנטיות ישתנו בהתאם לכל מיקרואורגניזם. כלול דגימות תולעי ביקורת שגדלו על מיקרוב שאינו פלואורסצנטי (למשל, OP50) וכל מיקרוב פלואורסצנטי לבדו (אם מערבבים חיידקים) כביקורת בכל ניסוי.
    1. לחצו לחיצה ימנית בתוך גוף התרשים לשינוי קנה המידה. השתמש בחיות ביקורת כגון מבוגרים ביום 1 או L1s מסונכרנים (או אוכלוסייה מעניינת) כדי לסייע בבחירת TOF ו- EXT gating.
  8. בחלון הדגימה האוטומטית, בחר Prime. עבור אל קובץ > פתח סקריפט כדי לבחור את הסקריפט המובנה הנכון ולאחר מכן לחץ על אישור.
    1. לניתוח בלבד, בחר את הסקריפט עם Acquire. למיון, בחר את הסקריפט עם Dispense. לרכישה מלוחות 96 בארות, בחר את התסריט עם 96 באר; לרכישה מלוחות 384 באר, בחר את התסריט עם 384 באר. לנפח הדגימה (40 או 100 μL), בחר בסקריפט עם אמצעי האחסון המתאים.
  9. עבור אל תבנית צלחת בתפריט תוכנת הדוגם האוטומטי כדי לבחור את הבארות הרצויות לניתוח. טען את דגימות הבקרה. לאחר טעינת הלוחית לשלב הדגימה האוטומטית ואבטחה, לחץ על הפעל צלחת בחלון הדוגם האוטומטי. שמור את הקובץ כאשר תתבקש לעשות זאת.
    הערה: ניתן לבצע דגימות בקרה והגדרות עם צינור חרוטי של 50 מ"ל ביציאת הדגימה LPS לפני חיבור דוגם LP.
  10. בסיום הרכישה, לחץ על הלחצן אחסן נתונים ברצועת הכלים העליונה בחלון תוכנת LPS ושמור את הנתונים שוב.

5. ניתוח תכונות C. elegans ורמות מיקרוביום המעי לבעל חיים

  1. נתונים גולמיים מאוחסנים בשלושה סוגי קבצים: .lmd , .bxr3 .txt. טען את קובץ הטקסט שכותרתו קובץ .txt לתוכנית R לצורך ניתוח. השלם את השלבים הבאים ב- R19.
  2. השתמש בחבילה tidyverse20 כמסגרת לניתוח.
  3. באמצעות הפונקציה ggplot (הכלולה ב- tidyverse) התווה את נתוני LPS באמצעות ערכי TOF כציר x וערכי EXT כציר y. תרשים רגיל יראה שני עננים של נקודות. ודא שאחד מהם קרוב למוצא ולציר ה-x, המציין חלקיקים קטנים יותר כגון זחלים ופסולת קטנה, וקבוצת החלקיקים השנייה נמצאת בפינה הימנית העליונה של העלילה ומייצגת נמטודות בוגרות.
  4. באמצעות קיבוץ זה כקו מנחה, בחר ערכי חיתוך מתאימים של TOF ו- EXT. גטינג עשוי להשתנות לפי זני C. elegans על מיקרובים שונים בהתבסס על שינויים בפיזיולוגיה (למשל, בעלי חיים כהים לעומת שקופים או שינויים בהובלת ביצים עשויים לשנות מקדמי EXT).
  5. השתמש בתת-קבוצת הפונקציות כדי להפריד בין בוגרים לזחלים באמצעות TOF ו-EXT gating. בדוגמה כאן, השתמש בהגדרות TOF > 1,200 ו- EXT >- 1,000 כדי לשער עבור בעלי חיים בוגרים.
  6. לנתח את מערכי הנתונים המתקבלים עבור הבדלים סטטיסטיים; השתמש בפונקציית מבחן t ב- R עבור ניסוי זה.
    1. כדי לקבוע את השפעת המיקרוביום על הגודל והצפיפות האופטית של C. elegans, השוו את ערכי TOF ו-EXT, בהתאמה, בין התנאים. TOF הוא פרוקסי לגודל התולעת ויכול להצביע על שינויים בקצב הצמיחה של בעלי החיים בזמנים ספציפיים. שינויי EXT הם הגדולים ביותר בין סוף ההתפתחות לבגרות בשל האור המפוזר על ידי ביצים וניתן להשתמש בהם כדי להעריך שינויים בעיתוי המעבר והפריון. להעריך את היחס ואת ההתפלגות של הצאצאים אם הם נשמרו במהלך הניתוחים.
    2. כדי לקבוע שינויים ברמות ההתיישבות של מיקרוביום המעי, תחילה נרמלו ערכי פלואורסצנטיות (למשל, עמודות אדומות או ירוקות) על-ידי חלוקה עם ערכי TOF נפרדים עבור כל חיה. ככל שהתולעים גדלות והופכות לבוגרות, נפח המעיים שלהן גדל גם כן. נורמליזציה מסייעת להפחית ממצאים מהבדלים בהתפלגות גודל בעלי החיים לדוגמה. השתמשו בבעלי חיים מנורמלים כדי להעריך שינויים בהתיישבות מיקרוביום המעי בכל התנאים.
      הערה: ניתן למצוא דוגמה לנתונים גולמיים וסקריפטים תואמים של R בקובץ המשלים 1 JOVE_worm_microbiome.txt ובקובץ המשלים 2 JOVE_worm_microbiome.r. ראו איור 2 ואיור 3 כדוגמה מייצגת לניתוחים האלה של הפונדקאי והמיקרוביום באמצעות שני חיידקים פלואורסצנטיים.

6. מיון בעלי חיים מסוג C. elegans לפי תכונות מיקרוביום המעי

  1. אספו אוכלוסיית C. elegans שגדלה על חיידקים עם תיוג פלואורסצנטי (למשל, RFP) כמתואר בשלב 3. תולעים צריך להיות ממוקם לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטי עם מינימום של 5 מ"ל של דגימה. יש לשאוף לכ-2,000 תולעים/מ"ל כולל כל הבוגרים והצאצאים.
    הערה: ניתן לעשות זאת גם בצלחת שטוחה בעלת 96 בארות תחתונה באמצעות דוגם LP. שמור על צפיפות התולעת על 50-100 לכל באר.
    1. אם נעשה שימוש בדוגם LP, כבה ונתק את דוגם LP. חבר מחדש את הדגימה ונקה קווים ל- LPS לפני המיון.
  2. פתח את תוכנת LPS, עבור אל קובץ > ניסוי חדש ולאחר מכן קובץ > מדגם חדש. צור תרשים נקודה עם TOF על ציר x והכחדה על ציר y. צור תרשים נקודות נוסף עם TOF על ציר x ואדום על ציר y. השתמש באותו קנה מידה של ציר והגדרות לייזר שבהן נעשה שימוש בעבר. סמן את אפשר לייזרים כדי להפעיל לייזרים של 488 ננומטר ו- 561 ננומטר
    הערה: אם תרשימים אלה נוצרו בעבר, עבור אל File > Open Experiment ו- File > Open Sample כדי לטעון גרפים.
    1. הנח את צינור דגימת הבקרה על יציאת הדגימה. בתיבת הדו-שיח Acquire/Dispense, לחץ על Acquire. שמור את הקובץ כאשר תתבקש לעשות זאת. לאחר שנמדדו מספיק תולעים כדי להבחין בין אוכלוסיות, לחץ על בטל.
      הערה: קצבי הזרימה צריכים להיות בערך 15-30 אירועים לשנייה. אם לא, התאימו את ריכוזי התולעים כדי להבטיח שבעלי חיים בודדים ינותחו או ימוינו לכל טיפה. ב-LPS, תולעים עוברות בנתיב הלייזר בתנוחות שונות (ישר לעומת מסולסל או כפוף). הם יכולים לקחת כמות שונה של זמן כדי לעבור את הלייזר ואת הגלאי בהתאם למיקומים שלהם.
    2. בעלילת TOF vs Extinction dot לצייר שער סביב האוכלוסייה הבוגרת. בתרשים TOF לעומת Red dot ציירו שערים סביב האזורים עם ערכים אדומים גבוהים ונמוכים כאזורי עניין עבור תולעים בוגרות עם רמות שונות של התיישבות מיקרוביום. עבור אל View > Gating Hierarchy וודא ששערי הפלואורסצנט רשומים תחת שער האוכלוסייה הבוגרת. לאחר מיטוב ההגדרות, עבור אל File > Save Experiment ו- File > Save Sample.
      הערה: בדוגמה כאן, בחר בעלי חיים המבוססים על שערי TOF/EXT למבוגרים וממיין לבריכות המציגות התיישבות גבוהה או נמוכה עם חיידקים המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום. עם זאת, כל שילוב של פרמטרים שנמדדו על ידי LPS יכול לשמש כדי לזהות את האוכלוסייה (ים) של עניין.
  3. לפני המיון, יש לוודא שמנגנון האיסוף המתאים הועמס. כדי לטעון את לוח 96 הקימורים למנגנון האיסוף, בחר Load Plate A > Move תחת המקטע Move Stage בתיבת הדו-שיח Acquire/Dispense כדי לאפשר לשלב האיסוף לעבור למצב המיועד לטעינת לוח של 96 קידוחים.
  4. למיון בתפזורת, בחר את גודל הצינור המתאים ולחץ על העבר כדי לטעון צינור חרוטי של 15 מ"ל או 50 מ"ל. במקטע מיון בתיבת הדו-שיח רכישה/ניפוק, בחר את שער המיון מהרשימה הנפתחת של האזורים שנוצרו. הזן את מספר האובייקטים מהאזור המוגדר כדי לחלק לצינור איסוף ישירות מתחת לפיית תא הזרימה. לחץ על כפתור מיון בכמות גדולה תחת תיבת הדו-שיח רכישה/ניפוק.
  5. לחלוקה לצלחת של 96 בארות, עבור אל Setup > Plates > Calibrated Plates > 96-well Plate. לאחר מכן עבור אל הצג תבנית צלחת >, בחר את הבארות שאליהן ימוינו התולעים, הזן את מספר האובייקטים שיש למיין לכל באר ובחר את אזורי העניין המגודרים. אם יותר מאזור מגודר אחד ימוין לאותה לוחית, סמן את התיבה שער כל באר. לחץ על אישור כדי לשמור את השינויים.
  6. לאחר מיון מספרים ומיקומים, לחץ על לחצני צלחת מילוי מתיבת הדו-שיח רכישה/חלוקה כדי להתחיל חלוקה לצלחת בת 96 בארות.
    1. לפני מילוי כל צלחת 96 בארות, בצע מיון בדיקה של תת-קבוצה של בעלי חיים או בקרות לתוך צלחת של 96 בארות ונתח באמצעות סטריאומיקרוסקופ כדי להבטיח מספרים מתאימים ואוכלוסיות בעלי חיים רצויות מוינו. לאחר אישור המיון המדויק, חזור על שלבים 6.3-6.6 עבור דגימות ניסיוניות. לחץ על הלחצן אחסן נתונים ברצועת הכלים העליונה בחלון תוכנת LPS כדי לשמור נתונים שוב.
      הערה: ניתן לאסוף את כל המדידות (EXT, TOF, RFP, GFP וכו ') גם עבור בעלי חיים ממוינים ולהשוות אותם לאלה שלא מוינו. זה יכול לאפשר להפעיל מצבי ניתוח ומיון בו-זמנית, אם תרצה בכך.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגדרת שערי אוכלוסייה של בוגרים וזחלים
כאן, C. elegans L1s מסונכרנים גודלו על צלחת NGM שנזרעה עם E. coli OP50 (Eco), דיאטת מעבדה סטנדרטית. אוכלוסיות C. elegans נאספו לניתוח LPS לאחר 96 שעות או 120 שעות של צמיחה ב-20°C (איור 2A). חלקת נקודה של הכחדה (EXT, פרוקסי של צפיפות הגוף) לעומת זמן טיסה (TOF, פרוקסי של אורך הגוף) יוצרת שני עננים מופרדים חזותית של בעלי חיים. כל נקודה מייצגת חיה אחת שבה ערכי EXT ו-TOF גבוהים יותר נצפים ממבוגרים בהשוואה לזחלים ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ורמימטריית זרימה שימשה לאפיון גנים ומסלולים של C. elegans כנגד התיישבות פתוגנים ורעילות במספר מחקרים21,22. כאן, מוצגת גישה מקובלת בעלת תפוקה גבוהה המשתמשת ב- C. elegans כדי לחקור כיצד מיקרוביום המעי מווסת את הפיזיולוגיה המארחת שלהם. בהשוואה לשיטות קיימות המשתמשות ביחידות יוצרות מושבה (CFU) או ריצוף אמפליקון rRNA 16S 9,16,17,23,24

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH DP2DK116645 (ל- B.S.S.), פרס הטייס של קרן דאן ומענק נאס"א 80NSSC22K0250 (ל- B.S.S). פרויקט זה נתמך גם על ידי Cytometry and Cell Sorting Core במכללת ביילור לרפואה במימון פרס CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), ה-NIH (S10 OD025251, CA125123 ו-RR024574), ובסיועו של ג'ואל מ. סדרסטרום, בתוספת מענק מכשור למענק LPS NIH (S10 OD025251). חלק מהזנים סופקו על ידי CGC, הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות צנטריפוגה תחתונים חרוטיים 15 מ"לVWR10026-076
96 צלחות באר עמוקות (1 מ"ל)AxygenP-DW-11-C
96 צלחות באר עמוקות (2 מ"ל)AxygenP-DW-20-C
96 בארות צלחת קוסטארקורנינג3694
אגרמיליפור סיגמאאגר בקטריולוגיה סטנדרטית מספיקה גם היא.
סעפת שאיפהV& P מדעיVP1171A
אקונומיקהקלורוקס
אקונומיקה לערבב אקונומיקה עם 5M נתרן היפוכלוריט 2:1 (v/v)
קורא הדמיית תאים מולטימודBiotekCytation 5מדידת OD חיידקי
צנטריפוגהתרמו מדעית Sorvall Legend XTRעבור 96 בארות צלחת וצינורות חרוטיים
מיקרוסקופ פלואורסצנטיNikonTiE
ggplot: כלי תכנות R שונים להתוויית נתונים.חבילת Rגרסה 3.3.2
דגימה אוטומטית של חלקיקים גדוליםאיחוד ביומטריקהLP דוגם
חלקיקים גדולאיחוד ביומטריהCOPAS Biosorter
LevamisoleFisherAC187870100
Lysogeny Broth (LB)RPIL24066מתכונים ביתיים סטנדרטיים של LB באמצעות Bacto-tryptone, תמצית שמרים ו-NaCl הם גם כן מספיק.
פתרון M9 22 מ"מ KH2PO4 מונובסיסי, 42.3 מ"מ Na2HPO4, 85.6 מ"מ NaCl, 1 מ"מ MgSO4
גידול נמטודות בינוניRPIN81800-1000.01 מ"מ CaCl2, 25 מ"מ KPO4 pH 6.0, 1 מ"מ MgSO4 נוסף לאחר חיטוי.
RStudioGNUגרסה 1.3.1093
נתרן היפוכלוריטסיגמא-אולדריץ'5M
מיקרוסקופ סטריאוניקוןSMZ745
סטרילי קוטר 10 ס"מ צלחות פטריקורנינג351029
צלחות סטריליות 12 בארותVWR10062-894
צלחות סטריליות 24 בארותVWR10062-896
צלחות פטרי סטריליות בקוטר 6 ס"מקורנינג351007
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'T8787
תמיסת סדרן NaOH

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
  3. Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
  4. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
  5. Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), New York, N.Y. 1355-1359 (2006).
  6. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).
  7. Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
  8. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  9. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  10. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921(2003).
  11. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
  12. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  13. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38(2016).
  14. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  15. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).
  16. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  17. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), Bethesda, Md. 3025-3039 (2020).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
  19. R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
  20. Wickham, H., et al. tidyverse. , (2019).
  21. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068(2018).
  22. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090(2014).
  23. Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49(2012).
  24. Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
  25. Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877(2018).
  26. Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
  27. Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
  28. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
  29. Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow VermimetryGut MicrobiomeCaenorhabditis ElegansMicrobiome QuantificationLarge Particle SorterFluorescent MicrobesGating StrategiesHigh Throughput AnalysisMicrobiome ColonizationHost Microbe Interactions

Related Articles