Method Article

יישום של ורמימטריית זרימה לכימות וניתוח של מיקרוביום המעי Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/64605

⸱

March 31st, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research and Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Development, Disease Models and Therapeutics Program, Graduate School of Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans הוא מודל רב-עוצמה לבחינת הדטרמיננטים המולקולריים המניעים אינטראקציות בין המארח למיקרוביום. אנו מציגים צינור בתפוקה גבוהה המתאר את רמות ההתיישבות של מיקרוביום המעי בבעלי חיים בודדים יחד עם היבטים מרכזיים של הפיזיולוגיה של C. elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להרכב מיקרוביום המעי יכולה להיות השפעה דרמטית על הפיזיולוגיה של המאכסן לאורך ההתפתחות והחיים של החיה. מדידת השינויים בהרכב המיקרוביום חיונית לזיהוי הקשרים התפקודיים בין השינויים הפיזיולוגיים הללו. Caenorhabditis elegans התפתחה כמערכת מארחת רבת עוצמה לבחינת המניעים המולקולריים של אינטראקציות מיקרוביום מארח. בעזרת תוכנית הגוף השקופה שלו והמיקרובים הטבעיים המתויגים כפלואורסצנטיים, ניתן לכמת בקלות את הרמות היחסיות של מיקרובים בתוך מיקרוביום המעי של בעל חיים בודד מסוג C. elegans באמצעות ממיין חלקיקים גדול. כאן אנו מתארים את ההליכים להקמה ניסיונית של מיקרוביום, איסוף וניתוח של אוכלוסיות C. elegans בשלב החיים הרצוי, תפעול ותחזוקת המיון, וניתוחים סטטיסטיים של מערכי הנתונים המתקבלים. כמו כן, נדון בשיקולים לאופטימיזציה של הגדרות המיון בהתבסס על המיקרובים המעניינים, בפיתוח אסטרטגיות גטינג יעילות לשלבי החיים של C. elegans , וכיצד לנצל את יכולות המיון להעשרת אוכלוסיות בעלי חיים בהתבסס על הרכב מיקרוביום המעי. דוגמאות ליישומים פוטנציאליים יוצגו כחלק מהפרוטוקול, כולל פוטנציאל למדרגיות ליישומים בעלי תפוקה גבוהה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אבולוציה של בעלי חיים נמצאת תחת השפעה מיקרוביאלית מתמדת1. ממיקרובים מגוונים בסביבה, פונדקאים של בעלי חיים רוכשים שותפים ספציפיים2 המרחיבים את יכולותיו של הפונדקאי ומניעים את הפיזיולוגיה והרגישות שלו למחלות3. לדוגמה, ניתוחים מטאגנומיים של מיקרוביום המעי חשפו סוגים מטבוליים מועשרים של גנים מיקרוביאליים שעשויים להעניק קצירת אנרגיה גדולה יותר ואחסון בעכברים שמנים4, שרבים מהם נמצאים גם במיקרוביום המעי האנושי5. עדיין יש צורך גדול לבסס קשרים סיבתיים ולאתר את הגורמים המולקולריים של השפעת המיקרוביום, אם כי ההתקדמות עוכבה על ידי מורכבות ה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תערובת מיקרוביום

  1. הטביעו או הוציאו חיידקים ממלאי גליצרול במקפיא על צלחת ציר ליזוגני (LB), או מדיום גידול מתאים, וגדלו במשך הלילה בטמפרטורה אופטימלית המבוססת על זני חיידקים מעניינים (בדרך כלל 25°C עבור חיידקים טבעיים של C. elegans ).
  2. מצלחת LB, השתמש במושבה אחת מכל מבודד חיידקי (למשל, 12 חיידקים מאוסף CeMbio) כדי לחסן 800 μL של מדיום LB בבארות נפרדות של צלחת באר עמוקה של 1 מ"ל. יש לדגור לילה בטמפרטורה האופטימלית עם רעידות ב-250 סל"ד.
    הערה: פרוטוקול זה ממוטב לשימוש עם מיקרוביום טבעי מוגדר (למשל, CeMbio), אך ניתן להתאים אותו בקלות למיקרובים בודדים על ידי גידול בתנאים מתאימים או כלי תרבית אחרים (צינורות).
  3. לה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגדרת שערי אוכלוסייה של בוגרים וזחלים
כאן, C. elegans L1s מסונכרנים גודלו על צלחת NGM שנזרעה עם E. coli OP50 (Eco), דיאטת מעבדה סטנדרטית. אוכלוסיות C. elegans נאספו לניתוח LPS לאחר 96 שעות או 120 שעות של צמיחה ב-20°C (איור 2A). חלקת נקודה של הכחדה (EXT, פרוקסי של צפיפות הגוף) לעומת זמן טיסה (TOF, פרוקסי של אורך הגוף) יוצרת שני עננים מופרדים חזותית של בעלי חיים. כל נקודה מייצגת חיה אחת שבה ערכי EXT ו-TOF גבוהים יותר נצפים ממבוגרים בהשוואה לזחלים .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ורמימטריית זרימה שימשה לאפיון גנים ומסלולים של C. elegans כנגד התיישבות פתוגנים ורעילות במספר מחקרים21,22. כאן, מוצגת גישה מקובלת בעלת תפוקה גבוהה המשתמשת ב- C. elegans כדי לחקור כיצד מיקרוביום המעי מווסת את הפיזיולוגיה המארחת שלהם. בהשוואה לשיטות קיימות המשתמשות ביחידות יוצרות מושבה (CFU) או ריצוף אמפליקון rRNA 16S 9,16,17,23,24

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH DP2DK116645 (ל- B.S.S.), פרס הטייס של קרן דאן ומענק נאס"א 80NSSC22K0250 (ל- B.S.S). פרויקט זה נתמך גם על ידי Cytometry and Cell Sorting Core במכללת ביילור לרפואה במימון פרס CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), ה-NIH (S10 OD025251, CA125123 ו-RR024574), ובסיועו של ג'ואל מ. סדרסטרום, בתוספת מענק מכשור למענק LPS NIH (S10 OD025251). חלק מהזנים סופקו על ידי CGC, הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות צנטריפוגה תחתונים חרוטיים 15 מ"לVWR10026-076
96 צלחות באר עמוקות (1 מ"ל)AxygenP-DW-11-C
96 צלחות באר עמוקות (2 מ"ל)AxygenP-DW-20-C
96 בארות צלחת קוסטארקורנינג3694
אגרמיליפור סיגמאאגר בקטריולוגיה סטנדרטית מספיקה גם היא.
סעפת שאיפהV& P מדעיVP1171A
אקונומיקהקלורוקס
אקונומיקה לערבב אקונומיקה עם 5M נתרן היפוכלוריט 2:1 (v/v)
קורא הדמיית תאים מולטימודBiotekCytation 5מדידת OD חיידקי
צנטריפוגהתרמו מדעית Sorvall Legend XTRעבור 96 בארות צלחת וצינורות חרוטיים
מיקרוסקופ פלואורסצנטיNikonTiE
ggplot: כלי תכנות R שונים להתוויית נתונים.חבילת Rגרסה 3.3.2
דגימה אוטומטית של חלקיקים גדוליםאיחוד ביומטריקהLP דוגם
חלקיקים גדולאיחוד ביומטריהCOPAS Biosorter
LevamisoleFisherAC187870100
Lysogeny Broth (LB)RPIL24066מתכונים ביתיים סטנדרטיים של LB באמצעות Bacto-tryptone, תמצית שמרים ו-NaCl הם גם כן מספיק.
פתרון M9 22 מ"מ KH2PO4 מונובסיסי, 42.3 מ"מ Na2HPO4, 85.6 מ"מ NaCl, 1 מ"מ MgSO4
גידול נמטודות בינוניRPIN81800-1000.01 מ"מ CaCl2, 25 מ"מ KPO4 pH 6.0, 1 מ"מ MgSO4 נוסף לאחר חיטוי.
RStudioGNUגרסה 1.3.1093
נתרן היפוכלוריטסיגמא-אולדריץ'5M
מיקרוסקופ סטריאוניקוןSMZ745
סטרילי קוטר 10 ס"מ צלחות פטריקורנינג351029
צלחות סטריליות 12 בארותVWR10062-894
צלחות סטריליות 24 בארותVWR10062-896
צלחות פטרי סטריליות בקוטר 6 ס"מקורנינג351007
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'T8787
תמיסת סדרן NaOH

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Seedorf, H., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow VermimetryGut MicrobiomeCaenorhabditis ElegansMicrobiome QuantificationLarge Particle SorterFluorescent MicrobesGating StrategiesHigh Throughput AnalysisMicrobiome ColonizationHost Microbe Interactions

Related Articles