הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בדיקת ספוט ריק בזמן אמת

3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64621

⸱

10 בפברואר 2023

 ,  ,  ,  , 
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר שיטה חדשה לחקר התנהגות התרוקנות עכבר על-ידי שילוב ניטור וידאו בבדיקת נקודות הריק הקונבנציונלית. גישה זו מספקת מידע זמני, מרחבי ונפחי על אירועי ההתרוקנות ופרטים על התנהגות עכברים במהלך שלבי האור והחושך של היום.

תקציר

התנהגות התרוקנות נורמלית היא תוצאה של תפקוד מתואם של שלפוחית השתן, השופכה וסוגרי השופכה תחת שליטה נכונה של מערכת העצבים. כדי לחקור התנהגות של התרוקנות מרצון במודלים של עכברים, חוקרים פיתחו את בדיקת נקודות הריק (VSA), שיטה המודדת את מספר ושטח כתמי השתן שהושקעו על נייר סינון המצפה את רצפת הכלוב של בעל חיים. למרות שמבחינה טכנית היא פשוטה וזולה, לבדיקה זו יש מגבלות כאשר משתמשים בה כבדיקת נקודת קצה, כולל חוסר רזולוציה זמנית של אירועי התרוקנות וקשיים בכימות כתמי שתן חופפים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו VSA מנוטר וידאו, שאנו מכנים VSA בזמן אמת (RT-VSA), ואשר מאפשר לנו לקבוע את תדירות ההתרוקנות, להעריך את הנפח המבוטל ואת דפוסי ההתרוקנות, ולבצע מדידות על פני חלונות זמן של 6 שעות הן בשלב החשוך והן בשלב האור של היום. השיטה המתוארת בדו"ח זה יכולה להיות מיושמת במגוון רחב של מחקרים מבוססי עכברים הבוחנים את ההיבטים הפיזיולוגיים והנוירו-התנהגותיים של מיקוריטציה מרצון במצבי בריאות ומחלות.

מבוא

אחסון השתן והמיקטוריציה מתואמים על ידי מעגל מרכזי (מערכת העצבים המרכזית) המקבל מידע על מצב מילוי שלפוחית השתן דרך עצבי האגן וההיפוקיבה. האורותל, האפיתל המרפד את דרכי השתן מאגן הכליה ועד לשופכה הפרוקסימלית, יוצר מחסום הדוק בפני תוצרי הפסולת המטבולית והפתוגנים הנמצאים בשתן. זהו מרכיב אינטגרלי של רשת חושים, אשר חשה ומתקשרת את מצב המילוי של שלפוחית השתן לרקמות הבסיסיותולעצבים 1,2. הפרעה במחסום דרכי השתן, או שינויים במסלולי המכנוטרנסדוקציה של דרכי השתן, עלולה להוביל לתפקוד לקוי של התרוקנות יחד עם תסמינים בדרכי השתן התחתונות כגון תדירות, דחיפות, נוקטוריה ובריחת שתן 3,4,5,6,7. כמו כן, הזדקנות, סוכרת, דלקות בדרכי השתן התחתונות, דלקת שלפוחית השתן אינטרסטיציאלית ותהליכי מחלה אחרים המשפיעים על שלפוחית השתן, או על המעגלים החשמליים הקשורים השולטים בתפקודה, ידועים כגורמים לתפקוד לקוי של שלפוחית השתן 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. הבנה טובה יותר של התנהגות התרוקנות נורמלית וחריגה תלויה בפיתוח שיטות שיכולות להבחין באופן אמין בין דפוסי השתנה שונים.

באופן מסורתי, התנהגות ההתרוקנות מרצון של עכברים נחקרה באמצעות בדיקת נקודת הריק (VSA), שפותחה על ידי Desjardins ועמיתיו 20, ואומצה באופן נרחב בשל פשטותה, עלותה הנמוכה והגישה הלא פולשנית 8,21,22,23,24. בדיקה זו מבוצעת בדרך כלל כבדיקת נקודות קצה, שבה עכבר מבלה פרק זמן מוגדר בכלוב מרופד בנייר סינון, אשר מנותח לאחר מכן על ידי ספירת המספר והערכת גודל כתמי השתן כאשר נייר הסינון ממוקם תחת אור אולטרה סגול (UV) (כתמי השתן פלואורס בתנאים אלה)20. למרות יתרונות רבים אלה, VSA המסורתי מציג כמה מגבלות עיקריות. מכיוון שעכברים משתינים לעתים קרובות באותם אזורים, החוקרים צריכים להגביל את משך הבדיקה לפרק זמן קצר יחסית (≤4 שעות)25. אפילו כאשר ה-VSA מבוצע על פני פרקי זמן קצרים יותר, כמעט בלתי אפשרי לפתור כתמי ריק קטנים (SVS) הנופלים על כתמי ריק גדולים או, להבדיל בין SVS לבין נשיאת שתן המודבקת לזנבות או לכפות. כמו כן, קשה מאוד להבחין אם SVS הם תוצאה של אירועי התרוקנות תכופים אך אינדיבידואליים (פנוטיפ שנצפה לעתים קרובות בתגובה לדלקת שלפוחית השתן 4,26), או עקב כדרור לאחר מיקטוריציה (פנוטיפ הקשור לחסימת מוצא שלפוחית השתן 27). יתר על כן, הרצון להשלים את הבדיקה במהלך שעות העבודה, יחד עם קשיים בגישה למתקני דיור כאשר האורות כבויים, לעתים קרובות מגביל בדיקות אלה לתקופת האור של מחזור הצירקדי 24 שעות. לפיכך, אילוצי זמן אלה מונעים הערכה של התנהגות התרוקנות עכברים במהלך שלב הלילה הפעיל שלהם, ומפחיתים את היכולת לנתח גנים או טיפולים ספציפיים הנשלטים על ידי מקצבים צירקדיים.

כדי להתגבר על חלק מהמגבלות הללו, חוקרים פיתחו שיטות חלופיות להערכת התנהגות ההתרוקנות בזמן אמת 26,28,29,30,31,32. חלק מגישות אלה כוללות שימוש בציוד יקר כגון כלובים מטבוליים26,28,29, או שימוש במצלמות תרמיות30; עם זאת, גם לאלה יש מגבלות. לדוגמה, בכלובים מטבוליים, השתן נוטה להיצמד לחוטי רצפת הרשת ולקירות המשפך, ובכך להפחית את כמות השתן הנאסף ונמדד. לכן, זה יכול להיות קשה לאסוף במדויק נתונים על חללים קטנים. יתר על כן, כלובים מטבוליים אינם מספקים מידע על ההתפלגות המרחבית של אירועי ההתרוקנות (כלומר, השתנה בפינות לעומת מרכז החדר). בהתחשב בכך שקרינת אינפרא אדום באורך גל ארוך המשמשת את המצלמות התרמוגרפיות אינה חודרת למוצקים, פעילות ההתרוקנות המוערכת על ידי תרמוגרפיית וידאו חייבת להתבצע במערכת פתוחה, מה שיכול להיות מאתגר עם עכברים פעילים, מכיוון שהם יכולים לקפוץ כמה סנטימטרים באוויר. מערכת נוספת היא שיטת הכתם המבוטל האוטומטי על נייר (aVSOP) בגישה33, המורכבת מנייר סינון מגולגל המתפתל במהירות קבועה מתחת לרצפת רשת התיל של כלוב עכבר. גישה זו מונעת נזק לנייר וחפיפה של כתמי שתן המתרחשים ב- VSA הקלאסי, ויישומה מאפשר לחוקר לבצע ניסויים במשך מספר ימים. עם זאת, היא אינה מספקת לחוקר תזמון מדויק של אירועי ההתרוקנות, ואין יכולת לבחון התנהגות וכיצד היא קשורה לאיתור. כדי להשיג מידע זה, החוקרים שילבו ניטור וידאו לבדיקות ריקות, גישה המאפשרת הערכה בו זמנית של פעילות עכבר ואירועי השתנה31,32. גישה אחת כוללת הצבת דיודה פולטת אור כחול (LED) ומצלמת וידאו עם מסנן חלבון פלואורסצנטי ירוק המוצב מתחת לכלוב הניסוי כדי להמחיש את אירועי ההתרוקנות, ונורית אינפרא אדום ומצלמת וידאו מעל הכלוב כדי ללכוד את מיקום העכבר32. מערך זה שימש לניטור התנהגות התרוקנות בעת ביצוע פוטומטריית סיבים; עם זאת, הסביבה המוארת של מערכת זו דרשה מהחוקרים לטפל בעכברים שלהם עם חומר משתן כדי לעורר התרוקנות. בתכנון ניסיוני אחר, מצלמות רחבות זווית הוצבו מעל ומתחת לכלוב הניסוי כדי להמחיש פעילות מוטורית של עכבר ואירועי השתנה, בהתאמה. במקרה זה, כתמי שתן שהושקעו על נייר סינון המצפה את רצפת הכלוב נחשפו על ידי הארת נייר הסינון באורות UV שהונחו מתחת לכלוב31. מערך זה שימש בבדיקות קצרות, שנמשכו 4 דקות, במהלך שלב האור של היום כדי לחקור את נוירוני גזע המוח המעורבים בהתנהגות התרוקנות מרצון31. לא דווח על התאמת מערכת זו לשימוש בה בשלב החשוך או לפרקי זמן של >4 דקות.

במאמר זה מתוארת שיטה המשפרת את ה- VSA המסורתי בכך שהיא מאפשרת ניטור וידאו ארוך טווח של התנהגות ריקון עכבר. גישה חסכונית זו מספקת מידע זמני, מרחבי ונפחי על אירועי התרוקנות לפרקי זמן ממושכים במהלך שלבי האור והחושך של היום, יחד עם פרטים הקשורים להתנהגות עכבר 3,4,34. מידע מפורט לבניית תאי הריקות, יישום VSA בזמן אמת (RT-VSA) וניתוח הנתונים מסופק. RT-VSA הוא בעל ערך עבור חוקרים המבקשים להבין את המנגנונים הפיזיולוגיים השולטים בתפקוד מערכת השתן, לפתח גישות פרמקולוגיות לבקרת מיקטוריציה, ולהגדיר את הבסיס המולקולרי של תהליכי מחלה המשפיעים על דרכי השתן התחתונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

Urothelial Piezo1/2 עכברי נוקאאוט כפול (Pz1/2-KO , גנוטיפ: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE+/-) ובקרות (Pz1/2-C, גנוטיפ: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE-/-) נוצרו בתוך החברה מזני הורים שהתקבלו ממעבדות Jax (זן Piezo1 fl/fl # 029213; זן Piezo2 fl/fl # 027720; Upk2CRE+/- זן # 029281). בניסויים נעשה שימוש הן בעכברים נקבות (בנות 1.5-3 חודשים והן במשקל 17-20 גרם) וזכרים (בני 2-4 חודשים ו-23-29 גרם במשקל). עבור ניסויים cyclophosphamide-נגרמת דלקת שלפוחית השתן, נקבות בר C57Bl / 6J (3 חודשים ו ~ 20 גרם במשקל) שימשו (מעבדות ג'קסון, זן # 000664). בעלי חיים שוכנו והניסויים בוצעו במתקן לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת פיטסבורג תחת אישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פיטסבורג. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות של מדיניות שירותי בריאות הציבור בנושא טיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה וחוק צער בעלי חיים.

1. הרכבת כלובים לבדיקת נקודת ריק בזמן אמת (RT-VSA)

  1. מתקן RT-VSA מורכב ממעמד UV המכיל שתי נורות UV ושתי מצלמות רחבות זווית (מצלמות תחתונות), המשמשות לתיעוד פעילות התרוקנות בשלב האור של היום. סדרו שני תאי עכבר כך שיונחו על המעמד. חברו מצלמות רחבות זווית (מצלמות עליונות) למכסה של כל תא עכבר, המשמשות לתיעוד פעילות התרוקנות במהלך השלב החשוך של היום (איור 1A).
  2. בנה את מסגרת מעמד ה- UV ותאי העכבר מ- 1 ב- x 1 בפרופילי אלומיניום עם חריצי T. ראו טבלה 1 לקבלת רשימה של הרכיבים המשמשים לבניית שני תאי עכבר ומעמד UV ואיור 1B–D עבור התצוגות השונות של הרכיבים והמידות שהורכבו.
  3. בנה כל תא עכבר עם שמונה פרופילי אלומיניום עם חריצי T שנחתכו ל-10 אינץ' וארבעה חתוכים ל-14.75 אינץ'. התחילו בהרכבת החלק התחתון של תא העכבר והשתמשו במחברי קצה סטנדרטיים (טבלה 1) כדי להרכיב את הפרופילים עם חריצי T לפי איור 1. הרכיבו את האקריליק משדר UV בגודל 38.5 ס"מ x 26.5 ס"מ בתעלה הפנימית של הפרופילים כדי לבנות את רצפת תאי העכבר.
    הערה: לקבלת מידע מפורט על אופן ההרכבה של פרופילי T-slotted עם מחברי קצה סטנדרטיים, בקר בדף האינטרנט של החברה.
  4. בנה את קירות תא העכבר עם שאר הפרופילים. הרכיבו את לוחות הפוליקרבונט (AR) בגודל 38.5 ס"מ x 21.5 ס"מ ו-26.5 ס"מ x 21.5 ס"מ העמידים בפני שחיקה (AR) בפרופילים כדי להרכיב את הדפנות החיצוניות של תא העכבר. השתמש בלוחות פוליקרבונט AR בגודל 37.5 ס"מ x 23.9 ס"מ ו- 24.4 ס"מ x 23.9 ס"מ AR כדי לבנות את פנים תא העכבר.
  5. אבטח את לוחות הפוליקרבונט AR עם מהדק קצה סטנדרטי 1/4-20 סוליה. ראה הוראות כיצד לטעון את החלוניות בפרופילים בדף האינטרנט בהערה של שלב 1.3. השתמשו בציפוי סיליקון מסחרי כדי לאטום את הצמתים בין הלוחות הפנימיים.
  6. השתמשו בשני פרופילים של 12 אינץ' ושני פרופילים של 14.75 אינץ' עם חריץ T כדי להרכיב את מכסה הכלוב כפי שמצוין באיור 1B. הרכיבו לוח פוליקרבונט AR בגודל 38.5 ס"מ x 26.5 ס"מ בתעלה הפנימית של הפרופילים כדי להשלים את המכסה.
  7. הרכיבו את 12 התמיכה בפרופיל המצלמה בניצב לצירים הארוכים של החלק העליון של הכלוב ומאובטחים באמצעות שני מעברי לייט בתוך סוגריים פינתיים (מסומנים 3 באיור 1B). השתמש בלוח שטוח ישר (מסומן 2) כתמיכה בהרכבה של מצלמת האינטרנט והרכיב אותו כפי שמוצג באיור 1B. חבר את המצלמה לתמיכה באמצעות בורג הרכבה של המצלמה.
  8. השתמש במכלול הימני הסטנדרטי של ציר הרמה מסדרה 10 כדי לחבר את המכסה לגוף תא העכבר (מסומן 1 באיור 1B).
  9. בנו את מעמד ה-UV עם ארבעה פרופילים עם חריצי T שנחתכו ל-40 אינץ', ארבעה פרופילים עם חריצי T שנחתכו ל-32 אינץ', וארבעה פרופילים עם חריצי T שנחתכו ל-10 אינץ', לפי איור 1C,D. הרכיבו יריעת מראה אקרילית בגודל 82.5 ס"מ x 26.5 ס"מ בפרופילים כדי לבנות את החלק התחתון של תא UV.
  10. השתמש ביריעות מראה אקריליות בגודל 82.5 ס"מ x 30.5 ס"מ ו- 26.5 ס"מ x 30.5 ס"מ כדי לבנות את קיר מעמד ה- UV.
  11. חברו את לוחות T שטוחים בעלי חמישה חורים מסדרה 10 (מסומנים 2 באיור 1 C), את לוחות L שטוחים בעלי חמישה חורים מסדרה 10 (מסומנים 3 באיור 1 C), ואת לוחות טי שטוחים בעלי חמישה חורים מסדרה 10 (מסומנים 1 באיור 1C) כדי לאבטח את מעמד ה-UV.
  12. הרכיבו את המצלמות התחתונות בפרופיל עם חריץ T שנחתך ל-32 אינץ' והתחברו לתחתית המעמד עם שני סוגריים פינתיים של מעבר לייט כפי שמוצג באיור 1D. השתמש בלוחות שטוחים ישרים כדי לחבר את מצלמות האינטרנט לפרופיל חריצי T.
  13. הרכיבו את מנורות ה-UV בפרופילים הפנימיים, הקדמיים והאחוריים, והתחברו ללוחות השטוחים הישרים כפי שמוצג באיור 1D.
  14. חבר את ארבע מצלמות האינטרנט ליציאות ה- USB של מחשב שבו פועלת תוכנת מעקב וידאו.

2. מגורי בעלי חיים לפני ניסויים

  1. עכברי ניסוי ביתיים, שגודלו במיוחד או הושגו מאתר חיצוני, בקבוצות של ארבעה. במידת האפשר, השתמשו בעכברים נקבות או זכרים תואמי גיל לניסויים אלה. אם בעלי חיים מתקבלים ממקור חיצוני, לאפשר להם להתאקלם לפחות 7 ימים לפני ביצוע הליכים ניסיוניים כלשהם.
  2. במהלך שהותם במתקן בעלי החיים, אכסנו את בעלי החיים בכלובים סטנדרטיים המכילים מצעים והעשרה (למשל, איגלו פלסטיק, גלגל, פיסת נייר לגריסה) והחזיקו אותם תחת מחזור יום / לילה של 12 שעות, עם גישה למים ולעכבר יבש צ'או אד ליביטום.

3. הקלטות RT-VSA במהלך שלבי האור והחושך של היום

הערה: הפרוטוקול שלהלן מתאר את השימוש ב-RT-VSA כדי להעריך את התנהגות ההתרוקנות של העכבר במהלך שלבי האור והחושך של היום. בעלי החיים מוחזקים במחזור אור של 12 שעות וחושך של 12 שעות עם זמן צייטגבר (ZT) = 0 בשעה 07:00 בבוקר. ההקלטות מתחילות בין 10:30 בבוקר ל-11:00 בבוקר (ZT = 3.5-4.0) עבור ניסויי הפאזה הקלה ובין השעות 18:00-18:30 (ZT = 11.0-11.5) עבור ניסויי הפאזה החשוכה. כאשר בעלי חיים נבדקים בשני התנאים, הניסויים מבוצעים בדרך כלל בשני ימים נפרדים, עם לפחות 5 ימים רצופים בין בדיקות האור והחושך. אין לבצע ניסויים בימים בהם מנקים את חדרי בעלי החיים או מחליפים את הכלובים, שכן אלה עלולים לגרום ללחצים המשפיעים על התנהגות ההתרוקנות. כל השלבים צריכים להתבצע בתנאים של לחץ מינימלי עבור העכברים.

  1. העבירו את חיות הניסוי ממקום מגוריהן לחדר הפרוצדורות שבו ממוקמים תאי ההקלטה RT-VSA.
  2. הכנת תא הקלטה RT-VSA
    1. הניחו פיסת נייר סינון (24.3 ס"מ x 36.3 ס"מ) בתחתית כל כלוב הקלטה RT-VSA. בהתאם לשעה ביום, השתמש בנייר סינון דק (ניסויי פאזה בהירה) או עבה (ניסויי פאזה כהה).
      הערה: נייר סינון עבה משמש בשלב הכהה הפעיל מכיוון שהוא עמיד יותר לגריסת נייר מסנן דק. מצלמות עליונות משמשות להמחשת כתמי שתן שהושקעו על נייר פילטר עבה במהלך השלב החשוך. לעומת זאת, בשלב התאורה נעשה שימוש במצלמות התחתונות מכיוון שתאורת הסביבה מונעת מהמצלמות העליונות לזהות כתמי שתן ששקעו על נייר הפילטר. במקרה זה, נעשה שימוש בנייר סינון דק. מצאנו כי המצלמות התחתונות אינן יעילות באיתור אירועי התרוקנות קטנים המושקעים על נייר פילטר עבה.
    2. מעל נייר הפילטר הניחו את הפריטים הבאים: איגלו פלסטיק (המאפשר מקום שינה), צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מ"ל למטרות העשרה, וכלי פלסטיק בגודל 60X15 מ"מ המכיל שתיים או שלוש חתיכות של צ'או יבש עכבר ו-14-16 גרם מים בצורת חבילת ג'ל (ג'ל מים שאינו מרטיב; איור 2).
      הערה: השימוש בצינורות מיקרו-צנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל למטרות העשרה היה ספציפי למארז ששימש במחקר זה.
    3. ברגע שתאי ההקלטה מוכנים, הניחו בעדינות את עכברי הניסוי בפנים על ידי הנחתם ברכות על נייר הסינון. יש לוודא שהעברת בעלי החיים מכלוב הדיור לכלובי ההקלטה מתרחשת במינימום לחץ.
    4. ברגע שכל חיות הניסוי נמצאות בתוך כלובי ההקלטה שלהן, כשהעפעפיים סגורים, כסו את החלק העליון של העפעפיים במשטח כחול סופג כדי למזער השתקפויות אור סביבתיות ישירות על משטח מכסה הפרספקס.
    5. הפעל את אורות ה- UV בחדר התחתון.
      הערה: לבעלי החיים אין מגע ישיר עם אור UV. האור העל-סגול המומלץ מפורט בסעיף החומרים.
  3. הקלטות RT-VSA
    1. כדי להקליט וידאו מהמצלמה העליונה והתחתונה, השתמש בתוכנת הקלטת מעקב וידאו, שניתן להגדיר להקליט ממצלמות אינטרנט מרובות או מצלמות רשת בו זמנית.
    2. עם פתיחת התוכנית, התחל הקלטה על ידי לחיצה על Command ו - R בחלון התוכנית. בצע הקלטות וידאו בקצב של פריים אחד לשנייה.
    3. מיד לאחר תחילת ההקלטות, צא מהחדר וסגר את הדלת בעדינות. ודא שהחדר נשאר שקט למשך כל תקופת הניסוי.
  4. סיום הקלטות RT-VSA
    1. חזור לחדר הפרוצדורות לאחר 7 שעות (ניסויי פאזה בהירה) או למחרת בבוקר (ניסויי פאזה חשוכה).
    2. עצור את ההקלטות על-ידי הקשה על Command ו - T. כבה את אורות ה- UV.
    3. לאחר הפסקת ההקלטה, התוכנה יוצרת באופן אוטומטי קובץ סרט (בפורמט .m4v) עבור כל מצלמה ושומרת אותו תחת שם המצלמה בתיקיית יעד שנבחרה בעבר. ודא שבתוך כל תיקיית מצלמה, הניסויים מאורגנים בתיקיות לפי תאריך.
    4. בכל תיקיית תאריך/ניסוי, ודא שיש קובץ .m4v אחד ואת כל קובצי .jpeg הבודדים המתאימים לכל אחת ממסגרות הסרט.
    5. הערה: ניתן להשתמש בקובצי .jpeg כדי לשחזר את הניסוי במקרה שקובצי סרטים נפגמים.
    6. צור תיקיה בשולחן העבודה עם השם והתאריך של הניסוי והעבר את כל הקבצים .m4v לתיקיה זו. במידת הצורך, מחק את קובצי .jpeg לאחר שמירת קובצי הסרט וגיבוים.
    7. הערה: עבור ניסויים בפאזה בהירה, התוכנה תפיק סרט אחד לכל מצלמה, ואילו עבור ניסויים בפאזה אפלה, היא תפיק שני סרטים עבור כל מצלמה. הסיבה לכך היא שקובץ .m4v חדש נוצר לאחר חצות כאשר התאריך משתנה.
    8. העתק את התיקיה המכילה את הסרטים לכונן הבזק לצורך ניתוח במחשב חיצוני. שלב זה עשוי להימשך מספר דקות וניתן לבצעו במקביל לשלבים 3.5.1 עד 3.5.3.
  5. ניקוי כלובי הקלטה והעברת עכברי ניסוי חזרה למקום מגוריהם
    1. הסירו את הפד הכחול המכסה את מכסי הכלובים. העבירו את בעלי החיים מכלובי ההקלטה לכלוב הדיור שלהם.
    2. הסר את האביזרים ומוצרי המזון בתאי ההקלטה (כלומר, איגלו פלסטיק, צינורות פלסטיק, צלחת עם משענת של צ'או וג'ל מים, ונייר סינון) והשלך אותם לפסולת מסוכנת ביולוגית.
    3. נקו את הכלובים באמצעות שואב אבק ידני, תוך הסרת כדורי צ'או וצואה הנמצאים בתחתית הכלוב. לאחר מכן, לרסס את הרצפה ואת הקירות הפנימיים של הכלוב עם 70% אתנול ולנקות את הפנים עם חתיכת בד רך. השאירו את מכסה הכלובים פתוח כדי לאפשר להם להתייבש באוויר.
    4. הניחו את כלוב הדיור עם בעלי החיים במיכל משני והעבירו את בעלי החיים חזרה למקום מגוריהם.

4. יצירת עקומות כיול

הערה: יש צורך בעקומת כיול כדי להמיר אזורים ריקים לנפחי שתן. אם מבצעים ניסויים במהלך שלבי האור והחושך של היום, יש ליצור שתי עקומות כיול, אחת לכל סוג נייר סינון המשמש (ניירות סינון דקים ועבים). עקומות כיול נוצרות בכפילות. כל העתק מופעל על נייר סינון הממוקם בתא הקלטה RT-VSA. בהתחשב בהרכבו המורכב, וברגישות UV, השתמש בשתן עכבר כדי לבצע את עקומות הכיול.

  1. איסוף שתן עכבר
    1. קח חתיכת סרט שקוף גמיש (10 ס"מ x 15 ס"מ) והנח אותו על ספסל.
    2. בחר עכבר בזנבו וקשקש אותו. יש לעסות בעדינות את הבטן התחתונה כדי לגרום למתן שתן. יש לאסוף שתן על פני יריעת הפלסטיק השקופה של הסרט.
    3. שחררו את בעל החיים בעדינות לתוך הכלוב שלו. באמצעות פיפטה, להעביר את השתן מפני השטח של הסרט השקוף אל צינור סטרילי 1.5 מ"ל מיקרו צנטריפוגה. חזור על התהליך עם עכברים מרובים עד ~ 10 מ"ל של שתן עכבר נאסף, אגרו את השתן ואחסנו ב -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: נדרש סך של ~10 מ"ל שתן עכבר כדי ליצור עקומות כיול כפולות עבור השלבים הבהירים והכהים. כדי להימנע מלחץ על עכברי ניסוי, אל תשתמש בעכברים שיהיו נתונים לניסויי RT-VSA לאיסוף שתן.
  2. הקלטות עקומת כיול
    1. הפשירו את השתן שנאסף בשלב 4.1 וערבבו אותו על ידי ערבול עדין במשך 10-15 שניות.
    2. הניחו פיסת נייר סינון דקה (24.3 ס"מ x 36.3 ס"מ) בכל אחד משני כלובי ההקלטה RT-VSA.
    3. פיפטה נפחי השתן הבאים (ב-μL) על כל אחד מניירות הסינון: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ו-750. כדי למנוע חפיפה נקודתית כתוצאה מדיפוזיה, הקצו את הכתמים במרחק מספיק זה מזה.
    4. סגרו את מכסה הכלובים וכסו אותם ברפידות.
    5. התחל להקליט על ידי לחיצה על Command ו - R, החלת אותם פרמטרי תוכנה המשמשים להקלטת הניסויים (שלב 3.3).
    6. רשום את עקומת הכיול למשך שעה אחת כדי לאפשר דיפוזיה מקסימלית של כתמי השתן. לחצו על Command ועל T כדי להפסיק את ההקלטה.
    7. צור תיקיה חדשה בשולחן העבודה, מקם בה את קבצי .m4v ולאחר מכן העבר את הנתונים לכונן הבזק לניתוח הבא.
    8. בצע הליך דומה ליצירת עקומות כפולות עם נייר סינון עבה. במקרה זה, הוסיפו שכבות נוספות של רפידות כדי להכהות את הפנים ולדמות תנאי פאזה חשוכים.
  3. ניתוח הקלטות עקומת הכיול
    1. פתח את קבצי .m4v בתוכנת נגן סרטים, והגדל את החלון כדי למלא את המסך. כדי לנתח את עקומות הכיול המבוצעות על נייר סינון עבה, השתמשו בקבצים שהתקבלו באמצעות המצלמות העליונות (איור 3A). כדי לנתח את עקומות הכיול המבוצעות על נייר סינון דק, השתמשו בקבצים שהתקבלו באמצעות המצלמות התחתונות (איור 3B).
    2. הפעל את קובץ .m4v, הזז את מחוון הזמן קדימה ואחורה כדי לקבל סקירה כללית של סרט עקומת הכיול המלא של שעה אחת.
    3. זהה את טווח הזמן שבו כתמי השתן הקטנים יותר (<25 μL) הם בעלי העוצמה הגדולה ביותר והתפשטו באופן מקסימלי. צלם צילום מסך בטווח זמן זה. תן שם לקובץ צילום המסך ושמור אותו כקובץ .png (איור 3A, לוח עליון).
      הערה: צילומי מסך מצולמים על-ידי הקשה על מקש F6. כדי להגדיר את F6 לרכישת צילום מסך, בחר: העדפות מערכת > קיצורי מקשים > וכתוב F6 בתיבה שנמצאת משמאל לאפשרות שמור תמונת מסך כקובץ .
    4. זהה את טווח הזמן שבו כתמי השתן הבינוניים והגדולים (>50 μL) יש שטח מקסימלי וצלם צילום מסך. ייתכן שחלק מכתמי השתן הקטנים יותר לא ייראו עד שכתמי השתן הגדולים יציגו דיפוזיה מקסימלית. תן שם לקובץ ושמור את צילום המסך כקובץ .png (איור 3A, לוח תחתון).
    5. פתח את תוכנת ImageJ (NIH) ולאחר מכן גרור ושחרר את סמל קובץ .png שהתקבל בשלב 4.3.3 כדי לפתוח את קובץ התמונה (איור 4A).
    6. בסרגל הכלים, בחר בסמל ' בחירות מצולע' ותחם את גבול נייר הסינון.
    7. לאחר מכן, בחרו ' נתח ' בשורת התפריטים, בחרו ' קבע מדידות ' מהתפריט המורחב, ומהחלון שמופיע בחרו ' אזור'. לחץ על אישור. זה מאפשר לקבל ערכים של שטח כאשר שלב 4.3.8 מבוצע.
    8. לאחר מכן, בחר נתח שוב משורת התפריטים ובחר מדידה מהאפשרויות המורחבות. חלון תוצאות מוקפץ ובו אזור עמודה המציג את ערכי האזור בפיקסל2 (איור 4, B–D).
    9. בחרו בסמל Freehand Selections מסרגל הכלים והשתמשו בו כדי לצייר קו מסביב להיקף של נקודת ריק בודדת. מדוד את האזור כמו בשלב 4.3.8. התוכנה מעדכנת את טבלת התוצאות כאשר מבוצעות מדידות חדשות. קבוצת המספרים החדשה מופיעה מתחת לקודמות. רשום את המספר שמופיע מתחת לאזור העמודות של חלון התוצאות עבור כל נקודה שנותחה (איור 4E-G).
    10. חזור על שלבים 4.3.5 עד 4.3.7 עבור כל אחד מהכתמים המשוכפלים.
    11. הגדר את השטח הכולל של נייר הסינון כ- 100% וחשב את אחוז השטח (% שטח) עבור כל נקודת שתן. נורמליזציה זו תתקן שגיאות שעלולות להתרחש כתוצאה מהבדלים בזום או במיקום המצלמות.
    12. צור טבלת XY חדשה בתוכנית גרפים והוסף את ערכי נפח השתן (ב- μL) בעמודה X ואת הערכים הכפולים של אזור % בעמודה Y.
    13. לאחר מכן, בחר ניתוח > ניתוח > ניתוח XY > רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה). בחלון הפרמטרים שמופיע, בחר Model > Polynomial > Second Order Polynomial (quadratic).
    14. לאחר מכן, מהכרטיסייה method, לחץ כדי לסמן את הבחירות הבאות: לפחות ריבועים רגרסיה, ללא שקלול, ושקול כל ערך Y משוכפל כנקודה בודדת.
    15. בכרטיסיה אילוץ, בחר עבור B0, סוג אילוץ > קבוע שווה ל וסוג 0 תחת העמודה ערך . לחץ על אישור.

5. ניתוח הקלטות עכברי הניסוי

  1. פתח קובץ סרט שנאסף בשלב האור (המצלמה התחתונה) או בשלב הכהה (המצלמה העליונה) לצורך ניתוח.
  2. הערך את איכות קובץ הסרט על-ידי הזזת גלילת הזמן קדימה ואחורה, כדי לוודא שנייר הסינון נשאר שלם (ללא קריעה או לעיסה) במהלך חלון הזמן של 6 שעות לניתוח. אם הנייר קרוע, אל תבצעו ניתוח נוסף, מאחר שייתכן שהעכבר השתין על הפלסטיק החשוף שלא ניתן לכמת (איור 5).
  3. כדי לנתח ניסויים שנאספו בשלבים בהירים או חשוכים, השתמש בפקודה הרץ קדימה או במחוון סרגל הזמן כדי לעבור לחלון הזמן הרצוי. פעילות ההתרוקנות בשלב האור נרשמת בין השעות 11:00-17:00 (ZT = 4.0-10.0) ובמהלך השלב החשוך בין חצות ל-06:00 בבוקר (ZT = 17.0-23.0).
  4. הפעל את הסרט במצב הרצה קדימה על-ידי לחיצה על סמל >> (או גלול ידנית לאורך הסרט), בחיפוש אחר ראיות לכך שהעכבר מתבטל. הדרך הקלה ביותר לדעת שזה קורה היא לחפש את המראה הפתאומי של כתמים בהירים של שתן על נייר המסנן. אינדיקטור נוסף הוא לחפש שינויים התנהגותיים הכוללים תנועה לפינות הכלוב ופרק זמן קצר של חוסר פעילות כאשר העכבר מתרוקן.
    הערה: ככל שאדם משתפר בזיהוי חללים, הוא יכול להגביר את מהירות הגלילה או ההעברה המהירה. עם זאת, בעכברים עם דלקת חיידקית וכימית של שלפוחית השתן, שיש להם מספר גדול מאוד של חללים קטנים 4,34, אפשר לפספס אירועי התרוקנות אם מתקדמים מהר מדי לאורך הסרט.
  5. רשום את הזמן שבו מתרחש כל ריק. כמוסכמה, זמן הריק נרשם בסימן הראשון לזיהוי השתן (איור 6A,B).
  6. כדי לבצע מדידות של החלל, השתמש תחילה בפס הגלילה כדי לנוע קדימה (או אחורה) בזמן, וחפש את נקודת הזמן שבה התרחשה דיפוזיה מקסימלית של נקודת השתן. השהה את הסרט בשלב זה וצלם צילום מסך כמתואר בשלב 4.3.3. מקם את חץ עכבר המחשב בנקודה הנמצאת בניתוח, כך שנקודת העניין תסומן בצילום המסך (איור 6C,D).
  7. תן שם לקובץ צילום המסך באמצעות מספרים מתאמים כדי להסביר את סדר ההופעה בסרט.
  8. המשך לנתח את הקובץ, וחזור על שלבים 5.5 ו- 5.7 עבור כל נקודה ריקה בסרט. לאחר שכל כתמי הריק נותחו, מדוד את השטח הכולל של נייר הסינון על ידי לכידת צילום מסך ושימוש בשלבים המתוארים ב- 4.3.6.
  9. חשב את שטח ה- % של כל אחד מכתמי השתן כמתואר בשלב 4.3.9. המר את הערכים של שטח % לנפח שתן (μL) עבור כל נקודה ריקה באמצעות עקומות הכיול שנוצרו בשלב 4 ופונקציית האינטרפולציה בתוכנת הגרפים.
    1. בתוכנת הגרפים, פתח את טבלת XY המכילה את נתוני עקומת הכיול והוסף את ערכי השטח % בעמודה Y מתחת לערך האחרון של עקומת הכיול (איור 7A).
    2. לחץ על הכרטיסייה טבלת תוצאות , ותחת הכרטיסייה דגם, לחץ כדי לבחור אינטרפולציה של לא ידועים מהעקומה הרגילה ולחץ על אישור. טאב בשם ערכי ממוצע X אינטרפולציה מופיע ליד כרטיסיית טבלת התוצאות. כרטיסייה זו מכילה טבלה עם ערכי אינטרפולציה המתאימים לנפח השתן ב- μL עבור כל נקודה ריקה. (איור 7A,B).
  10. חזור על שלבים 5.1 עד 5.9 כדי לנתח את כל עכברי הניסוי.
  11. צור קובץ חוברת עבודה המכיל את הנתונים שהתקבלו משלבים 5.5 עד 5.10, באמצעות גיליון אלקטרוני אחד לכל עכבר (איור 7C). צור קובץ אחד עבור ניסויי הפאזה הבהירה וקובץ אחר עבור ניסויי הפאזה הכהה. קובצי אב אלה מכילים את כל הנתונים הגולמיים והחישובים הדרושים המשמשים בניתוחים נוספים.

6. ניתוח דפוס השתנה של עכברי ניסוי

  1. צור פרופילי נקודות ריק ראשוניות ומשניות (איור 8, A,B ואיור 9).
    הערה: על פי מחקרי התפלגות תדרים 23, כתמים ריקים שהם ≥20 μL מייצגים בדרך כלל >95% מכלל הנפח המבוטל ונחשבים לכתמי ריק ראשוניים (PVS)8,23,35. כתמי ריק בגודל ≤20 μL נחשבים לכתמי ריק משניים או קטנים (SVS). אפליה בין PVS ו- SVS הוכחה כגישה שימושית לאפיון פנוטיפים מתרוקנים. מספר גבוה של SVS מצביע על תפקוד לקוי של התרוקנות35.
    1. מקובץ האב הכולל נתוני ספוט מתרוקנים בעלי עניין (פאזה בהירה או פאזה כהה), סווגו את הכתמים לפי נפחם כ-PVS כאשר נפחם הוא ≥20 μL, או SVS כאשר נפחם הוא <20 μL.
    2. ספור את המספר וחשב את אמצעי האחסון הממוצע המבוטל ואת הנפח הכולל עבור PVS. ספור את המספר וחשב את אמצעי האחסון הכולל עבור SVS.
    3. צור סרגל גרף המשווה את הבקרה לעכברים המטופלים עבור כל אחד מהפרמטרים המחושבים: מספר PVSs, נפח מבוטל של PVSs, נפח כולל של PVSs, מספר SVSs, נפח כולל של SVSs.
  2. אופציונלי: צור תרשים נפח מבוטל מצטבר (פונקציית גרם מדרגות) כדי להציג התנהגות התרוקנות לאורך זמן (איור 10 ואיור 11).
    1. פתח את קובץ הבסיס של חוברת העבודה והמר את זמן הביטול, המתבטא בשעות, דקות ושניות, לצורה העשרונית. חשב את נפח השתן המצטבר (ב- μL) עבור כל נקודת זמן.
    2. צור טבלת XY בתוכנת הגרפים עם זמן בצורה עשרונית בעמודה X ונפחי שתן מצטברים בעמודה Y. העתק את נתוני השעה ונפח השתן לטבלה. הוסף נקודות נתונים (0; 0) ו- (6; ערך מרבי). נקודות אלה נחוצות להשלמת הקווים האופקיים של העלילה בתחילת הניסוי (זמן: 0 שעות) כאשר הנפח המבוטל הוא אפס (0; 0), ובסוף הניסוי (זמן: 6 שעות) כאשר הערך המצטבר של השתן המבוטל שווה לערך המתקבל עבור אירוע ההתרוקנות האחרון (6; ערך מקסימלי).
    3. לחץ פעמיים על הגרף; החלון 'עיצוב תרשים' אמור להופיע. בחרו בכרטיסייה ' מראה ', לחצו לביטול הבחירה בלחצן 'הצג סמלים' ולחצו לבחירת ' הצג קו מקשר/עקומה'. לחץ על האפשרות סגנון ובחר הישרדות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התנהגות התרוקנות של עכברי נוקאאוט Piezo1/2 אורותל

במהלך שלב האחסון של מחזור המיקטוריציה, משערים כי האורותליום חש את המתח המופעל על ידי השתן המצטבר בשלפוחית השתן ולהמיר גירוי מכני זה לתגובות תאיות כגון שחרור ATPסרוסלי 1,3. הראינו בעבר שתעלות PIEZO1 ו-PIEZO2 המופעלות מכנית מבוטאות באורותל 3,36 של העכבר. כדי לקבוע אם תעלות PIEZO של דרכי השתן חשובות להתנהג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שילוב של ניטור וידאו הוא שינוי חסכוני המציג מספר יתרונות על פני VSA קלאסי. ב- VSA הקלאסי, המשמש בדרך כלל כבדיקת נקודת קצה, קשה להבחין בין נקודות ריק חופפות. זה לא עניין של מה בכך, שכן עכברים נוטים להשתין מספר פעמים באותו אזור כאשר הבדיקה ממושכת למספר שעות, בדרך כלל בפינות הכלוב שלהם. לפיכך, היתרון הראשון של RT-VSA הוא שהחוקר יכול לזהות בקלות כתמים בודדים שהופקדו באופן חלקי או מלא זה על גבי זה. זה מודגם היטב בניסוי שמוצג באיור 12. במקרה זה, הקלטת וידאו מאשרת כי העכבר בוטל שלוש פעמים באותה פינ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי R01DK119183 מענק NIH (ל- G.A. ו- MDC), פרס פרויקט פיילוט באמצעות P30DK079307 (ל- M.G.D.), פרס פיתוח קריירה של האגודה האמריקאית לאורולוגיה ומענק קרן וינטרס (ל- N.M.), ועל ידי ליבות הדמיית כליות של פיזיולוגיה של התא ואורגניזמים מודל של מרכז פיטסבורג לחקר הכליות (P30DK079307).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.00 אינץ' X 1.00 אינץ' פרופיל מחורץ T - ארבעה חריצי T פתוחים –   חתוך ל-10 אינץ'80/201010כמות: 20
1.00 אינץ' X 1.00 אינץ' פרופיל מחורץ T - ארבעה חריצי T פתוחים –   חתוך ל-12 אינץ'80/201010כמות: 6
1.00 אינץ' X 1.00 אינץ' פרופיל מחורץ T - ארבעה חריצי T פתוחים –   חתוך ל-40 אינץ'80/201010כמות: 4
1.00 אינץ' X 1.00 אינץ' פרופיל מחורץ T - ארבעה חריצי T פתוחים – חתוך ל-14.75 אינץ'80/201010כמות: 12
1.00 אינץ' X 1.00 אינץ' פרופיל מחורץ T - ארבעה חריצי T פתוחים – חתוך ל 32 אינץ '80/201010כמות: 5
1/4-20 אגוז T כלכלה כפול 80/203280כמות: 16
1/4-20 אגוז T-Economy משולש 80/203287כמות: 18
10 & 25 סדרה 2 חור - 18 מ"מ תושבת פינתית פנימית מחורצת עם תמיכה כפולה80/2014061כמות: 6
10 סדרה 3 חורים - צלחת שטוחה ישרה80/204118כמות: 8
10 סדרה 5 חורים - צלחת שטוחה "L"80/204081כמות: 8
10 סדרה 5 חורים - צלחת שטוחה "T"80/204080כמות: 8
10 סדרה 5 חורים - צלחת שטוחה טי80/204140כמות: 2
ציר הרמה סטנדרטי מסדרה 10 - מכלול יד ימין80/202064כמות: 2
10 עד 15 סדרה 2 חורים - מעבר לייט תושבת פינתיתפנימית 80/204509כמות: 6
נורות צינור UV באורך 24 אינץ'ADJ Products LLCT8-F20BLB24כמות: 2
20W נורה– 24 אינץ' אורך גל: 365 ננומטר
גיליון מראה אקריליפלסטיקכמות: 1
82.5 ס"מ x 26.5 ס"מ
יריעת מראה אקריליתפלסטיקכמות: 2
26.5 ס"מ x 30.5 ס"מ
יריעת מראה אקריליתפלסטיקכמות: 2
82.5 ס"מ x 30.5 ס"מ
פוליקרבונט AR (עמידות בפני UV)80/2065-2641כמות: 2
4.5 מ"מ עובי, שקוף, 38.5 ס"מ x 26.5 ס"מ
פוליקרבונט AR (עמידות בפני UV)80/2065-2641כמות: 4
4.5 מ"מ עובי, שקוף, 38.5 ס"מ x 21.5 ס"מ
פוליקרבונט AR (עמידות בפני UV)80/2065-2641כמות: 4
4.5 מ"מ עובי, שקוף, 26.5 ס"מ x 21.5 ס"מ
פוליקרבונט AR (עמידות בפני UV)80/2065-2641כמות: 4
4.5 מ"מ עובי, שקוף 37.5 ס"מ x 23.9 ס"מ
פוליקרבונט AR (עמידות בפני UV)80/2065-2641כמות: 4
4.5 מ"מ עובי, שקוף, 24.4 ס"מ x 23.9 ס"מ
נייר כרומטוגרפיה (נייר דק)  Thermo Fisher Scientific57144
נייר סופג קוסמוס (נייר עבה)Blick Art Materials10422-1005
ExcelMicrosoft Corporation
GraphPad PrismGraphPad תוכנהגרסה 9.4.0תוכנת גרפים וסטטיסטיקה
ImageJ FIJINIH
ParafilmMerckסרט שקוף
Quick Time Player 10.5 תוכנה נגן מולטימדיהשל אפל
מרגלאבטחה בן תוכנהתוכנת מעקב וידאו מערכת
סטנדרט קצה אטב, 1/4-2080/203381כמות: 80
UV משדר אקריליקSpartechPolycast Solacryl SUVTכמות: 2
38.5 ס"מ x 26.5 ס"מ 
ג'ל מים: הידרוג'לClearH2O   70-01-5022(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
מצלמת אינטרנטLogitechC930eכמות: 4
מקצועי מקצועי מקצועי

מקורות

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621(2020).
  2. de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327(2015).
  3. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
  4. Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1(2022).
  5. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070(2015).
  6. Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
  7. Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509(2019).
  8. Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160(2020).
  9. Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
  10. de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111(2022).
  11. Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230(2013).
  12. Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
  13. Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314(2006).
  14. Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450(2007).
  15. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1(2014).
  16. Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion. International Journal of Urology. 21, 79(2014).
  17. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89(2014).
  18. Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26(2014).
  19. Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128(2010).
  20. Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939(1973).
  21. Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548(2008).
  22. Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
  23. Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
  24. Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31(2021).
  25. Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
  26. Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653(2001).
  27. Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
  28. Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101(2013).
  29. Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170(2019).
  30. Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449(2020).
  31. Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
  32. Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73(2016).
  33. Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
  34. Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
  35. Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
  36. Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303(2019).
  37. Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
  38. Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
  39. Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
  40. Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

VSA בזמן אמתהתנהגות השתנהמודלים של עכבריםניתוח כתמי שתןהשתנה רצוניניטור וידאותפקוד השלפוחיתהסוגר השופכניטיפול בציקלופוספמיד
בדיקת ספוט ריק בזמן אמת
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.