בדיקת ספוט ריק בזמן אמת

Summary

מאמר זה מתאר שיטה חדשה לחקר התנהגות התרוקנות עכבר על-ידי שילוב ניטור וידאו בבדיקת נקודות הריק הקונבנציונלית. גישה זו מספקת מידע זמני, מרחבי ונפחי על אירועי ההתרוקנות ופרטים על התנהגות עכברים במהלך שלבי האור והחושך של היום.

Abstract

התנהגות התרוקנות נורמלית היא תוצאה של תפקוד מתואם של שלפוחית השתן, השופכה וסוגרי השופכה תחת שליטה נכונה של מערכת העצבים. כדי לחקור התנהגות של התרוקנות מרצון במודלים של עכברים, חוקרים פיתחו את בדיקת נקודות הריק (VSA), שיטה המודדת את מספר ושטח כתמי השתן שהושקעו על נייר סינון המצפה את רצפת הכלוב של בעל חיים. למרות שמבחינה טכנית היא פשוטה וזולה, לבדיקה זו יש מגבלות כאשר משתמשים בה כבדיקת נקודת קצה, כולל חוסר רזולוציה זמנית של אירועי התרוקנות וקשיים בכימות כתמי שתן חופפים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו VSA מנוטר וידאו, שאנו מכנים VSA בזמן אמת (RT-VSA), ואשר מאפשר לנו לקבוע את תדירות ההתרוקנות, להעריך את הנפח המבוטל ואת דפוסי ההתרוקנות, ולבצע מדידות על פני חלונות זמן של 6 שעות הן בשלב החשוך והן בשלב האור של היום. השיטה המתוארת בדו"ח זה יכולה להיות מיושמת במגוון רחב של מחקרים מבוססי עכברים הבוחנים את ההיבטים הפיזיולוגיים והנוירו-התנהגותיים של מיקוריטציה מרצון במצבי בריאות ומחלות.

Introduction

אחסון השתן והמיקטוריציה מתואמים על ידי מעגל מרכזי (מערכת העצבים המרכזית) המקבל מידע על מצב מילוי שלפוחית השתן דרך עצבי האגן וההיפוקיבה. האורותל, האפיתל המרפד את דרכי השתן מאגן הכליה ועד לשופכה הפרוקסימלית, יוצר מחסום הדוק בפני תוצרי הפסולת המטבולית והפתוגנים הנמצאים בשתן. זהו מרכיב אינטגרלי של רשת חושים, אשר חשה ומתקשרת את מצב המילוי של שלפוחית השתן לרקמות הבסיסיות^{ולעצבים 1,2}. הפרעה במחסום דרכי השתן, או שינויים במסלולי המכנוטרנסדוקציה של דרכי השתן, עלולה להוביל לתפקוד לקוי של התרוקנות יחד עם תסמינים בדרכי השתן התחתונות כגון תדירות, דחיפות, נוקטוריה ובריחת שתן 3,4,5,6,7.

Protocol

Urothelial Piezo1/2 עכברי נוקאאוט כפול (Pz1/2-KO , גנוטיפ: Piezo1 fl^/fl; Piezo2 fl^/fl; Upk2^CRE+/-) ובקרות (Pz1/2-C, גנוטיפ: Piezo1 fl^/fl; Piezo2 fl^/fl; Upk2^CRE-/-) נוצרו בתוך החברה מזני הורים שהתקבלו ממעבדות Jax (זן Piezo1 fl^/fl # 029213; זן Piezo2 fl^/fl # 027720; Upk2^CRE+/- זן # 029281). בניסויים נעשה שימוש הן בעכברים נקבות (בנות 1.5-3 חודשים והן במשקל 17-20 גרם) וזכרים (בני 2-4 חודשים ו-23-29 גרם במשקל). עבור ניסויים cyclophosphamide-נגרמת דלקת שלפוחית השתן, נקבות בר C57Bl / 6J (3 חודשים ו ~ 20 גרם במשקל) שימשו (מעב....

Results

התנהגות התרוקנות של עכברי נוקאאוט Piezo1/2 אורותל

במהלך שלב האחסון של מחזור המיקטוריציה, משערים כי האורותליום חש את המתח המופעל על ידי השתן המצטבר בשלפוחית השתן ולהמיר גירוי מכני זה לתגובות תאיות כגון שחרור ATP^{סרוסלי 1,3}. הראינו בעבר שתעלות PIEZO1 ו-PIEZO2 המופעלות מכנית מבוטאות באורותל ^3,36 של העכבר. כדי לקבוע אם תעלות PIEZO של דרכי השתן חשובות להתנהג.......

Discussion

שילוב של ניטור וידאו הוא שינוי חסכוני המציג מספר יתרונות על פני VSA קלאסי. ב- VSA הקלאסי, המשמש בדרך כלל כבדיקת נקודת קצה, קשה להבחין בין נקודות ריק חופפות. זה לא עניין של מה בכך, שכן עכברים נוטים להשתין מספר פעמים באותו אזור כאשר הבדיקה ממושכת למספר שעות, בדרך כלל בפינות הכלוב שלהם. לפיכך, היתרון הראשון של RT-VSA הוא שהחוקר יכול לזהות בקלות כתמים בודדים שהופקדו באופן חלקי או מלא זה על גבי זה. זה מודגם היטב בניסוי שמוצג באיור 12. במקרה זה, הקלטת וידאו מאשרת כי העכבר בוטל שלוש פעמים באותה פינ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.00 אינץ' X 1.00 אינץ' פרופיל מחורץ T - ארבעה חריצי T פתוחים –   חתוך ל-10 אינץ'	80/20	1010	כמות: 20
1.00 אינץ' X 1.00 אינץ' פרופיל מחורץ T - ארבעה חריצי T פתוחים –   חתוך ל-12 אינץ'	80/20	1010	כמות: 6
1.00 אינץ' X 1.00 אינץ' פרופיל מחורץ T - ארבעה חריצי T פתוחים –   חתוך ל-40 אינץ'	80/20	1010	כמות: 4
1.00 אינץ' X 1.00 אינץ' פרופיל מחורץ T - ארבעה חריצי T פתוחים – חתוך ל-14.75 אינץ'	80/20	1010	כמות: 12
1.00 אינץ' X 1.00 אינץ' פרופיל מחורץ T - ארבעה חריצי T פתוחים – חתוך ל 32 אינץ '	80/20	1010	כמות: 5
1/4-20 אגוז T כלכלה כפול 80	/20	3280	כמות: 16
1/4-20 אגוז T-Economy משולש 80	/20	3287	כמות: 18
10 & 25 סדרה 2 חור - 18 מ"מ תושבת פינתית פנימית מחורצת עם תמיכה כפולה	80/20	14061	כמות: 6
10 סדרה 3 חורים - צלחת שטוחה ישרה	80/20	4118	כמות: 8
10 סדרה 5 חורים - צלחת שטוחה "L"	80/20	4081	כמות: 8
10 סדרה 5 חורים - צלחת שטוחה "T"	80/20	4080	כמות: 8
10 סדרה 5 חורים - צלחת שטוחה טי	80/20	4140	כמות: 2
ציר הרמה סטנדרטי מסדרה 10 - מכלול יד ימין	80/20	2064	כמות: 2
10 עד 15 סדרה 2 חורים - מעבר לייט תושבת פינתית	פנימית 80/20	4509	כמות: 6
נורות צינור UV באורך 24 אינץ'	ADJ Products LLC	T8-F20BLB24	כמות: 2 20W נורה– 24 אינץ' אורך גל: 365 ננומטר
גיליון מראה אקרילי	פלסטיק		כמות: 1 82.5 ס"מ x 26.5 ס"מ
יריעת מראה אקרילית	פלסטיק		כמות: 2 26.5 ס"מ x 30.5 ס"מ
יריעת מראה אקרילית	פלסטיק		כמות: 2 82.5 ס"מ x 30.5 ס"מ
פוליקרבונט AR (עמידות בפני UV)	80/20	65-2641	כמות: 2 4.5 מ"מ עובי, שקוף, 38.5 ס"מ x 26.5 ס"מ
פוליקרבונט AR (עמידות בפני UV)	80/20	65-2641	כמות: 4 4.5 מ"מ עובי, שקוף, 38.5 ס"מ x 21.5 ס"מ
פוליקרבונט AR (עמידות בפני UV)	80/20	65-2641	כמות: 4 4.5 מ"מ עובי, שקוף, 26.5 ס"מ x 21.5 ס"מ
פוליקרבונט AR (עמידות בפני UV)	80/20	65-2641	כמות: 4 4.5 מ"מ עובי, שקוף 37.5 ס"מ x 23.9 ס"מ
פוליקרבונט AR (עמידות בפני UV)	80/20	65-2641	כמות: 4 4.5 מ"מ עובי, שקוף, 24.4 ס"מ x 23.9 ס"מ
נייר כרומטוגרפיה (נייר דק)	Thermo Fisher Scientific	57144
נייר סופג קוסמוס (נייר עבה)	Blick Art Materials	10422-1005
Excel	Microsoft Corporation
GraphPad Prism	GraphPad תוכנה	גרסה 9.4.0	תוכנת גרפים וסטטיסטיקה
ImageJ FIJI	NIH
Parafilm	Merck		סרט שקוף
Quick Time Player 10.5 תוכנה	נגן מולטימדיה	של אפל
מרגל	אבטחה בן תוכנה		תוכנת מעקב וידאו מערכת
סטנדרט קצה אטב, 1/4-20	80/20	3381	כמות: 80
UV משדר אקריליק	Spartech	Polycast Solacryl SUVT	כמות: 2 38.5 ס"מ x 26.5 ס"מ
ג'ל מים: הידרוג'ל	ClearH2O	70-01-5022	(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
מצלמת אינטרנט	Logitech	C930e	כמות: 4