מאמר שיטה

עלון חדשני המודפס בתלת-ממד ונועד לאפשר תרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות פשוטות

DOI:

10.3791/64655

⸱

6 בינואר 2023

 ,  ,  , 
1Laboratoire de Biochimie Médicale et Biologie Moléculaire, Université de Reims Champagne-Ardenne, 2UMR CNRS 7369, Matrice Extracellulaire et Dynamique Cellulaire-MEDyC, Université de Reims Champagne-Ardenne Reims, 3BASF Beauty Care Solutions, 4Service Biochimie-Pharmacologie-Toxicologie, Centre Hospitalier Universitaire (CHU) de Reims

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה, עלון מודפס תלת-ממדי שעוצב לאחרונה מוצג כמודל של תרבית משותפת ומאומת באמצעות המחקר של התקשורת הבין-תאית הפרקרינית בין תאי אנדותל וקרטינוציטים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניתוחים הקלאסיים של תקשורת עקיפה בין סוגי תאים שונים מחייבים שימוש במדיה מותנית. יתר על כן, הייצור של מדיה מותנית נשאר זמן רב רחוק תנאים פיזיולוגיים פתולוגיים. למרות שכמה מודלים של תרבית משותפת זמינים מסחרית, הם נשארים מוגבלים לבדיקות ספציפיות והם מיועדים בעיקר לשני סוגים של תאים.

כאן, תוספות מודפסות 3D משמשים כי הם תואמים בדיקות פונקציונליות רבות. התוספת מאפשרת הפרדה של באר אחת של צלחת 6 בארות לארבעה תאים. ניתן להגדיר מגוון רחב של שילובים. יתר על כן, חלונות מתוכננים בכל קיר של התאים כך שתקשורת בין-תאית פוטנציאלית בין כל תא אפשרית במדיום התרבות באופן תלוי נפח. לדוגמה, תקשורת בין-תאית פרקרינית יכולה להיחקר בין ארבעה סוגי תאים בחד-שכבתיים, בתלת-ממד (ספרואידים), או על ידי שילוב של שניהם. בנוסף, ניתן לזרוע תערובת של סוגי תאים שונים באותו תא בפורמט דו-ממדי או תלת-ממדי (אורגנואידים). היעדר תחתית בתוספות המודפסות בתלת-ממד מאפשר את תנאי התרבית הרגילים על הלוח, ציפוי אפשרי על הלוח המכיל את העלון, והדמיה ישירה במיקרוסקופ אופטי. התאים המרובים מאפשרים לאסוף סוגי תאים שונים באופן עצמאי או להשתמש, בכל תא, בריאגנטים שונים למיצוי RNA או חלבונים. במחקר זה, ניתנת מתודולוגיה מפורטת לשימוש בעלון החדש המודפס בתלת-ממד כמערכת תרבות משותפת. כדי להדגים מספר יכולות של מודל גמיש ופשוט זה, בדיקות פונקציונליות שפורסמו בעבר של תקשורת תאית בוצעו בתוספות החדשות שהודפסו בתלת-ממד והודגמו כניתנות לשחזור. התוספות שהודפסו בתלת-ממד ותרבית התאים הקונבנציונלית באמצעות מדיה מותנית הובילו לתוצאות דומות. לסיכום, העלון המודפס בתלת-ממד הוא מכשיר פשוט שניתן להתאים לדגמים רבים של תרביות משותפות עם סוגי תאים דבקים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo, תאים מתקשרים זה עם זה באופן ישיר (מגע עם התא) או בעקיפין (על ידי הפרשת מולקולות). כדי לחקור תקשורת תאים, ניתן לפתח מודלים שונים של תרביות משותפות, כגון תרבית משותפת ישירה (סוגי התאים השונים נמצאים באינטראקציה ישירה באותה באר) ותרבית משותפת ממודרת (סוגי התאים השונים נמצאים באינטראקציה עקיפה בתאים שונים של מערכת תרבית)1. יתר על כן, מדיה מותנית יכולה לשמש למערכות תרבית משותפת, שבהן האינטראקציה העקיפה מתאפשרת על ידי מולקולות מופרשות הכלולות במדיה המותנית של סוג תא משפיע המועברות לתא מגיבמסוג 1.

במקרה של מחקרי תקשורת תאים פרקרינית, מערכות תרבית משותפת עקיפות מספקות מודלים המשקפים באופן חזק אינטראקציות תאים in vivo. מערכות תרבות משותפת עקיפה פותחו ומוסחרו, ומאפשרות הקמת מודלים עקיפים של תרבות משותפת 2,3. למרבה הצער, רוב מערכות התרבות המשותפת העקיפות מספקות רק שני תאים. מערכות תרבות משותפת עקיפות אחרות מספקות תאים מרובים, אך הם פחות ניתנים להרחבה בהשוואה למערכת המדווחת בכתב היד הנוכחי. חלקם אינם מאפשרים הדמיה קלאסית תחת מיקרוסקופ, והם מציגים לעתים קרובות שיטות יישום ספציפיות. במספר מחקרים, התקשורת הפרקרינית בין סוגי תאים שונים נבדקת על ידי מודל המדיה המותנית 4,5,6,7. זוהי דרך חקירה קלה יותר בהשוואה למערכות עקיפות של תרבות משותפת מכיוון שהיא אינה מחייבת שיטות או חומרים ספציפיים כדי לבסס1. מצד שני, הכנת מדיה מותנית גוזלת זמן ומספקת מידע רק על איתות סלולרי חד-כיווני (משפיע למגיב)1.

במאמר זה מוצעת דרך חדשה ופשוטה לחקור תקשורת תאית. מאפשר שילוב של מספר סוגי תאים באינטראקציה ישירה או עקיפה ובפורמטים דו-ממדיים או תלת-ממדיים, התוספות המודפסות מציגות יתרונות רבים להגדרת מודלים של תרבות משותפת בקלות. התוספת המודפסת בתלת-ממד, המותאמת להצבה בבארות של לוחות 6 בארות, היא מעגלית ומאפשרת הפרדה של הבאר לארבעה תאים (שני תאים גדולים ושני תאים קטנים; איור 1A). התוספות המודפסות בתלת-ממד מאופיינות בהיעדר תחתית. לפיכך, התאים נמצאים במגע ישיר עם הצלחת שעליה ממוקם העלון. בנוסף, ניתן לצפות כל תא בנפרד מהאחרים. יתר על כן, ניתן לעקוב בקלות אחר התנהגות התא תחת מיקרוסקופים אופטיים. נוכחותם של חלונות תקשורת בכל קיר של הכנס מאפשרת תוספת, בזמן אופטימלי, של מדיום משותף לביצוע ניסויים שונים של תרבות משותפת. שילובים רבים של תרביות משותפות יכולים להתבצע כדי לחקור תקשורת ישירה ו / או עקיפה בין מספר סוגי תאים. לדוגמה, ניתן לתכנן מודל של תרבית משותפת עקיפה בין ארבעה סוגי תאים שונים בחד-שכבה ו/או בתלת-ממד (ספרואידים). שילוב של מודלים ישירים ועקיפים של תרביות משותפות יכול להתבצע גם על ידי ערבוב סוגי תאים שונים באותו תא. ההשפעה של מבנים מורכבים (אורגנואידים, צמחי רקמות וכו ') על סוגי תאים שונים יכולה להיות דוגמה נוספת למודלים שניתן ליצור. יתר על כן, התוספות המודפסות בתלת-ממד תואמות לבדיקות פונקציונליות של ביולוגיה של התא (התפשטות, הגירה, היווצרות פסאודו-צינורות, התמיינות וכו ') ולבדיקות ביוכימיות (מיצוי DNA, RNA, חלבון, שומנים וכו '). לבסוף, התוספות המודפסות בתלת-ממד מספקות מגוון רחב של סכמות ניסיוניות של מודלים של תרבות משותפת עם אפשרות לשלב בו זמנית בדיקות שונות באותו ניסוי בתאים השונים.

חלק מהיכולות של התוספות המודפסות בתלת-ממד מוצגות כדי לאמת אותן כמודל מהיר וקל לשימוש של תרבות משותפת. בהשוואה למחקר שפורסם בעבר שנערך על תקשורת תאים פרקרינית, הודגמה היכולת של התוספות המודפסות בתלת-ממד להיות מודל תרבית משותפת בעל ערך. כדי להעריך נקודה זו, הושוותה ויסות התרבות תאי אנדותל ונדידתם על ידי קרטינוציטים בין מערכת ההחדרה המודפסת בתלת-ממד לבין המערכת הקלאסית באמצעות מדיה מותנית. התוספות המודפסות בתלת-ממד מאפשרות קבלת תוצאות דומות במהירות בהשוואה למערכת הקונבנציונלית המשתמשת במדיה מותנית. ואכן, התוספות המודפסות בתלת-ממד מספקות מודל חזק לחקר אינטראקציות תאים בשני הכיוונים ללא צורך לייצר מדיה מותנית ועם אפשרות לבצע במקביל את מבחני ההתרבות והנדידה באותו ניסוי.

לסיכום, במאמר זה, מוצע מודל חדש ומוכן לשימוש לחקר תקשורת תאית. תואמות לכל סוגי התאים הדבקים, התוספות המודפסות בתלת-ממד מאפשרות לבצע שילובים רבים של תרביות משותפות שמטרתן להיות קרובות יותר לתנאי in vivo .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: התוספות התלת-ממדיות (איור 1A) נרכשות באופן מסחרי ומודפסות באמצעות שרף פוטופולימרי שתואם ביולוגית לתרביות תאים ולאוטוקלאבינג (ראו טבלת חומרים). בחלק זה מתואר פרוטוקול מפורט לביסוס מודל התרבות המשותפת באמצעות תוספות (ראו איור 1B). כמה דוגמאות של יישומים מסופקים גם.

1. מיקום התוספת המעוקרת בצלחות 6 בארות

  1. ערבבו את שני הרכיבים המסופקים בערכה (ראו טבלת חומרים), סיליקון מזון (מגיב A) וזרז (מגיב B), ביחס של 10:1 (v/v) בהתאם להוראות היצרן. (איור 1Ba). השתמש במרית מעוקרת אתנול 70% כדי לערבב את שני המרכיבים.
    הערה: נפח תערובת הסיליקון שיש להכין תלוי במספר התוספות שיש לתקן. עודף של זרז יכול לגרום לתערובת הסיליקון להתמצק מהר מדי.
  2. מרחו את התוספות על תערובת הסיליקון עם פינצטה כך שהתערובת תפוזר בצורה הומוגנית בקצה התחתון של התוספות (איור 1Bb). הכניסו את התוספות לבארות של צלחת בעלת 6 בארות והפעילו לחץ עדין על התוספות כדי להבטיח שהתוספות נמצאות במגע הדוק עם הצלחת כדי למנוע דליפה של מדיום תרבית התאים (איור 1Bc).
  3. הניחו את הצלחת בטמפרטורה של 37°C כדי לתמוך בתהליך ההתמצקות של הסיליקון למשך שעה אחת.
    הערה: זמן ההתמצקות תלוי בכמות הזרז שנוסף.
  4. לאחר המיצוק, לעקר את הצלחות עם תוספות על ידי טבילתם באמבט אתנול 70% במשך 30 דקות עד 1 שעות.
  5. יש להשליך את האלכוהול על ידי פיפטינג ולתת לצלחת להתייבש (המכסה נפתח) למשך הלילה במכסה מנוע של תרבית תאים.
    הערה: יש לאדות את האלכוהול במלואו לפני ביצוע השלב הבא כדי למנוע קיבוע תאים ורעילות. את הצלחת המוכנה לשימוש המכילה את התוספות ניתן לאחסן מספר ימים לפני השימוש בתנאים יבשים וסטריליים בטמפרטורת החדר.

2. ציפויים כגון פולי-ל-ליזין, או פולי-HEMA (שלב אופציונלי)

הערה: ציפוי אינו מבוצע בניסוי זה, והשלבים ניתנים כדי ליידע לגבי האפשרות של ציפוי התוספות.

  1. הכינו את תמיסת הציפוי בהתאם להוראות היצרן.
  2. שקול נפח של 200-400 μL עבור התאים הגדולים ביותר ונפח של 50-100 μL עבור התאים הקטנים ביותר עבור ציפוי של העלון. הוסיפו את תמיסת הציפוי לתאים הנפרדים.
  3. יש לתת לציפוי להתייבש כפי שצוין על ידי היצרן בתנאים סטריליים.

3. זריעת התאים

  1. תרבית את הקרטינוציטים של מעטפת השורש החיצוני (KORS) ותאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים אנושיים (HDMECs) לפי המלצת היצרן. הכינו את תרחיף התא ברגע שהתאים מגיעים למפגש.
    1. השליכו את התווך מהצלוחיות והוסיפו 5 מ"ל טריפסין כדי לנתק את התאים (ראו טבלת חומרים).
    2. מניחים את הבקבוק המכיל את KORS בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 למשך 5 דקות. יש לדגור על הבקבוק המכיל את ה-HDMECs למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. ערבבו את תמיסת הטריפסין המכילה את KORS עם 5 מ"ל של תווך תאי גזע מזנכימליים (MSCM) בתוספת 5% נסיוב בקר עוברי (FBS) וגורמי גדילה (מדיום בסיסי עם ערכת תוספים, ראו טבלת חומרים). ערבבו את תמיסת הטריפסין המכילה את ה-HDMECs עם 5 מ"ל של תווך תאי אנדותל (ECM) בתוספת 5% FBS וגורמי גדילה (ראו טבלת חומרים).
    4. מעבירים את התאים לתוך 15 מ"ל של צינור חרוטי סטרילי. צנטריפוגה את מתלי KORS ו-HDMEC במהירות של 200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-2 מ"ל של המדיום המתאים.
    6. מערבבים 10 μL של תרחיף התא עם 10 μL של צבע כחול טריפאן (ראה טבלת חומרים).
    7. הוסף 10 μL של תערובת לתוך התא של שקופית הספירה.
    8. הכנס את שקופית הספירה למערכת ספירת התאים (ראה טבלת חומרים) וזהה את מספר התא ואת הכדאיות.
    9. הכינו את תרחיף התא בריכוז של 0.5 x 105 תאים/מ"ל בתווך המתאים.
      הערה: אם סוגי התאים השונים דורשים זמני היצמדות שונים ו/או כדי להגיע למפגש האידיאלי, ניתן לבצע את זריעת התאים בנקודות זמן שונות בהתאם לסוגי התאים.
  2. מפזרים 800 μL עד 1 מ"ל של תרחיף התא לתוך תאים גדולים בודדים ו 100-150 μL לתוך תאים קטנים בודדים עם פיפטה.
    1. זרעו את KORS ב 1 x 105 תאים / מ"ל ב MSCM בתוספת 5% FBS וגורמי גדילה באחד התאים הגדולים.
    2. HDMEC זרעים ב- ECM בתוספת FBS 5% וגורמי גדילה ב- 2.5 x 103 תאים / מ"ל בתאים הקטנים וב- 1.25 x 105 תאים / מ"ל בתא הגדול האחר.
      הערה: ניתן לבצע את בדיקת ההתפשטות בתאים הקטנים, ואת מבחני הנדידה והכדאיות ניתן לבצע בתאים הגדולים. ריכוז התאים שנזרעו הותאם בהתאם להמלצות היצרן. ריכוז זה מאפשר כדאיות טובה של התאים לאחר 24-48 שעות של דגירה.
  3. הניחו את צלחת תרבית התאים בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 או בתנאים הרגילים כדי לאפשר היצמדות ו/או הבשלה של התא.
    הערה: דגרו על התאים במשך 24-48 שעות מבלי לשנות את המדיה. במידת הצורך, ניתן להחליף את המדיום של התאים באופן עצמאי.

4. יישום התרבות המשותפת (איור 1Bd)

הערה: יישום התרבות המשותפת מתאים לזמן שבו נוסף המדיום המשותף. הוספת מדיום ייחודי לכל סוגי התאים בתאים השונים מספקת אפשרות לתקשורת פרקרינית בין התאים בשל נוכחותם של חלונות תקשורת (חורים ביציים בדפנות התוספות המודפסות בתלת מימד). כדי ליישם את התרבות המשותפת, בצע את השלבים 4.1-4.3.

  1. רוקנו את אמצעי התרבות מהתאים השונים של התוספות באמצעות פיפטה. במקרה של תרבית תאים ספרואידית תלת ממדית, השליכו את המדיום בעדינות רבה.
  2. שטפו את התאים עם 1 מ"ל של PBS חם 37°C בתאים הגדולים ו-200 μL של PBS חם 37°C בתאים הקטנים. הקפידו על שטיפה עדינה כדי לא לנתק את התאים.
  3. הוסף 3 מ"ל של מדיום משותף שנבחר כדי להיות תואם לכל סוגי התאים.
    הערה: במחקר זה, ECM הבסיסי (ללא FBS וגורמי גדילה) משמש. ודאו שהתווך מכסה את כל התאים (מפלס מעל חלונות התקשורת [חורים בקירות], כפי שמוצג באיור 1A).
  4. הניחו את הצלחת המכילה את התרביות המשותפות בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 למשך 24-48 שעות.

5. תצפית, ספירה וגירוד של תאים

  1. התבוננו במורפולוגיה וספרו את מספר התאים של התאים השונים במהלך הניסוי תחת מיקרוסקופ אופטי לאחר 24-48 שעות של דגירה.
    הערה: מספר התאים הצפוי תלוי בסוגי התאים שבהם נעשה שימוש (גודל, מורפולוגיה וכו') ובגודל התא. בניסוי זה, בין 0.5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/mL ובין 0.25 x 10 6-0.75 x 10 6 HDMECs/mL נספרים בתאים הגדולים.
  2. נתקו את התאים באמצעות טריפסין לספירת תרחיף תאים.
    הערה: עבור תמיסת ניתוק תאים, שקול נפח של 100-500 μL עבור התאים הגדולים ביותר ונפח של 10-50 μL עבור התאים הקטנים ביותר.
  3. בדוק את הכדאיות באמצעות צביעה כחולה טריפאן (ראה שלבים 3.1.6-3.1.8).

6. הכנסת ניקוי למיחזור

  1. הסירו את התוספות מלוח 6 הקידוחים בסוף הניסוי באמצעות פיתול קל (איור 1Be).
  2. הסר את הסיליקון מהתוספות על ידי משיכתו. במידת הצורך, השתמשו במרית כדי להסיר את שאריות הסיליקון שנדבק לדפנות התוספות (איור 1Bf).
  3. שטפו את התוספות עם חומרי ניקוי וחומרי ניקוי קונבנציונליים לתרבית תאים (דוגמה לכך מופיעה בטבלת החומרים).
  4. לעקר את התוספות לשימוש עתידי autoclave (מחזור מוצק, 121 ° C במשך 20 דקות) או על ידי טבילתם באמבט אתנול 70% במשך 1 שעה.
    הערה: משלב זה, שתי דוגמאות של בדיקות אפשריות (מבחני ריבוי והעברה) מתוארות באמצעות התוספות המודפסות בתלת-ממד (איור 1Bd).

7. בדיקת התפשטות תאים - בדיקת WST-1

  1. בצע את שלבים 1-3.1 כדי לגדל את התאים בתרבית.
    הערה: בצע את השלב בסעיף זה כדי ליישם את מערכת התרבות המשותפת כדי לחקור את ההשפעה של הפרשת KORS על התפשטות HDMEC. תאי KORS משמשים להשוואת הנתונים שפורסמו בעבר8.
    1. זרעו את KORS ב 1 x 105 תאים / מ"ל במדיום תאי גזע מזנכימליים (MSCM) בתוספת 5% FBS וגורמי גדילה בתאים הגדולים.
    2. מניחים את צלחת תרבית התאים על 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24 שעות.
    3. זרעו את ה-HDMECs בתאי אנדותל בינוניים (ECM) בתוספת FBS של 5% וגורמי גדילה ב-2.5 x 103 תאים/מ"ל בתאים הקטנים.
    4. מניחים את צלחת תרבית התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24-48 שעות.
    5. השליכו את המדיה מכל התאים ויישמו את מערכת התרבית המשותפת על ידי תוספת של 3 מ"ל של ECM בסיסי ללא תוספת (מדיום תרבית תאים נפוץ לכל התאים של התוספות המודפסות בתלת-ממד).
  2. דללו את WST-1 בתווך תרבית התאים המשותףEC M (דילול סופי ביחס של 1:10) להכנת תמיסת WST-1.
    הערה: עבור נפח של תמיסת WST-1, הכן לפחות 500 μL של תמיסה נוספת עבור החסר.
  3. יש להשליך את מדיום תרבית התאים מהעלון על ידי פיפטציה.
  4. הוסף את פתרון WST-1 לתאים שנבחרו (150 μL עבור התאים הקטנים ו- 600 μL עבור התאים הגדולים). שים את הצלחת על 37 ° C עם 5% CO2.
  5. לאחר זמן הדגירה האופטימלי של 30 דקות, העבירו 100 מיקרוליטר של מדיום הדגירה מכל מצב על צלחת של 96 בארות.
  6. הערך את התגובה הקולורימטרית באמצעות קורא microplate בין 420 ננומטר ל 480 ננומטר.
    1. שים את הצלחת על קורא microplate ולחץ על כפתור לערוך פרוטוקול חדש.
    2. בחר את הסוג הספציפי של לוח 96 בארות (ראה טבלת חומרים) המשמש ואת אורך הגל של 450 ננומטר.
    3. לחץ על כפתור התחל מדידה.

8. בדיקת נדידת תאים - מכשיר שני תאי נדידה

  1. בצע את שלבים 1-3.1 כדי לגדל את התאים בתרבית.
    הערה: בצע את השלבים בסעיף זה כדי ליישם את מערכת התרבות המשותפת כדי לחקור את ההשפעה של הפרשת KORS על התפשטות HDMEC.
    1. זרעו את KORS ב 1 x 105 תאים / מ"ל ב MSCM בתוספת 5% FBS וגורמי גדילה באחד התאים הגדולים.
    2. מניחים את צלחת תרבית התאים על 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24 שעות.
    3. הכנס את התקן שני תאי ההעברה לתא הגדול השני של תוספות.
    4. זרעו את ה- HDMECs ב- ECM בתוספת FBS של 5% וגורמי גדילה ב 7 x 105 תאים / באר של שני תאי הנדידה.
    5. מניחים את צלחת תרבית התאים על 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24 שעות.
    6. השליכו את המדיה ואת התקן שני תאי הנדידה לאחר 24 שעות או בזמן אופטימלי בהתאם לסוג התא הנודד. ליישם את מערכת התרבות המשותפת על ידי תוספת של 3 מ"ל של ECM בסיסי ללא השלמה.
      הערה: המשך בזהירות כדי לא לנתק את התאים. אם התאים באמת רגישים לניתוק הנגרם על ידי הוספת התווך המשותף, משוך את התקן שני תאי הנדידה לאחר הוספת התווך המשותף.
  2. התבונן וצלם תמונה של פני השטח המכוסים על ידי התאים בנקודות זמן שונות תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 10.
    הערה: התמונות מצולמות במיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה (ראה טבלת חומרים). התמונות נשמרות במפתח USB ולאחר מכן מנותחות על ידי תוסף הכלי לריפוי פצעים של התוכנה (ראה טבלת חומרים).
  3. מדוד את פני השטח החשופים באמצעות תוכנת ניתוח כמותית קלאסית.
    1. פתח את התמונה בתוכנה והפעל את כלי ריפוי הפצעים הזמין ברשימת המאקרו.
    2. לחץ על כפתור m כדי למדוד את פני השטח החשופים של תמונת ההעברה.
    3. המשטח החשוף מחושב לפי הנוסחה הבאה:
      אחוז הכיסוי = ([שטח ממוצע ללא תאים ב- T0 − אזור ללא תאים בזמן T]/אזור ממוצע ללא תאים ב- T0) × 100.
      הערה: התוספות המודפסות בתלת-ממד מותאמות לחלוטין לרוב הטכניקות של ביולוגיה של התא (כגון בדיקת היווצרות צינור מדומה, תרביות תלת-ממדיות) ולניסויים ביוכימיים (כגון מיצוי DNA, RNA, חלבון).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה הנוכחית תוארה מערכת תרבות משותפת אופטימלית להשגת נתונים חזקים, אמינים ומשמעותיים הדומים לשיטות קלאסיות באמצעות שימוש במדיה מותנית. התוספות המודפסות בתלת-ממד מחקות את תנאי המיקרו-סביבה in vivo של סוגי תאים שונים באינטראקציה על ידי התגברות על הקשיים והייצור הגוזל זמן של מדיה מותנית במעלה הזרם בניסויים. מחקר שפורסם בעבר נערך מחדש כדי לנתח את האינטראקציות העקיפות בין שני סוגי תאים הנמצאים בזקיקי שיער: תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים (HDMECs) וקרטינוציטים אנושיים של מעטפת השורש החיצוני (KORS)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תקשורת סלולרית עקיפה נחקרת בדרך כלל באמצעות מדיה מותנית או התקני מערכת תרבות משותפת. הכנת מדיה מותנית גוזלת זמן רב במעלה הזרם בניסויים, ושיטה זו מוגבלת לניתוחי אפקטים חד-צדדיים. המחקר הקודם של Colin-Pierre et al.8 באמצעות מדיה מותנית נערך על תקשורת תאית עקיפה בין שני סוגי תאים (HDMECs ו- KORS). הנתונים של מחקר קודם זה הדגימו את ההשפעה של מדיה מותנית KORS על התפשטות HDMEC ואת ההשפעה של מדיה מותנית KORS על נדידת HDMEC, היווצרות pseudotube, וביטוי GPC18. במחקר הנוכחי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נעשה בשיתוף פעולה עם BASF Beauty Care Solutions. גב' צ'רלי קולין-פייר היא עמיתת דוקטורט במימון BASF / CNRS.

ברצוננו להודות למר מהדי סלאמי על הרעיון של התוספות המודפסות בתלת-ממד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AutoclaveGetingeAPHPמחזור מוצק, 121 & deg; C למשך 20 דקות
Biomed ClearFormlabsRS-F2-BMCL-01התרשמות מבוצעת על ידי חברת 3D-Morphoz (ריימס, צרפת)
חומרי ניקוי לתרבית תאים TounettA18590/0116
מגיב התפשטות תאים WST-1Roche11,64,48,07,001
שקופית ספירהNanoEnTekEVE-050
תרבית-הכנסה 2 באר ב μ-צלחת 35 מ"מIbidi80206מכשיר שני תאי הגירה. 
מדיום תאי אנדותלScienCell1001מדיום בסיסי +/- 25 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS, 0025), 5 מ"ל של תוסף צמיחת תאי אנדותל (ECGS, 1052), ו-5 מ"ל של תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין (P/S, 0503).
מונה תאים אוטומטי EVE NanoEnTekNESCT-EVE-001E 
EVOS XL CoreFisher ScientificAMEX120010 של הגדלה
ערכת ריאגנט וזרז סיליקון מזוןArtificinaRTV 3428 A ו-B (10:1)
מדפסת FORM 3BFormlabsPKG-F3B-WSVC-DSP-BASICרושם שבוצע על ידי חברת 3D-Morphoz
תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים אנושיים (HDMEC)ScienCell2000
קרטינוציטים של מעטפת שורש חיצונית (KORS)ScienCell2420
Macro Wound Healing Tool Softwareתוכנת ImageJהמשמשת למדידת המשטח החשוף (עבור מבחני הגירה)
מדיום תאי גזע מזנכימליים ScienCell7501בינוני בזאלי +/- 25 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS, 0025), 5 מ"ל של תוסף צמיחת תאי גזע מזנכימליים (MSCGS, 7552), ו-5 מ"ל של תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין (P/S, 0503)קורא
מיקרופלייט SPECTRO כוכב NANOBMG Labtechתוכנת BMG LABTECH
PBSPromocellC-40232ללא Ca2+ / Mg2+
Trypan כתם כחולNanoEnTekEBT-001
Trypsin / EDTAPromocellC-41020דגירה של KORS ב-37 מעלות; C עם 5% CO2 למשך 5 דקות. דגירה של HDMECs למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר
צלחת 96 בארות Nunclon DeltaSurface Thermoscientific167008
פי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
  2. Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825(2019).
  3. Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113(2018).
  4. Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
  5. Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318(2021).
  6. Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311(2017).
  7. Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
  8. Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172(2021).
  9. Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
  10. Wu, A. -L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352(2021).
  11. Oudart, J. -B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
  12. Martinotti, S., Ranzato, E. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).
  13. Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97(2018).
  14. Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

3D Printed InsertCell Co CultureIntercellular CommunicationConditioned MediaKeratinocyte CultureEndothelial CellsSpheroid CultureOrganoid CultureCell Migration AssayOptical Microscopy

מאמרים קשורים