מאמר שיטה

חקירה זוגית ספציפית לתא של העכבר, השחלות אפיגנום ושעתוק

DOI:

10.3791/64765

⸱

24 בפברואר 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Aging and Metabolism Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Genes & Human Disease Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Oklahoma City Veterans Affairs Medical Center, 4Nutrition College, Federal University of Pelotas

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) הותאמו לחקירה זוגית של שעתוק השחלות הספציפי לתא ואפיגנום באמצעות מודל עכבר NuTRAP שחצו לקו עכבר Cyp17a1-Cre.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכת שינויים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג התא הם המפתח להבנת הזדקנות השחלות. לשם כך, האופטימיזציה של שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) בוצעה לצורך חקירה זוגית עוקבת של תעתיק השחלות והאפיגנום הספציפיים לתא באמצעות מודל עכבר NuTRAP מהונדס חדשני. הביטוי של אלל NuTRAP נמצא תחת שליטה של קלטת STOP floxed וניתן לכוון אותו לסוגי תאי שחלה ספציפיים באמצעות קווי Cre ספציפיים למקדם. מכיוון שמחקרים אחרונים קשרו תאי סטרומה בשחלות בהנעת פנוטיפים של הזדקנות מוקדמת, מערכת הביטוי NuTRAP התמקדה בתאי סטרומה באמצעות דרייבר Cyp17a1-Cre. השראת מבנה NuTRAP הייתה ספציפית לפיברובלסטים סטרומה בשחלות, והתקבלו מספיק DNA ו-RNA למחקרי ריצוף משחלה יחידה. ניתן להשתמש במודל NuTRAP ובשיטות המוצגות כאן כדי לחקור כל סוג תא שחלה עם קו Cre זמין.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השחלות הן שחקניות מרכזיות בהזדקנות סומטית1, עם תרומות שונות מאוכלוסיות תאים ספציפיות. ההטרוגניות התאית של השחלה מקשה על פירוש התוצאות המולקולריות מבדיקות שחלה שלמות בתפזורת. הבנת התפקיד של אוכלוסיות תאים ספציפיות בהזדקנות השחלות היא המפתח לזיהוי הגורמים המולקולריים האחראים לפוריות ולירידה בבריאות אצל נשים מזדקנות. באופן מסורתי, ההערכה הרב-אומית של סוגי תאי שחלה ספציפיים הושגה על ידי טכניקות כגון מיקרודיסקציה לייזר2, גישות חד-תאיות3 או מיון תאים4. עם זאת, מיקרודיסקציה יכולה להיות יקרה וקשה לביצוע, ומיון תאים יכול לשנות פרופילים פנוטיפיים תאיים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בקרן המחקר הרפואי של אוקלהומה (OMRF). עכברי הורים נרכשו ממעבדת ג'קסון (בר הרבור, ME) וגודלו ושוכנו בתנאי SPF בסביבת מחסום HEPA במחזור אור/חושך של 14 שעות/10 שעות (אורות דולקים בשעה 6:00 בבוקר) ב- OMRF.

הערה: בהדגמה זו, אנו משתמשים בזכר Cyp17iCre+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory) בשילוב עם נקבת NuTRAP (זן # 029899, מעבדת ג'קסון). צאצאי Cyp17-NuTRAP הרצויים (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) יבטא את אלל NuTRAP תחת שליטתו של מקדם Cyp17a1 בתאי סטרומה בשחלות. להכנת כתב היד השתמשנו בעכברות Cyp17-NuTRAP בנות 4 חודשים (n = 4). D....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סכמה של פרוטוקולי TRAP ו-INTACT מוצגת באיור 1. כאן הספציפיות של מודל העכבר Cyp17-NuTRAP לתאי סטרומה/תקה בשחלות מודגמת על ידי הדמיה אימונופלואורסצנטית ו-RNA-Seq מ-RNA מבודד TRAP. ראשית, בוצעה הדמיה אימונופלואורסצנטית של אות eGFP בשחלה ולוקליזציה של אות eGFP לתאי התקה והסטרומה. בקצרה, 5 מקטעים מיקרומטר היו deparaffinized עם xylene ו אתנול הדרגתי. לאיתות eGFP טוב יותר, חלבון ה-eGFP הוכתם באמצעות נוגדן ראשוני נגד GFP עז ונוגדן משני נגד חמור אלקסה 488, והגרעינים הוכתמו ב-DAPI15<.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכבר NuTRAP מודל6 הוא גישת תיוג מהונדס רבת עוצמה לחקירה זוגית של התמליל והאפיגנום מסוגי תאים ספציפיים שניתן להתאים לכל סוג תא עם מנהל התקן Cre זמין. כאן, אנו מדגימים את הספציפיות של מודל העכבר Cyp17-NuTRAP בהתמקדות בתאי תקה וסטרומה בשחלות. ניתן להשתמש במודל Cyp17-NuTRAP כדי להבהיר עוד יותר את המנגנונים האפיגנטיים הספציפיים לתאי תקה וסטרומה המעורבים בהזדקנות השחלות, סרטן ומחלות.

בעת בחירת מנהל התקן Cre, מומלץ לאמת את ספציפיות התא של ביטוי NuTRAP בתיווך Cre באמצעות מספר ג.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), קרן BrightFocus (M2020207) וקרן הבריאות הפרסביטריאנית. עבודה זו נתמכה בחלקה גם על ידי פרס MERIT I01BX003906 ופרס תוכנית הערכת ציוד משותף (ShEEP) ISIBX004797 מארה"ב (ארה"ב) המחלקה לענייני חיילים משוחררים, שירות מחקר ופיתוח מעבדה ביו-רפואית. המחברים רוצים גם להודות למרכז הגנומיקה הקלינית (OMRF) ולמתקן הליבה של הדימות (OMRF) על הסיוע והשימוש במכשירים.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.1 מ' ספרמידיןסיגמא-אולדריץ'05292-1ML-F
1 מ' MgCl2Thermo ScientificAM9530G
10% NP-40Thermo Scientific85124
100 מ"ג/מ"ל ציקלוהקסימידסיגמא-אולדריץ'C4859-1ML
2-מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ'M3148
30 ומיקרו; מסננת תאים M Miltenyi Biotec130-098-458
כל הכנת DNA / RNA מיני ערכתQiagen80204
נוגדן נגד GFPAbcamAb290עבור TRAP ו- IHC (ארנב פוליקלונלי ל- GFP)
מאגר RLTQiagen79216RNA מאגר ליזה בפרוטוקול
cOmplete, מיני, מעכב פרוטאז ללא EDTA טבליתRoche11836170001להומוגניזציה של TRAP
דגם עכבר Buffer Cyp17iCreמעבדת ג'קסון28547B6; SJL-Tg(Cyp17a1-icre)מגנט AJako/J
DynaMag-2Invitrogen12321D
Genotyping PrimersIDTCustomGeneric Cre - פרוטוקול מעבדת ג'קסון 22392, פריימרים: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
         Cyp17iCre - פרוטוקול מעבדת ג'קסון 30847, פריימרים: 21218, 31704, 31705, 35663
         NuTRAP - פרוטוקול מעבדת ג'קסון 21509, פריימרים: 21306, 24493, 32625, 32626
קוקטייל מעכב פרוטאז עצור (100X)Thermo Scientific1861278עבור מאגר NPB
M-280 Streptavidin Dynabeads Invitrogen11205D2.8 ומיקרו; M קוטר חרוז
MixMateEppendorf5353000529
ערכת בידוד גרעינים: Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNuc101מכיל מאגר ליזיס גרעינים ומאגר אחסון גרעינים
1 M HEPESGibco15630-080
5 M NaClThermo ScientificAM9760G
2M KClThermo ScientificAM9640G
0.5 מ' EDTAThermo ScientificAM9260G
0.5 מ' EGTAFisher Scientific50-255-956
דגם עכבר NuTRAPמעבדת ג'קסון29899B6; 129S6-GT (ROSA) 26Sortm2 (CAG-NuTRAP) Evdr / J
Pierce DTT ללא משקל פורמטThermo ScientificA39255
חלבון G DynabeadsThermoFisher10004Dעבור TRAP
RNaseOUTInvitrogen10777019
נתרן הפריןפישר מדעיBP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5Invitrogen15567-027
מסובב צינור VWRפישר סיינטיפיקNC9854190

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissect....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NuTRAPINTACTRNA

מאמרים קשורים