מאמר שיטה

חקירה זוגית ספציפית לתא של העכבר, השחלות אפיגנום ושעתוק

DOI:

10.3791/64765

⸱

24 בפברואר 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Aging and Metabolism Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Genes & Human Disease Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Oklahoma City Veterans Affairs Medical Center, 4Nutrition College, Federal University of Pelotas

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) הותאמו לחקירה זוגית של שעתוק השחלות הספציפי לתא ואפיגנום באמצעות מודל עכבר NuTRAP שחצו לקו עכבר Cyp17a1-Cre.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכת שינויים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג התא הם המפתח להבנת הזדקנות השחלות. לשם כך, האופטימיזציה של שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) בוצעה לצורך חקירה זוגית עוקבת של תעתיק השחלות והאפיגנום הספציפיים לתא באמצעות מודל עכבר NuTRAP מהונדס חדשני. הביטוי של אלל NuTRAP נמצא תחת שליטה של קלטת STOP floxed וניתן לכוון אותו לסוגי תאי שחלה ספציפיים באמצעות קווי Cre ספציפיים למקדם. מכיוון שמחקרים אחרונים קשרו תאי סטרומה בשחלות בהנעת פנוטיפים של הזדקנות מוקדמת, מערכת הביטוי NuTRAP התמקדה בתאי סטרומה באמצעות דרייבר Cyp17a1-Cre. השראת מבנה NuTRAP הייתה ספציפית לפיברובלסטים סטרומה בשחלות, והתקבלו מספיק DNA ו-RNA למחקרי ריצוף משחלה יחידה. ניתן להשתמש במודל NuTRAP ובשיטות המוצגות כאן כדי לחקור כל סוג תא שחלה עם קו Cre זמין.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השחלות הן שחקניות מרכזיות בהזדקנות סומטית1, עם תרומות שונות מאוכלוסיות תאים ספציפיות. ההטרוגניות התאית של השחלה מקשה על פירוש התוצאות המולקולריות מבדיקות שחלה שלמות בתפזורת. הבנת התפקיד של אוכלוסיות תאים ספציפיות בהזדקנות השחלות היא המפתח לזיהוי הגורמים המולקולריים האחראים לפוריות ולירידה בבריאות אצל נשים מזדקנות. באופן מסורתי, ההערכה הרב-אומית של סוגי תאי שחלה ספציפיים הושגה על ידי טכניקות כגון מיקרודיסקציה לייזר2, גישות חד-תאיות3 או מיון תאים4. עם זאת, מיקרודיסקציה יכולה להיות יקרה וקשה לביצוע, ומיון תאים יכול לשנות פרופילים פנוטיפיים תאיים5.

גישה חדשנית להערכת פרופילים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג תאי השחלות משתמשת במודל העכבר NuTRAP (ראשי תיבות של Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification). מודל NuTRAP מאפשר בידוד של חומצות גרעין ספציפיות לסוג התא ללא צורך במיון תאים באמצעות שיטות טיהור הזיקה: תרגום טיהור זיקה ריבוזומים (TRAP) ובידוד גרעינים המסומנים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT)6. הביטוי של אלל NuTRAP נמצא תחת שליטה של קלטת STOP floxed וניתן לכוון אותו לסוגי תאי שחלה ספציפיים באמצעות קווי Cre ספציפיים למקדם. על ידי חציית עכבר NuTRAP עם קו Cre ספציפי לסוג התא, הסרת קלטת STOP גורמת לתיוג eGFP של הקומפלקס הריבוזומלי ותיוג ביוטין/mCherry של הגרעין באופן תלוי Cre6. לאחר מכן ניתן להשתמש בטכניקות TRAP ו- INTACT כדי לבודד mRNA ו- DNA גרעיני מסוג התא המעניין ולהמשיך לניתוחים שעתוק ואפיגנומיים.

מודל NuTRAP שימש ברקמות שונות, כגון רקמת שומן6, רקמת מוח 7,8,9 ורשתית10, כדי לחשוף שינויים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג התא שעשויים שלא להיות מזוהים בהומוגנט של רקמה שלמה. היתרונות של גישת NuTRAP על פני טכניקות מסורתיות של מיון תאים כוללים: 1) מניעת ממצאים אקטיבציוניים של ex vivo 8, 2) הצורך הממוזער בציוד מיוחד (כלומר, ממייני תאים), ו -3) התפוקה המוגברת והעלות המופחתת של ניתוחים ספציפיים לסוג התא. בנוסף, היכולת לבודד דנ"א ורנ"א ספציפיים לסוג התא מעכבר בודד מאפשרת ניתוחים זוגיים המגבירים את הכוח הסטטיסטי. מכיוון שמחקרים אחרונים קשרו תאי סטרומה בשחלות בהנעת פנוטיפים של הזדקנות מוקדמת 11,12,13, כיוונו את מערכת הביטוי NuTRAP לתאי סטרומה ותקה באמצעות דרייבר Cyp17a1-Cre. כאן, אנו מראים כי השראת מבנה NuTRAP היא ספציפית לתאי סטרומה ותקה בשחלות, ומספיק DNA ו- RNA למחקרי ריצוף מתקבלים משחלה אחת. ניתן להשתמש במודל NuTRAP ובשיטות המוצגות כאן כדי לחקור כל סוג תא שחלה עם כל קו Cre זמין.

ליצירת קו עכברי NuTRAP ספציפי לסוג התא, אלל התיוג והתרגום הגרעיני של טיהור זיקה ריבוזום (NuTRAP) כולל קודון STOP floxed השולט בביטוי של BirA, פפטיד זיהוי ליגאז ביוטין (BLRP) המתויג mCherry/mRANGAP1 ו-eGFP/L10a. כאשר חוצים אותו עם קו Cre ספציפי לסוג התא, הביטוי של קלטת NuTRAP מתייג את החלבון הגרעיני mRANGAP1 עם ביוטין/mCherry ואת החלבון הריבוזומלי L10a עם eGFP באופן תלוי Cre. זה מאפשר בידוד של גרעינים ו-mRNA מסוגי תאים ספציפיים ללא צורך במיון תאים. ניתן להתאים אתNuTRAP flox/flox עם Cre ספציפי לסוג התא הרלוונטי לסוגי תאי השחלות כדי להעריך זאת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בקרן המחקר הרפואי של אוקלהומה (OMRF). עכברי הורים נרכשו ממעבדת ג'קסון (בר הרבור, ME) וגודלו ושוכנו בתנאי SPF בסביבת מחסום HEPA במחזור אור/חושך של 14 שעות/10 שעות (אורות דולקים בשעה 6:00 בבוקר) ב- OMRF.

הערה: בהדגמה זו, אנו משתמשים בזכר Cyp17iCre+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory) בשילוב עם נקבת NuTRAP (זן # 029899, מעבדת ג'קסון). צאצאי Cyp17-NuTRAP הרצויים (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) יבטא את אלל NuTRAP תחת שליטתו של מקדם Cyp17a1 בתאי סטרומה בשחלות. להכנת כתב היד השתמשנו בעכברות Cyp17-NuTRAP בנות 4 חודשים (n = 4). DNA הופק מדגימות ניקוב אוזניים של עכבר עבור גנוטיפ כדי לאשר את התורשה של טרנסגנים Cyp17iCre ו- NuTRAP ועבור זיהוי PCR של 1) Cre גנרי, 2) Cyp17iCre, ו -3) NuTRAP floxed באמצעות הפריימרים המפורטים בטבלת החומרים, כפי שתואר קודם לכן 7,8.

1. דיסקציה שחלתית עכבר

  1. לבצע המתת חסד עכבר בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים ואישור המוסד, ולאחר מכן איסוף השחלות.
  2. לנתח את השחלות כדי להסיר כל רקמת שומן או חלקים של הביציות שעשויים להיות מחוברים לרקמת השחלה לפני הצבת השחלות בצינורות עם חיץ. המשך מיד לטכניקות TRAP או INTACT.
    הערה: פרוטוקול זה לא מוטב לשימוש עם רקמות קפואות. מומלץ להשתמש בשחלה אחת מאותו עכבר עבור כל טכניקה לצורך ניתוח סטטיסטי עתידי.

2. בידוד גרעינים מסוגי תאי שחלה ספציפיים

  1. הכנת חיץ
    1. חיץ טיהור גרעיני (NPB): כדי להכין 100 מ"ל של NPB, לשלב 2 מ"ל של 1 M HEPES (ריכוז סופי: 20 mM HEPES), 0.8 מ"ל של 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4.5 מ"ל של 2 M KCl (90 mM KCl), 0.4 מ"ל של 0.5 M EDTA (2 mM EDTA), 0.1 מ"ל של 0.5 M EGTA (0.5 mM EGTA), ו-92.2 מ"ל מים נטולי נוקלאז. יש ליטול תוסף עם מעכב פרוטאז 1x ביום בידוד הגרעינים.
      הערה: NPB יכול להיות מוכן ללא מעכב פרוטאז מראש ונמשך עד 3 שבועות ב 4 ° C.
    2. Nuclei lysis buffer (שלם): תוספת מאגר גרעיני ליזה עם מעכב פרוטאז 1x ביום בידוד גרעינים.
  2. יצירת תרחיף הגרעינים
    הערה: הדגימות צריכות להישמר על קרח בכל עת, אלא אם צוין אחרת.
    1. יש לאסוף שחלה אחת מעכבר Cyp17-NuTRAP (או מ-Cre-NuTRAP רלוונטי אחר) ב-500 מיקרוליטר של מאגר גרעיני ליזה (שלם). חותכים את השחלה לשמונה חלקים בתוך החיץ באמצעות מספריים זעירים הנפתחים מעצמם.
    2. השתמש קצות פיפטה רחב משעמם להעביר את השחלה טחון 500 μL של חיץ ליזיס לתוך להקפיץ homogenizer על קרח. הומוגניזציה השחלה 10x-20x עם pestle רופף A. להוסיף 400 μL של חיץ ליזיס הומוגנייזר Dounce, כביסה pestle A.
    3. הומוגניזציה השחלה עם pestle הדוק B 10x-20x. מוסיפים 1,000 מיקרוליטר של חיץ ליזיס, שטיפת מזיקים B. מעבירים את ההומוגנאט (1.9 מ"ל) לצינור בעל תחתית עגולה בנפח 2 מ"ל.
    4. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 1.5 דקות ב 4 ° C כדי להסיר רקמות לא מנותקות וכלי דם14. הסופרנאטנט מכיל את הגרעינים; להשליך את הגלולה של רקמה לא מנותקת.
    5. לאחר הרטבה מוקדמת של מסננת תאים של 30 מיקרומטר עם 100 מיקרוליטר של חיץ ליזיס, ומסננים את הסופרנאטנט דרך מסננת התא לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל. לאחר מכן, העבירו את התערובת המכילה גרעינים לצינור בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל.
    6. צנטריפוגה את הדגימה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ו להשליך את supernatant. הגלולה מכילה גרעינים.
    7. יש להשהות מחדש את הגלולה הגרעינית ב-250 מיקרוליטר של חיץ ליזה קר כקרח על ידי מערבול קצר במהירות בינונית עד גבוהה. הבא את עוצמת הקול עד 1.75 מ"ל על-ידי הוספת 1.5 מ"ל של מאגר ליזיס. מערבבים בעדינות, ומניחים את המתלה הגרעיני על קרח למשך 5 דקות.
    8. גלולה את הגרעינים על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לגלולה הגרעינית. השהה מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר אחסון קר כקרח, ומערבל לזמן קצר כדי להשהות מחדש לחלוטין את הגלולה הגרעינית.
    9. שמור 10% מהגלולה המרחפת מחדש (20 μL) כדגימת גרעיני קלט לניתוחים במורד הזרם.
    10. קח את גלולת הגרעינים המרחפים מחדש, והשלם את הנפח ל -2.0 מ"ל עם NPB קר כקרח. המשך לבודד את הגרעינים המסומנים באמצעות שיטת הטיהור מבוססת זיקה INTACT.
  3. בידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT)
    1. מערבבים את חרוזי הסטרפטאבידין בבקבוקון במשך 30 שניות במהירות בינונית כדי להבטיח שהם מושהים מחדש במלואם. הוסף 30 μL של חרוזים מרחפים עבור כל דגימה לתוך צינור 2 מ"ל תחתית עגולה (חרוזים עבור עד 10 דגימות ניתן לשטוף בצינור אחד), להוסיף 1 מ"ל של NPB, ולהשהות היטב על ידי pipetting.
    2. הניחו את הצינור על המדף המגנטי למשך דקה אחת כדי להפריד בין החרוזים. השליכו את הסופרנטנט, והוציאו את הצינור מהמגנט. להשעות מחדש את החרוזים המגנטיים שטופים ב 1 מ"ל של NPB.
    3. חזרו על שלב השטיפה במשך שלוש כביסות בסך הכל. לאחר השטיפה הסופית, השהה מחדש את החרוזים בנפח הראשוני של NPB (30 μL לדגימה).
    4. הוסף 30 μL של חרוזים שטופים להשעיה גרעינית 2 מ"ל משלב 2.2.10. מרחפים היטב את תערובת גרעיני החרוזים על ידי פיפטינג והיפוך עדין של הצינור.
    5. מניחים את הצינורות על מיקסר מסתובב בחדר קר או מקרר למשך 30 דקות במהירות נמוכה. לדגור על דגימות הקלט ללא חרוזים באותם תנאים.
    6. מניחים את הצינורות עם התרחיף הגרעיני והחרוזים על המגנט, ומפרידים את גרעיני הביוטינילציה הקשורים לחרוזי סטרפטווידין (חלק חיובי) מהחלק השלילי של הגרעינים. הניחו לחרוזים להיפרד על המגנט למשך 3 דקות.
    7. מוציאים את הסופרנטנט, מעבירים את החלק השלילי לצינור טרי של 2.0 מ"ל, ושומרים על קרח. עבור כל צינור שבר חיובי, הסר את הצינור מהמגנט, והשהה מחדש את התוכן ב -1 מ"ל של NPB.
    8. מניחים את הצינור על המגנט למשך דקה אחת, ומשליכים את הסופרנטנט. הסר את הצינור מהמגנט, והשהה מחדש את תערובת גרעיני החרוזים שנשטפו ב -1 מ"ל של NPB.
    9. חזור על שלב 2.3.8 עבור שלוש כביסות בסך הכל. לאחר השלמת שלוש שטיפות, להשעות מחדש את תערובת גרעיני חרוזי החלק החיובי ב 30 μL של NPB.
    10. עבור כל צינור שבר שלילי, צנטריפוגה את המתלה הגרעיני משלב 2.3.7 ב 500 x גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C. בזהירות לשאוף ולהשליך את supernatant. השהה מחדש את גלולת גרעיני השבר השלילי ב- 30 μL של NPB.
    11. אחסנו את הגרעינים מהקלט (שלב 2.2.9), מהשבר השלילי (שלב 2.3.10) ומהשבר החיובי (שלב 2.3.9) במקפיא של -80°C עד שיהיו מוכנים לבידוד DNA גרעיני או RNA.
      הערה: אין להקפיא את הגרעינים עבור פרוטוקולים הדורשים גרעינים שלמים כקלט (כלומר, בדיקה עבור כרומטין, כרומטין נגיש למשקעים).

3. בידוד mRNA מסוגי תאי שחלה ספציפיים

  1. הכנת המאגרים
    1. בסיס חיץ מלכודת: הכינו 100 מ"ל של בסיס חיץ TRAP על ידי שילוב של 78.8 מ"ל מים נטולי RNase, 5 מ"ל של 1 M Tris-HCl (ריכוז סופי: 50 mM Tris [pH 7.5]), 5 מ"ל של 2 M KCl (100 mM KCl), 1.2 מ"ל של 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2), ו-10 מ"ל של 10% NP-40 (1% NP-40). יש לאחסן ב-4°C למשך עד חודש אחד.
    2. בסיס חיץ מלח גבוה: הכינו 100 מ"ל של בסיס חיץ מלח גבוה על ידי שילוב של 68.8 מ"ל מים נטולי RNase, 5 מ"ל של 1 M Tris-HCl (ריכוז סופי: 50 mM Tris [pH 7.5]), 15 מ"ל של 2 M KCl (300 mM KCl), 1.2 מ"ל של 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2), ו-10 מ"ל של 10% NP-40 (1% NP-40). יש לאחסן ב-4°C למשך עד חודש אחד.
    3. חיץ הומוגניזציה TRAP (מלא): הכינו 1.5 מ"ל לכל דגימה ביום איסוף הרקמות. הכן 10 מ"ל של מאגר הומוגניזציה של TRAP על ידי שילוב של 10 מ"ל של בסיס מאגר TRAP (משלב 3.1.1) עם 10 μL של 100 מ"ג/מ"ל ציקלוהקסימיד (ריכוז סופי: 100 מיקרוגרם/מ"ל ציקלוהקסימיד), 10 מ"ג נתרן הפרין (1 מ"ג/מ"ל נתרן הפרין), 20 מיקרוליטר של 0.5 M DTT (1 mM DTT), 50 μL של 40 U/μL מעכב RNase (200 U/mL RNase inhibitor), 200 μL של 0.1 M ספרמידין (2 mM זרע), וטבליה אחת ללא מעכבי פרוטאז ללא EDTA (1x).
    4. חיץ שטיפת מלח נמוך (שלם): יש לייצר 1.5 מ"ל לדגימה ביום איסוף הרקמות. כדי ליצור 10 מ"ל של חיץ שטיפת מלח נמוך, ערבבו 10 מ"ל של בסיס חיץ TRAP (משלב 3.1.1) עם 10 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל ציקלוהקסימיד (100 מיקרוגרם/מ"ל ציקלוהקסימיד) ו-20 מיקרוליטר של 0.5 מ"מ DTT (1 מ"מ DTT).
    5. חיץ שטיפת מלח גבוה (מלא): יש לייצר 1.5 מ"ל לדגימה ביום השני לבידוד TRAP. כדי ליצור 10 מ"ל של חיץ שטיפת מלח גבוה, שלב 10 מ"ל של בסיס חיץ מלח גבוה (משלב 3.1.2) עם 10 μL של 100 מ"ג / מ"ל cycloheximide ו 20 μL של 0.5 M DTT.
  2. ביצוע טיהור זיקה ריבוזומי מתרגם (TRAP)
    1. אסוף את השחלה השנייה מעכבר Cyp17-NuTRAP (או מ- Cre-NuTRAP רלוונטי אחר) והנח אותה בצינור ללא RNase בנפח 1.5 מ"ל המכיל 100 μL של מאגר הומוגניזציה של TRAP קר כקרח (משלב 3.1.3). חותכים את השחלה לשמונה חלקים בתוך החיץ באמצעות מספריים זעירים הנפתחים מעצמם.
    2. השתמש בקצוות רחבים כדי להעביר את השחלה ואת 100 μL של חיץ הומוגניזציה לתוך זכוכית להקפיץ הומוגנייזר. הומוגניזציה 10x-20x עם המזיק הרופף A. הוסף 400 μL של חיץ הומוגניזציה TRAP, שטיפת מזיק A.
    3. מעבירים את ההומוגנט לצינור עגול בנפח 2 מ"ל. שטפו את ההומוגנייזר Dounce עם 1 מ"ל נוספים של מאגר הומוגניזציה TRAP, והעבירו את נפח השטיפה לצינור בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל.
    4. צנטריפוגה הומוגנט ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. מעבירים את הסופרנאטנט המפונה לצינור טרי בנפח 2 מ"ל בעל תחתית עגולה. השליכו את הכדור.
    5. מעבירים 100 μL של ההומוגנט המפונה לצינור טרי בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל, ושומרים כקלט על קרח.
    6. יש לדגור על שארית ההומוגנט המפונה (משלב 3.2.4) עם נוגדן אנטי-GFP (5 מיקרוגרם/מ"ל) למשך שעה אחת ב-4°C תוך סיבוב מקצה לקצה. לדגור על דגימת הקלט באותם תנאים.
    7. ב-15 הדקות האחרונות של הדגירה, שטפו את החרוזים המגנטיים של חלבון G במאגר שטיפת המלח הנמוך באמצעות השלבים הבאים (3.2.8-3.2.11).
    8. מערבלים את בקבוקון החרוזים המגנטיים של חלבון G למשך 30 שניות כדי להשהות מחדש לחלוטין. מעבירים 50 μL של חלבון G חרוזים מגנטיים עבור כל דגימה (עד 10 דגימות ניתן לשטוף בצינור אחד) לתוך 2 מ"ל תחתית עגולה.
    9. מוסיפים 500 μL של חיץ שטיפה דל מלח לחרוזים, ופיפטה בעדינות לערבוב. הניחו את הצינור במעמד מגנטי למשך דקה אחת כדי לאסוף את החרוזים כנגד דופן הצינור. הסר והשליך את הסופר-נטנט.
    10. הסר את הצינור מהמעמד המגנטי והוסף 1 מ"ל של חיץ שטיפת מלח נמוך לצינור. פיפטה בעדינות לערבב. הניחו את הצינור במעמד מגנטי למשך דקה אחת כדי לאסוף את החרוזים כנגד דופן הצינור. הסר והשליך את הסופר-נטנט.
    11. חזור על שלב 3.2.10 עבור שלוש כביסות בסך הכל. לאחר השטיפה הסופית, הסר את הצינור מהמדף המגנטי, והשהה מחדש את החרוזים בנפח ההתחלתי של חיץ שטיפת מלח נמוך (50 מיקרוליטר לדגימה).
    12. מעבירים את החרוזים השטופים המרחפים (50 μL) לתערובת דגימת האנטיגן/נוגדנים, ודגרים ב-4°C למשך הלילה תוך כדי סיבוב במיקסר מקצה לקצה. דגרו על דגימות הקלט המסתובבות מקצה לקצה ב-4°C למשך הלילה כדי לשמור על תנאים שווים.
    13. לאחר הדגירה בלילה, הסר את הצינורות מהמסובב, והפרד את החרוזים המגנטיים עם ריבוזומי המטרה / RNA (חלק חיובי) מהסופרנאטנט (שבר שלילי) באמצעות המעמד המגנטי למשך 2.5-3 דקות. שאפו את החלק השלילי, הניחו אותו בצינור עגול טרי של 2 מ"ל, והניחו אותו בצד על קרח תוך כדי עיבוד החלק החיובי.
    14. הוסף 500 μL של חיץ שטיפת מלח גבוה (משלב 3.1.5) לצינור עם החלק החיובי, ופיפטה עדינה כדי לערבב. הניחו את הצינור על מעמד מגנטי שנשמר על קרח למשך דקה אחת כדי להפריד בין החרוזים. השליכו את הסופרנטנט, והוציאו את הצינור מהמגנט.
    15. חזור על שלב 3.2.14 עבור שלוש כביסות בסך הכל. לאחר השטיפה הסופית, יש להשהות מחדש את החרוזים ב-350 מיקרוליטר של חיץ RNA ליזה בתוספת 3.5 מיקרוליטר של 2-מרקפטואתנול (BME). דוגרים על הצינורות בטמפרטורת החדר תוך ערבוב במשך 10 דקות ב-900 סל"ד בשייקר דיגיטלי.
    16. הפרידו את החרוזים מהתמיסה שמכילה כעת את ריבוזום/רנ"א המטרה עם מעמד מגנטי למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאסוף את החלק החיובי המדולל (supernatant) בצינור טרי 1.5 מ"ל, ולהוסיף 350 μL של 100% אתנול. הפוך כדי לערבב. המשך לבידוד RNA.
    17. אופציונלי: כדי לבודד RNA מדגימת הקלט (שלב 3.2.5) ומחלק שלילי (שלב 3.2.13), העבר 100 μL של הקלט ושברים שליליים לצינורות טריים של 1.5 מ"ל. הוסף 350 μL של חיץ RNA lysis בתוספת 3.5 μL של BME לכל דגימה. הפוך כדי לערבב. מוסיפים 250 μL של 100% אתנול לכל צינור, והופכים כדי לערבב. המשך לבידוד RNA.
  3. בידוד RNA
    1. העבר 700 μL של החלק החיובי, ולחלופין, את הקלט ו / או החלק השלילי לעמודת ספין RNA. עקוב אחר הוראות היצרן כדי לבודד RNA מעמודת הסחיטה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סכמה של פרוטוקולי TRAP ו-INTACT מוצגת באיור 1. כאן הספציפיות של מודל העכבר Cyp17-NuTRAP לתאי סטרומה/תקה בשחלות מודגמת על ידי הדמיה אימונופלואורסצנטית ו-RNA-Seq מ-RNA מבודד TRAP. ראשית, בוצעה הדמיה אימונופלואורסצנטית של אות eGFP בשחלה ולוקליזציה של אות eGFP לתאי התקה והסטרומה. בקצרה, 5 מקטעים מיקרומטר היו deparaffinized עם xylene ו אתנול הדרגתי. לאיתות eGFP טוב יותר, חלבון ה-eGFP הוכתם באמצעות נוגדן ראשוני נגד GFP עז ונוגדן משני נגד חמור אלקסה 488, והגרעינים הוכתמו ב-DAPI15<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכבר NuTRAP מודל6 הוא גישת תיוג מהונדס רבת עוצמה לחקירה זוגית של התמליל והאפיגנום מסוגי תאים ספציפיים שניתן להתאים לכל סוג תא עם מנהל התקן Cre זמין. כאן, אנו מדגימים את הספציפיות של מודל העכבר Cyp17-NuTRAP בהתמקדות בתאי תקה וסטרומה בשחלות. ניתן להשתמש במודל Cyp17-NuTRAP כדי להבהיר עוד יותר את המנגנונים האפיגנטיים הספציפיים לתאי תקה וסטרומה המעורבים בהזדקנות השחלות, סרטן ומחלות.

בעת בחירת מנהל התקן Cre, מומלץ לאמת את ספציפיות התא של ביטוי NuTRAP בתיווך Cre באמצעות מספר ג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), קרן BrightFocus (M2020207) וקרן הבריאות הפרסביטריאנית. עבודה זו נתמכה בחלקה גם על ידי פרס MERIT I01BX003906 ופרס תוכנית הערכת ציוד משותף (ShEEP) ISIBX004797 מארה"ב (ארה"ב) המחלקה לענייני חיילים משוחררים, שירות מחקר ופיתוח מעבדה ביו-רפואית. המחברים רוצים גם להודות למרכז הגנומיקה הקלינית (OMRF) ולמתקן הליבה של הדימות (OMRF) על הסיוע והשימוש במכשירים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.1 מ' ספרמידיןסיגמא-אולדריץ'05292-1ML-F
1 מ' MgCl2Thermo ScientificAM9530G
10% NP-40Thermo Scientific85124
100 מ"ג/מ"ל ציקלוהקסימידסיגמא-אולדריץ'C4859-1ML
2-מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ'M3148
30 ומיקרו; מסננת תאים M Miltenyi Biotec130-098-458
כל הכנת DNA / RNA מיני ערכתQiagen80204
נוגדן נגד GFPAbcamAb290עבור TRAP ו- IHC (ארנב פוליקלונלי ל- GFP)
מאגר RLTQiagen79216RNA מאגר ליזה בפרוטוקול
cOmplete, מיני, מעכב פרוטאז ללא EDTA טבליתRoche11836170001להומוגניזציה של TRAP
דגם עכבר Buffer Cyp17iCreמעבדת ג'קסון28547B6; SJL-Tg(Cyp17a1-icre)מגנט AJako/J
DynaMag-2Invitrogen12321D
Genotyping PrimersIDTCustomGeneric Cre - פרוטוקול מעבדת ג'קסון 22392, פריימרים: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
         Cyp17iCre - פרוטוקול מעבדת ג'קסון 30847, פריימרים: 21218, 31704, 31705, 35663
         NuTRAP - פרוטוקול מעבדת ג'קסון 21509, פריימרים: 21306, 24493, 32625, 32626
קוקטייל מעכב פרוטאז עצור (100X)Thermo Scientific1861278עבור מאגר NPB
M-280 Streptavidin Dynabeads Invitrogen11205D2.8 ומיקרו; M קוטר חרוז
MixMateEppendorf5353000529
ערכת בידוד גרעינים: Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNuc101מכיל מאגר ליזיס גרעינים ומאגר אחסון גרעינים
1 M HEPESGibco15630-080
5 M NaClThermo ScientificAM9760G
2M KClThermo ScientificAM9640G
0.5 מ' EDTAThermo ScientificAM9260G
0.5 מ' EGTAFisher Scientific50-255-956
דגם עכבר NuTRAPמעבדת ג'קסון29899B6; 129S6-GT (ROSA) 26Sortm2 (CAG-NuTRAP) Evdr / J
Pierce DTT ללא משקל פורמטThermo ScientificA39255
חלבון G DynabeadsThermoFisher10004Dעבור TRAP
RNaseOUTInvitrogen10777019
נתרן הפריןפישר מדעיBP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5Invitrogen15567-027
מסובב צינור VWRפישר סיינטיפיקNC9854190

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
  3. Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239(2022).
  4. Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591(2008).
  5. Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
  6. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  7. Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693(2020).
  8. Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
  9. Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570(2022).
  10. Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931(2022).
  11. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).
  12. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  13. Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
  14. Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973(2013).
  15. Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851(2020).
  16. Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
  17. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5(2020).
  18. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
  19. Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
  20. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049(2017).
  21. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  22. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  23. Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
  24. Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
  25. Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824(2018).
  26. Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
  27. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66(2021).
  28. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77(2016).
  29. Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
  30. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  31. Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307(2020).
  32. Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72(2016).
  33. Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
  34. Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
  35. Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
  36. Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
  37. Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NuTRAPINTACTRNA

מאמרים קשורים