הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אקס ויוו הרחבה ומניפולציה גנטית של תאי גזע המטופויטיים של עכברים בתרביות מבוססות אלכוהול פוליוויניל

4.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64791

⸱

10 בפברואר 2023

 ,  , 
1MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, University of Oxford

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מוצג כאן פרוטוקול לייזום, תחזוקה וניתוח של תרביות תאי גזע המטופויטיים של עכברים באמצעות הרחבה מבוססת אלכוהול פוליוויניל ex vivo , כמו גם שיטות למניפולציה גנטית שלהם על ידי התמרה לנטיווירלית ואלקטרופורציה.

תקציר

תאי גזע המטופויטיים רב-פוטנטיים המתחדשים מעצמם (HSC) הם סוג תא חשוב בשל יכולותיהם לתמוך בהמטופוייזה לאורך כל החיים ולבנות מחדש את מערכת הדם כולה לאחר ההשתלה. HSCs משמשים קלינית בטיפולי השתלת תאי גזע, המייצגים טיפול מרפא למגוון מחלות דם. יש עניין רב הן בהבנת המנגנונים המווסתים את פעילות HSC והמטופויזיס, והן בפיתוח טיפולים חדשים מבוססי HSC. עם זאת, התרבית היציבה וההתרחבות של HSCs ex vivo היוו מחסום מרכזי בחקר תאי גזע אלה במערכת אקס ויוו טרקטיבית. לאחרונה פיתחנו מערכת תרבית מבוססת אלכוהול פוליוויניל שיכולה לתמוך בהרחבה ארוכת טווח ובקנה מידה גדול של HSCs עכברים מושתלים ושיטות לערוך אותם גנטית. פרוטוקול זה מתאר שיטות לתרבית ומניפולציה גנטית של HSCs עכברים באמצעות אלקטרופורציה והתמרה לנטיוויראלית. פרוטוקול זה צפוי להיות שימושי למגוון רחב של המטולוגים ניסיוניים המעוניינים בביולוגיה של HSC והמטופואזיס.

מבוא

המערכת ההמטופויטית תומכת במגוון תהליכים חיוניים ביונקים, החל מאספקת חמצן ועד לחימה בפתוגנים, דרך סוגי דם מיוחדים ותאי חיסון. ייצור דם רציף (hematopoiesis) נדרש לתמיכה בהומאוסטזיס של מערכת הדם, אשר נתמך על ידי תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs)1. התא ההמטופויטי הפרימיטיבי ביותר הוא תא גזע המטופויטי (HSC), בעל יכולות ייחודיות להתחדשות עצמית והתמיינות רב-שושלות 2,3. זוהי אוכלוסיית תאים נדירה, המצויה בעיקר במח עצם4 הבוגר, שם הם מופיעים בתדירות של אחד בלבד לכל 30,000 תאים. מאמינים כי HSCs תומכים בהמטופויזה לכל החיים ועוזרים לבסס מחדש את ההמטופויזה לאחר לחץ המטולוגי. יכולות אלה גם מאפשרות ל-HSCs לבנות מחדש ביציבות את כל המערכת ההמטופויטית לאחר השתלה במושתל מוקרן5. זה מייצג את ההגדרה הפונקציונלית של HSC וגם מהווה את הבסיס המדעי לטיפול השתלת HSC, טיפול מרפא למגוון מחלות דם וחיסון6. מסיבות אלה, HSCs הם מוקד עיקרי של המטולוגיה ניסיונית.

למרות מיקוד גדול של מחקר, זה נשאר מאתגר להרחיב ביציבות HSCs ex vivo7. לאחרונה פיתחנו את מערכת תרבית ההרחבה הראשונה לטווח ארוך ex vivo עבור HSCsעכבר 8. הגישה יכולה להרחיב את HSCs להשתלה פי 234-899 על פני תרבית של 4 שבועות. בהשוואה לגישות חלופיות, השינוי העיקרי בפרוטוקול היה הסרת אלבומין בסרום והחלפתו בפולימר סינתטי. אלכוהול פוליוויניל (PVA) זוהה כפולימר אופטימלי עבור תרביות HSC8 של עכבר, אשר שימש כעת גם לתרבית סוגי תאים המטופויטיים אחרים9. עם זאת, פולימר נוסף בשם Soluplus (פוליוויניל caprolactam-אצטט-פוליאתילן גליקול שתל קופולימר) זוהה גם הוא לאחרונה, אשר נראה כי הוא משפר את הרחבת HSC השבט10. לפני השימוש בפולימרים, אלבומין בסרום בצורה של סרום בקר עוברי, אלבומין בסרום בקר V, או אלבומין בסרום רקומביננטי, אך אלה תמכו באופן מוגבל בהרחבת HSC ותמכו רק בתרבית ex vivo לטווח קצר (~ 1 שבוע)7. עם זאת, יש לציין כי פרוטוקולי תרבות HSC השומרים על HSC במצב שקט יכולים לתמוך בזמן תרבות ex vivo ארוך יותר11,12.

בהשוואה לשיטות תרבית אחרות, יתרון מרכזי של תרביות מבוססות PVA הוא מספר התאים שניתן לייצר ומשך הזמן שניתן להשתמש בפרוטוקול כדי לעקוב אחר HSCs ex vivo. זה מתגבר על כמה חסמים בתחום ההמטולוגיה הניסויית, כגון המספר הנמוך של HSCs לבודד לכל עכבר (רק כמה אלפים) ואת הקושי לעקוב אחר HSCs לאורך זמן in vivo. עם זאת, חשוב לזכור כי תרבויות אלה מעוררות את התפשטות HSC, בעוד שמאגר ה- HSC in vivo הוא בעיקר שקט במצב יציב13. בנוסף, למרות שהתרביות סלקטיביות עבור HSCs, סוגי תאים נוספים מצטברים עם התרביות לאורך זמן, ותאי HSC להשתלה מייצגים רק אחד מכל 34 תאים לאחר חודש אחד. תאי אב מיאלואידים המטופויטיים נראים כסוג התא המזהם העיקרי בתרביות HSC אלה8. אף על פי כן, אנו יכולים להשתמש בתרביות אלה כדי להעשיר עבור HSCs מאוכלוסיות תאים הטרוגניות (למשל, c-Kit+ מח עצם HSPCs14). הוא תומך גם בהתמרה או אלקטרופורציה של HSCs למניפולציה גנטית14,15,16. כדי לסייע בזיהוי HSCs מאוכלוסיית HSPC בתרבית הטרוגנית, CD201 (EPCR) זוהה לאחרונה כסמן HSC שימושי ex vivo 10,17,18, כאשר HSCs הניתנים להשתלה מוגבלים לשבר CD201+CD150+c-Kit+Sca1+שושלת.

פרוטוקול זה מתאר שיטות ליזום, לתחזק ולהעריך תרביות הרחבת HSC עכבר מבוססות PVA, כמו גם פרוטוקולים למניפולציה גנטית בתוך תרבויות אלה באמצעות אלקטרופורציה או התמרה וקטורית לנטיויראלית. שיטות אלה צפויות להיות שימושיות עבור מגוון של המטולוגים ניסיוניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים, כולל גידול והמתת חסד, חייבים להתבצע במסגרת הנחיות מוסדיות ולאומיות. הניסויים המפורטים להלן אושרו על ידי משרד הפנים הבריטי. עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה של כל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת פתרונות מלאי

  1. פתרון מלאי PVA
    1. קח 50 מ"ל של מים באיכות תרבית רקמה בבקבוק זכוכית קטן (מתאים autoclaving). מחממים את המים כמעט לרתיחה במיקרוגל.
    2. שוקלים 5 גרם אבקת PVA ומוסיפים למים.
      הערה: מומלץ להמיס רק 1-5 גרם PVA. המסת כמויות גדולות יותר עלולה לגרום לבנייה מחדש חלקית.
    3. סוגרים היטב את המכסה ומנערים לערבוב. לאחר מכן, שחררו את המכסה.
      הערה: היזהר בעת פתיחה מחדש, מכיוון שהלחץ עשוי להשתנות עקב טמפרטורת המים המשתנה.
    4. Autoclave ולאפשר להתקרר. סוגרים היטב את המכסה ומנערים לערבוב. הפוך aliquots צינורות סטריליים לאחסן עד 3 חודשים ב 4 ° C.
  2. להמיס ציטוקינים ליופיליים בתווך F-12 המכיל 1 מ"ג/מ"ל PVA. לבנות מחדש את גורם תאי הגזע ל 10 מיקרוגרם / מ"ל ואת thrombopoietin ל 100 מיקרוגרם / מ"ל כדי לייצר 1:1,000 מלאי. הפוך aliquots צינורות סטריליים לאחסן לטווח ארוך ב -80 ° C. לחלופין, לאחסן את aliquots ב 4 ° C עד 1 שבוע.
    הערה: הימנע מבנייה מחדש של ציטוקינים באלבומין בסרום בקר עקב ההשפעה השלילית על התרחבות HSC של עכבר.

2. מיצוי מח עצם HSC והעשרת c-Kit+

  1. נתחו את עצם הירך, הטיביאס, האגן ועמוד השדרה מעכברי C57BL/6 טריים בני 8-12 שבועות (באמצעות חנקCO2 ו/או נקע צוואר הרחם) והניחו את העצמות ב-PBS על קרח.
    הערה: ודא שהמשטחים והכלים מעוקרים עם 70% אתנול.
  2. נקו את העצמות באמצעות מגבוני משימה עדינים ללא מוך, הסרת שרירים וחוט שדרה, והוסיפו למכתש עם ~3 מ"ל PBS.
    הערה: ודא שהמזיק והטיט מעוקרים עם 70% אתנול ולאחר מכן נשטפים פעם אחת עם PBS.
  3. מרסקים את העצמות עם המזיק ללא שחיקה כדי למזער את כוחות הגזירה. לפרק שברי מח עצם גדולים המשתחררים לתוך PBS באמצעות מחט 19 G המחוברת מזרק 5 מ"ל. העבר את תרחיף התא דרך מסנן 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
  4. לאחר העברת המתלים, חזרו על הפעולה עם PBS טרי עד שהעצמות מולבנות ולא נראה מח. כוון לנפח קצה של ~30 מ"ל לעכבר ו~50 מ"ל לשני עכברים.
  5. מערבבים את תאי מח העצם, אוספים 10 מיקרוליטר תאים, וסופרים באמצעות תמיסה של טורקס בדילול של 1:10-1:20 עם המוציטומטר.
    הערה: עכבר אחד צפוי להניב 2-5 × 108 תאי מח עצם שלמים.
  6. יש לסובב ב-450 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C, להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-PBS קר (350 μL לעכבר אחד או 500 μL לשני עכברים).
  7. הוסף 0.2 μL של נוגדן allophycocyanin (APC) anti-c-Kit לכל 10 מיליון תאים ודגור במשך 30 דקות בחושך ב 4 ° C.
  8. הוסף 5 מ"ל של PBS קר לתאים המודגרים כדי לשטוף נוגדנים עודפים ולסנן דרך מסנן 50 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי טרי 15 מ"ל.
  9. לשטוף את הצינור המקורי עם 7 מ"ל של PBS קר ולהעביר דרך המסנן. אם מתרחשת סתימת מסנן, גרד את משטח המסנן עם קצה P1000.
  10. יש לסובב ב-450 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C, להשליך את הסופר-נטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-PBS קר (350 μL לעכבר אחד או 500 μL לשני עכברים).
  11. הוסף 0.2 μL של microbeads anti-APC לכל 10 מיליון תאים ודגור במשך 15 דקות בחושך ב 4 ° C. הוסיפו 12 מ"ל של PBS סטרילי כדי לשטוף עודפי מיקרו-חרוזים.
  12. סובב את התאים ב 450 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C והשהה מחדש ב 2 מ"ל של PBS קר. בזמן שהתאים מסתובבים בשלב זה, המשך לשלב 2.13.
  13. התכוננו להעשרת עמודים על ידי הצבת עמוד סינון מגנטי לתוך מגנט של מפריד עמודים מגנטי, עם מסנן 50 מיקרומטר למעלה וצינור חרוטי 15 מ"ל מתחת.
  14. הפעל 3 מ"ל של PBS סטרילי דרך מסנן 50 מיקרומטר ועמודת סינון. לאחר שה-PBS עבר, העבירו את תרחיף התא דרך העמודה, ואחריו שלוש שטיפות של 3 מ"ל PBS קר בכל פעם. עבור כל כביסה, המתן עד שהעמוד יפסיק לטפטף לפני הוספת הכביסה הבאה.
  15. הסר את העמוד מהמגנט והנח אותו על גבי צינור טרי של 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של PBS קר, הכנס את בוכנה העמודה על העמודה, ומחק את התאים על ידי דחיפת הבוכנה.
  16. מערבבים את התאים המועשרים ב-c-Kit, אוספים 10 μL של תאים, וסופרים באמצעות תמיסה של Türks בדילול של 1:2 עם המוציטומטר. התפוקה האופיינית של עכבר אחד היא 2-5 × 106 תאי c-Kit+ .
    הערה: בשלב זה, ניתן לזרוע את התאים ישירות לתוך מדיה HSC או להכין לטיהור תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות HSC (FACS).

3. ייזום תרביות תאים עם HSPCs מועשרים ב-c-Kit

  1. הכינו מדיום טרי (טבלה 1) למספר התאים/בארות הדרושים. זרעו 0.5-1 מיליון תאים למ"ל עבור HSPCs מועשרים ב-c-Kit.
  2. סובבו מטה את התאים המועשרים ב-c-Kit והשהו מחדש בתווך HSC בצפיפות התאים הרצויה.
  3. העבירו את התאים ללוחות מצופים פיברונקטין או טעוני משטח שליליים, ב 200 μL לכל צלחת 96 באר או 1 מ"ל לכל צלחת 24 באר.
  4. מקמו את התאים באינקובטור תרבית רקמה המוגדר לטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2.

4. ייזום תרביות תאים עם HSCs מטוהרים FACS

  1. הכינו נפח מתאים של כתם נוגדני השושלת הביוטינילציה: 3 מיקרוליטר תערובת מאסטר (טבלה 2) לכל 10 מיליון תאים, מדולל 1:100 ב-PBS.
  2. סובבו מטה את התאים המועשרים ב-c-Kit והשהו מחדש את כתם נוגדני השושלת למשך 30 דקות ב-4°C.
  3. יש לשטוף עם 10 מ"ל PBS סטרילי ולסחור מטה ב 450 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  4. הכינו נפח מתאים של כתם נוגדן HSC טרי (טבלה 3): 300 μL לכל 10 מיליון תאים. לצד צביעת דגימה זו, הכינו דגימות מתאימות לבקרת צביעה לצורך פיצוי וגידור.
    הערה: יש לעבוד בתרבית רקמה עם אור כבוי בעת שימוש בנוגדנים מצומדים.
  5. יש להשהות מחדש את התאים בכתם נוגדן HSC ולדגור בטמפרטורה של 4°C למשך 90 דקות. ערבבו את התאים כל 20-30 דקות על ידי הקשה כדי למנוע כדורי תאים.
  6. יש לשטוף עם 10 מ"ל של PBS סטרילי ולסובב כלפי מטה ב 450 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  7. שאפו את הסופרנטנט, העבירו את הגלולה כדי לשבש, והשהו מחדש ב-PBS סטרילי עם 0.5 מיקרוגרם/מ"ל פרופידיום יודיד (PI).
  8. הכינו תווך טרי (טבלה 1) למספר הבארות הדרוש, והכניסו לצלחת פיברונקטין או ללוחות טעוני משטח שליליים (200 מיקרוליטר לצלחת של 96 בארות או 1 מ"ל לצלחת של 24 בארות).
  9. הכן את מכונת FACS למיון ומיון CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- HSCs ישירות לבארות המכילות מדיה (ראה איור 1 עבור אסטרטגיית FACS gating סטנדרטית המשמשת כאן). מיין עד 200 תאים לכל צלחת 96 באר באר או עד 1,000 תאים לכל צלחת 24 באר היטב.
    הערה: מכונות FACS צריכות להיות מופעלות על-ידי מדען מיומן. מומלץ למשתמשים ליצור קשר עם מתקן FACS המקומי שלהם כדי לדון באסטרטגיית מיון זו אם הם אינם מנוסים בבידוד FACS של HSC עכברים.

5. ביצוע שינויי מדיה

  1. עבור תרביות תאים שיוצרו מתאים מועשרים ב-c-Kit, יש להתחיל בשינויי מדיה לאחר יומיים. עבור תרביות תאים שמקורן ב-HSC שבודדו ב-FACS, יש להתחיל בשינויי מדיה לאחר 5 ימים.
  2. הכינו מספיק מדיום HSC טרי שחומם מראש (~ 37 מעלות צלזיוס) (טבלה 1) לכל הבארות.
  3. מוציאים בעדינות את הצלחת מאינקובטור תרבית הרקמות.
    הערה: מכיוון שלוחות HSPC על לוחות טעונים במשטח שלילי מופרעים בקלות רבה יותר מאלה שעל פיברונקטין יש לנקוט משנה זהירות בעת החלפת המדיום על לוחות טעונים במשטח שלילי כדי למנוע הפרעה לתרביות התא.
  4. בעזרת פיפטה או משאבת ואקום, הסירו באיטיות ~90%-95% מהתווך מהמניסקוס של הבאר.
    הערה: הימנע מציור המדיום מבסיס הבאר, אחרת תאים רבים יוסרו.
  5. מוסיפים לבאר 200 μL (לצלחות של 96 בארות; 1 מ"ל לצלחות של 24 בארות) של מדיום טרי.
  6. מחזירים את הצלחת לאינקובטור תרבית הרקמות.
  7. חזור על שלבים 5.1-5.6 כל 2-3 ימים עד לנקודת הסיום של הניסוי.
  8. עבור תרביות תאים שיוצרו עם HSPCs מועשרים ב-c-Kit (סעיף 3), יש לפצל את התרביות ביחס של 1:2-1:3 לאחר ~3 שבועות. עבור תרביות תאים שהחלו עם HSCs מטוהרים FACS (סעיף 4), לפצל את התרביות ביחס של 1:2-1:3 לאחר ~ 3 שבועות וכאשר התרביות הן >90% במפגש.
    הערה: ציר הזמן המדויק יהיה תלוי בתחומי העניין של הניסוי. תרבויות אלה מאופיינות במשך 4-8 שבועות8, אך אורכי תרבות נוספים עשויים להיות אפשריים.

6. אלקטרופורציה של HSPCs בתרבית

הערה: פרוטוקול זה מיועד לאלקטרופורציה של Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP), אך ניתן להתאים אותו לאלקטרופורציה של mRNA או חלבונים רקומביננטיים אחרים. ליזום תרביות עם מספר מספיק של תאים על מנת לבצע זאת בנקודת הזמן הרצויה לניסוי.

  1. בצע שינוי בינוני יום אחד לפני ההתחשמלות, כמתואר בסעיף 5.
    הערה: מומלץ לבצע לפחות תרבית לילה לפני התחשמלות. עם זאת, תאים בדרך כלל בתרבית במשך 1-3 שבועות לפני ההתמרה.
  2. ביום ההתחשמלות, להקים את nucleofector. הפעל את המכשיר. במסך המגע, בחר את מודול X ולאחר מכן את גודל הקובט שבו נעשה שימוש.
  3. הכינו תמיסת P3 מספקת (על פי הוראות היצרן) לסולם האלקטרופורציה (100 מיקרוליטר לקובט או 20 מיקרו-קובטה) ואפשרו שיווי משקל לטמפרטורת החדר.
  4. הכינו מספיק מדיום טרי (טבלה 1) למספר הבארות המצופות והוסיפו 500 מיקרוליטר מדיום לבאר צלחת בת 24 בארות או 100 מיקרוליטר מדיה לבאר צלחת בת 96 בארות.
  5. הפשירו את sgRNA (מדולל ל-2 מיקרוגרם/מ"ל במים נטולי RNase) על קרח וערבבו 16 מיקרוגרם של sgRNA עם 30 מיקרוגרם של אנזים Cas9 (ב-10 מיקרוגרם/מ"ל) בצינור PCR סטרילי. כלול צינור PCR נוסף המכיל חלבון Cas9 בלבד כבקרה. מערבבים על ידי הזזת הצינור, ואז מסתובבים לזמן קצר. לדגור ב 25 ° C במשך 10 דקות thermocycler כדי מורכב RNP, ולאחר מכן לשמור את הצינורות על קרח.
    הערה: ניתן להקטין זאת פי חמישה אם מבצעים אלקטרופורציה במיקרו-קוביות.
  6. מערבבים ומעבירים את HSPCs לאלקטרופורציה לתוך צינור; לאסוף 10 μL של התאים ולספור באמצעות תמיסה של Türks בדילול של 1: 2 עם hemocytometer.
    הערה: מומלץ לחשמל 1-5 מיליון תאים לקובט של 100 מיקרוליטר (מוקטן פי חמישה עבור המיקרוקובטה).
  7. סובב כלפי מטה את תאי המספר המתאימים בצינור של 1.5 מ"ל ב- 450 × גרם למשך 5 דקות ב- 4 ° C. שאפו כמה שיותר מהסופרנאטנט והשהו מחדש עם 100 מיקרוליטר של חיץ נוקלאופקציה.
  8. העבירו את תרחיף התא מיד לתוך צינור ה-PCR המכיל את ה-RNP והפיפטה המורכבים מעלה ומטה באיטיות כדי לערבב בעדינות ולהעביר לקובט אלקטרופורציה של 100 מיקרוליטר. מוציאים את התערובת לתוך הקובטה לאט ובתנועה נוזלית אחת כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בקובט.
  9. על electroporator, לבחור את המיקום של הבארות להיות electroporated. באמצעות מסך המגע, בחר את סוג התא תוכנית CD34+, אנושי, או הקלד את קוד הדופק EO100. לחץ על OK לחצן.
  10. מעבירים את הקוביות לאלקטרופורטור. לחץ על לחצן התחל במסך המגע כדי להתחיל אלקטרופורציה. מיד לאחר אלקטרופורציה, להוסיף 500 μL של מדיום התרבית לקובט (100 μL אם משתמשים microcuvette).
  11. מעבירים בעדינות את התאים לצלחת המוכנה ומחזירים לאינקובטור תרביות הרקמה.
  12. עבור הליכים המשתמשים בתבנית תורם AAV6, הוסף את הווקטור מיד לאחר העברת התאים לצלחת מצופה פיברונקטין בריכוז של 5,000 וקטורים / תא.
  13. לאחר 6-18 שעות, הכינו מדיום טרי ובצעו שינוי בינוני כמתואר בסעיף 5. עבור שינוי בינוני זה, להסיר רק 80%-90% של המדיום.
    הערה: הימנעו מציור המדיום מבסיס הבאר.
  14. נתח את התאים לפי ציטומטריית זרימה לאחר יומיים או יותר (ראה סעיף 8 לפרטים).
  15. המשך לבצע שינויים בינוניים כל יומיים, כמתואר בסעיף 5, עד שתגיע לנקודת הסיום של הניסוי.
    הערה: קצבי העריכה של CRISPR/Cas9 בשיטה זו מסתמכים במידה רבה על יעילות המיקוד של sgRNA המתוכנן. שיעורי עריכה של עד 95% נצפו עם מדריךיעיל 15. הנחיות לתכנון sgRNA פורטו בעבר במקומות אחרים19,20.

7. המרת HSPCs בתרבית עם וקטור לנטיויראלי

הערה: ליזום תרביות עם מספר מספיק של תאים, כדי לבצע זאת בנקודת הזמן הרצויה לניסוי.

  1. צור וקטור lentiviral titer (בהתאם למטרות הניסוי). הפשירו וקטור לנטיויראלי על קרח.
  2. לבצע שינוי בינוני (כמו בסעיף 5); לאחר מכן, מערבבים ומעבירים את HSPCs להתמרה לתוך צינור. לאסוף 10 μL של התאים ולספור באמצעות תמיסה של Türks בדילול של 1: 2 עם hemocytometer.
    הערה: ניתן להמיר תאים מיד לאחר הציפוי. עם זאת, תאים בדרך כלל בתרבית במשך 1-3 שבועות לפני ההתמרה.
  3. להחזיר את המינון הנדרש של תאים להתמרה (בדרך כלל 100,000 תאים לכל צלחת 96 באר). בנפרד, צלחת תאי בקרה שליליים un-transmed.
    הערה: אם אתה משתמש בלוחות טעוני משטח שליליים, העבר את התאים ללוחות מצופים פיברונקטין לצורך התמרה וקטורית לנטיויראלית.
  4. הוסף וקטור לנטיויראלי לכל באר תאים: הוסף 20 יחידות התמרה לכל תא כדי להשיג יעילות ~ 30% התמרה . עם זאת, לקבוע את מינון וקטור lentiviral באופן אמפירי, בהתאם לדרישות הניסוי.
    הערה: ודא שהווקטור הלנטיויראלי מסולק בהתאם להנחיות המוסדיות.
  5. להחזיר את התאים לאינקובטור תרבית הרקמה למשך 6 שעות. לאחר מכן, בצע שינוי בינוני כמתואר בסעיף 5.
    הערה: הסופרנאטנט מכיל וירוס חי. יש להשליך בהתאם להנחיות המוסדיות.
  6. נתח את התאים לפי ציטומטריית זרימה (למשל, עבור ביטוי GFP) לאחר יומיים או יותר. ראה סעיף 8 לפרטים.
  7. המשך לבצע שינויים בינוניים כל יומיים, כמתואר בסעיף 5, עד שתגיע לנקודת הסיום של הניסוי.

8. ניתוח ציטומטרי זרימה של תרביות HSPC

  1. הכינו תערובת נוגדנים מרוכזת מסוג ex vivo HSC בתרבית ב-PBS המכילה 2% FBS (טבלה 4). אחסנו את התערובת ב-4°C בחושך למשך עד חודש אחד.
    הערה: יש לעבוד בתרבית רקמה עם אורות כבויים בעת שימוש בנוגדנים מצומדים.
  2. הוסף 2 μL של תערובת נוגדנים מרוכזת ל 50 μL של תאים. יש לדגור במשך 30 דקות ב-4°C צלזיוס בחושך. לצד צביעת דגימה זו, הכינו דגימות מתאימות לבקרת צביעה לצורך פיצוי וגידור.
  3. הוסף 200-1,000 μL של PBS המכיל 2% FBS וצנטריפוגה ב 450 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר כמה שיותר supernatant והשהה מחדש ב 100-500 μL של PBS המכיל 2% FBS ו 0.5 מיקרוגרם / מ"ל PI.
  4. הגדר את ציטומטר הזרימה ורשום לפחות 10,000 תאים חיים לכל דגימה.
    הערה: ציטומטרים של זרימה צריכים להיות מופעלים על ידי מדען מיומן. על המשתמשים ליצור קשר עם מתקן FACS המקומי שלהם כדי לדון בניתוח זה אם הם אינם מנוסים בציטומטריית זרימה.
  5. ייצא את הנתונים בפורמט FCS ונתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה מתאימה. ראו איור 2 לאסטרטגיית ה-gating הסטנדרטית שבה משתמשים כאן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עבור טיהור FACS של HSCs, אנו מצפים שבתוך מח העצם המועשר ב-c-Kit, ~0.2% מהתאים הם אוכלוסיית CD150+CD34-c-Kit+Sca1+שושלת עבור עכברי C57BL/6 צעירים (בני 8-12 שבועות) (איור 1). עם זאת, סביר להניח כי עכברים טרנסגניים או עכברים בגילאים שונים מציגים תדרי HSC שונים. לאחר 4 שבועות של תרבית, אנו מצפים שהשבר CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-fraction יהיה ~10% (איור 2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מקווים כי פרוטוקול זה מספק גישה שימושית לחקור ביולוגיה HSC, hematopoiesis, והמטולוגיה באופן כללי יותר. מאז הפיתוח הראשוני של שיטת התרבית מבוססת PVA עבור HSCsמטוהרים FAC 8, השיטה הורחבה. לדוגמה, השיטה הוכחה כעובדת עם c-Kit מועשר במח עצם ועם לוחות טעונים במשטח שלילי14. תאימותו עם התמרה ואלקטרופורציה הוכחה גם14,15. ניתן למצוא את האימות in vivo של תרביות HSC ו- c-Kit+ HSPC אלה בפרסומים אלה, בעוד שהקוראים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים ל-WIMM Flow Cytometry Core על הגישה לציטומטריית זרימה, ול-WIMM Virus Screening Core על יצירת וקטורים לנטיויראליים. עבודה זו מומנה על ידי קרן קיי קנדל ללוקמיה והמועצה הבריטית למחקר רפואי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת <חזק>ציוד
דיסקציהפישר סיינטיפיק12764416
המוציטומטראפלטון וודס בע"מHC002
P3 תא ראשוני 4D-נוקלאופקטור X ערכתLonza V4XP-3024
עלי וטיטציוד מעבדה מדעית בע"מX18000
מפריד QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
<חזק>חומרים
5 מ"ל מזרקVWR International Ltd720-2519
19 G מחטVWR בינלאומי בע"מ613-5394
50 μ מסננת תאים MSysmex04-004-2317
70 μ m מסננת תאיםCorning431751
Kimtech מגבוניםVWR International Ltd115-2075
LS MACS columnMiltenyi Biotec130-042-401
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μ gIDT 
גורם תאי גזע רקומביננטי של עכברים ללא בעלי חיים PeprotechAF-250-03
טרומבופויטין עכבר רקומביננטי ללא בעלי חייםPeprotechAF-315-14
נגד עכבר CD117 APC (שיבוט: 2B8)ThermoFisher17-1171-83
נגד עכבר CD117 BV421 (שיבוט: 2B8)Biolegend105828
נגד עכבר CD127  APC/Cy7 (שיבוט: A7R34)Biolegend135040
נגד עכבר CD127 ביוטין (שיבוט: A7R34)Biolegend135006
נגד עכבר CD150 PE/Cy7 (שיבוט: TC15-12F12.2)Biolegend115914
נגד עכבר CD201  APC (שיבוט: eBio1560)ThermoFisher17-2012-82
נגד עכבר CD34 FITC (שיבוט: RAM34)ThermoFisher11-0341-85
נגד עכבר CD4  APC/Cy7 (שיבוט: RM4-5)ביוטין
(שיבוט: RM4-5)Biolegend100508
נגד עכבר CD45R  APC/Cy7 (שיבוט: RA3-6B2)Biolegend103224
נגד עכבר CD45R ביוטין (שיבוט: RA3-6B2)Biolegend103204
נגד עכבר CD48 BV421 (שיבוט: HM48-1)Biolegend103428
נגד עכבר CD8 ביוטין (שיבוט: 53-6.7)Biolegend100704
נגד עכבר CD8a  APC/Cy7 (שיבוט: 53-6.7)Biolegend100714
נגד עכבר Ly6G/Ly6C  APC/Cy7 (שיבוט: RB6-8C5)Biolegend108424
נגד עכבר Ly6G/Ly6C ביוטין (שיבוט: RB6-8C5)Biolegend108404
נגד עכבר Sca1 PE (שיבוט: D7)Biolegend108108
נגד עכבר Ter119  APC/Cy7 (שיבוט: TER-119)Biolegend116223
אנטי-עכבר Ter119 ביוטין (שיבוט: TER-119)Biolegend116204
לוחות CellBIND, 24 בארותCorning3337טעונים על פני השטח
, 96-well קורנינג3330משטח שלילי טעון
sgRNA סינטטי מותאם אישית Synthego, Sigma Aldrich, IDTמותאמת אישית
סרום בקר עובריMerck Life Science UK LimitedF7524-50ML
צלחות מצופות פיברונקטין, 96 בארותBD Biosciences354409
תערובת התזונה F-12 של HamGibco11765054
אינסולין-טרנספרין-סלניום-X (100x)Gibco51500.056
מי מלח חוצץ פוספטאלפא AesarJ61196.
פוליוויניל אלכוהולSigma AldrichP8136
Propidium IodideEnzo Life Sciences (UK) LtdEXB-0018
Streptavidin APC/Cy7Biolegend405208
Tü RKS' פתרוןסיגמא אולדריץ'109277
וירקוןמטלר-טולדו בע"מ95015662
1081058 CD4 נגד עכבר Biolegend 100526 לוחות CellBIND הזמנה AP

מקורות

  1. Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  2. Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
  3. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
  4. Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
  5. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  6. Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
  7. Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
  8. Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
  9. Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
  10. Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
  11. Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
  12. Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938(2021).
  13. Aal Wilson,, et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
  14. Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568(2021).
  15. Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686(2021).
  16. Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
  17. Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502(2022).
  18. Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
  19. Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
  20. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
  21. Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
  22. Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תרבית פוליויניל אלכוהולמיצוי מחית עצםטרנסדוקציה לנטיביריליתטכניקת אלקטרופורציההעשרה של c-Kitמיון מופעל פלואורסצנציההשתלת תאי גזע
אקס ויוו הרחבה ומניפולציה גנטית של תאי גזע המטופויטיים של עכברים בתרביות מבוססות אלכוהול פוליוויניל
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.