הכנה וקטורית לנטיויראלית לאפנון יעיל של גנים ומיקרו-רנ"א של מקרופאגים שוכנים ברקמת חלל הצפק in vivo בעכברים

סיכום

אנו מדגימים פרוטוקול שלב אחר שלב לחקר תפקוד גנים במקרופאגים שוכנים ברקמת הצפק in vivo, באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים.

תקציר

למקרופאגים המתגוררים ברקמת הצפק יש תפקידים נרחבים בשמירה על הומאוסטזיס והם מעורבים בפתולוגיות בתוך רקמות מקומיות ושכנות. תפקידיהם מוכתבים על ידי רמזים מיקרו-סביבתיים; לכן, חיוני לחקור את התנהגותם בנישה פיזיולוגית in vivo . כיום, מתודולוגיות ספציפיות הממוקדות במקרופאגים פריטוניאליים משתמשות במודלים טרנסגניים של עכבר שלם. כאן מתואר פרוטוקול לאפנון יעיל in vivo של mRNA ומיני RNA קטנים (למשל, microRNA) במקרופאגים פריטוניאליים באמצעות חלקיקי לנטיוירוס. תכשירי לנטיוירוס נעשו בתאי HEK293T וטוהרו על שכבת סוכרוז אחת. אימות In vivo של יעילות לנטיוירוס לאחר הזרקה תוך צפקית גילה זיהום דומיננטי של מקרופאגים המוגבלים לרקמה מקומית. התמקדות במקרופאגים פריטוניאליים הייתה מוצלחת במהלך הומאוסטזיס ודלקת צפק הנגרמת על ידי תיוגליקולט. נדונות מגבלות הפרוטוקול, כולל דלקת ברמה נמוכה הנגרמת על ידי אספקה תוך צפקית של לנטיוירוס ומגבלות זמן לניסויים פוטנציאליים. בסך הכל, מחקר זה מציג פרוטוקול מהיר ונגיש להערכה מהירה של תפקוד גנים במקרופאגים פריטוניאליים in vivo.

מבוא

מקרופאגים תושבי רקמות (Mφ) הם אוכלוסייה הטרוגנית של תאי חיסון פגוציטיים החשים ומגיבים לפתוגנים פולשים ^1,2. בנוסף, הם ממלאים תפקיד חיוני בפיתוח רקמות, שיפוץ ושמירה על הומאוסטזיס ^1,3. רקמות רבות Mφ נובעות מאבות שק החלמון במהלך האמבריוגנזה ומתמידות ברקמה לאורך כל החיים ^4,5. הפנוטיפ והפונקציות של תאים אלה מוכתבים על ידי אינטראקציות שיתופיות והיררכיות של גורמי שעתוק ספציפיים והמיקרו-סביבה המקומית 6,7,8,9. הבנה הולכת וגוברת של תלות זו מגבירה את הצורך בשיטות יעילות in vivo למניפולציה גנטית של Mφ בתוך הנישה הרלוונטית מבחינה פיזיולוגית.

וקטורים לנטי-ויראליים הם כלי נפוץ למניפולציה של חומצות גרעין באוכלוסיות תאים ספציפיות in vivo 10,11,12, במיוחד בשל יכולתם להדביק תאים מתחלקים ולא מתחלקים ולהשתלב ביציבות בגנום המארח^13,14. במהלך שני העשורים האחרונים, טכנולוגיית העברת lentivirus עברה אופטימיזציה, ומעטפות חלופיות ומקדמים סינתטיים נחקרו כדי להגדיל את מיקוד ספציפי לשושלת ^8,15. בשל הטרופיזם הרחב של התא, גליקופרוטאין מעטפת וירוס סטומטיטיס שלפוחית הרחם (VSV-G)^16,17 הפך למעטפת "תקן הזהב" המשמשת בטכנולוגיית lentivirus.

בפרוטוקול^{זה 18}, חלקיקים לנטי-ויראליים פסאודו-טייפ של VSV-G משמשים להדגמת העברה ממוקדת ויעילה של RNA קצר סיכת שיער (shRNA) ומיקרו-רנ"א (miR) לעכבר Mφ (pMφ) in vivo, במצב יציב¹⁹. ביטוי טרנסגנים הונע על ידי מקדם וירוס יצירת מוקד הטחול (SFFV). זיהום פרודוקטיבי של תאים הוגדר על ידי ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (GFP) שמקורו בלנטיוירוס. השימוש בגישה זו איפשר קריאה קלה לניסויי in vivo lentivirus כדי להגדיר את המינון האופטימלי ואת מסגרת הזמן של הניסוי. לבסוף, אתגר לנטיויראלי in vivo של עכברים במהלך דלקת הנגרמת על ידי תיוגליקולט חשף את הנטייה הטבעית לזיהום pMφ סלקטיבי.

פרוטוקול

כל עבודת בעלי החיים בוצעה בהתאם להנחיות המוסדיים ומשרד הפנים הבריטי.

הערה: כל מחקרי in vivo עם lentivirus צריכים להתבצע על פי הנחיות מקומיות ולאומיות לגבי שימוש אתי בבעלי חיים במחקר, כמו גם שמירה על כל התקנות הקשורות לשימוש בחומרים זיהומיים בקטגוריה II. כמו כן, יש לפקח על רווחת בעלי החיים בהתאם לתקנות המקומיות. בשלב זה של הפרוטוקול, יש לנקוט משנה זהירות בעבודה עם חלקיקים וחדים לנטי-ויראליים.

1. הכנת תאי HEK293T לטרנספקציה

הערה: בצע שלבים אלה תחת ארון בטיחות ביולוגי של תרבית רקמה סטרילית.

1. הכינו את מדיום הנשר המעובד (cDMEM) המלא של דולבקו לתאי HEK293T על ידי שילוב של 450 מ"ל DMEM עם 10% (v/v) נסיוב עגל עוברי (50 מ"ל) וריכוז סופי של 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין.
2. הפשיר תאי HEK293T לפחות שבוע לפני הטרנספקציה המתוכננת. לשמור על תנאי גידול בריאים ולעבור כל 2-3 ימים באמצעות טריפסין + EDTA כדי לנתק את התאים מן הצלוחית.
3. יום אחד לפני הטרנספקציה, שאפו בזהירות את מדיום הגידול מהתאים ושטפו בעדינות תאים עם DPBS סטרילי. הוסיפו 1-5 מ"ל טריפסין לבקבוק ודגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של 5% CO₂ למשך 2-5 דקות.
4. הוסף 5-10 מ"ל של cDMEM ולסובב את התאים ב 350 x גרם במשך 5 דקות. הסר את הנוזל להשעות מחדש את גלולת התא ב 10 מ"ל של cDMEM. לספור את התאים ואת הזרע 10-11 x 10⁶ קיימא HEK293T תאים לכל בקבוק T175 ב 20 מ"ל של cDMEM.
5. דגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של 5%_CO2 למשך הלילה כדי לאפשר לתאי HEK293T להגיע למפגש של 70%-80%.
6. למחרת, לאשר את המפגש של תאים תחת מיקרוסקופ אור.
7. הסר את המדיה מן הבקבוק עם פס סרולוגי 25 מ"ל מבלי להפריע monolayer התא.
8. מוסיפים בעדינות 10 מ"ל של DPBS ומנדנדים את הצלחת כדי לשטוף את התאים, תוך הקפדה לא להפריע למונושכבה של התא.
9. הסר DPBS עם פס סרולוגי 25 מ"ל.
10. הוסף 15 מ"ל של cDMEM חדש על הקיר לכל בקבוק T175 כדי לא להפריע monolayer התא, ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור ב 37 ° C.

2. טרנספקציה של תאי HEK293T באמצעות מגיב טרנספקציה שומנים שאינם ליפוזומליים

1. בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, הכינו את המרכיבים הלנטיויראליים: 2 מיקרוגרם פלסמיד לנטיויראלי, 1.5 מיקרוגרם pΔ8.91 (pCMV-Δ8.91) ו-1 מיקרוגרם pMD2.G (pCMV-MD2.G) עם Buffer EC (ערכת מגיב טרנספקציה) לנפח סופי של 600 מיקרוליטר.
2. הוסף 36 μL של תמיסת משפר. ערבבו את הרכיבים באמצעות פיפטה של 1 מ"ל על ידי שאיבה חוזרת ונשנית של חלק מהנוזל והחזירו טיפה אחר טיפה ישירות על התמיסה הנותרת. השאירו למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
3. מוסיפים 120 μL של מגיב transfection ומערבבים כנ"ל בערך 20 פעמים. דגירה במשך 10 דקות ב- RT.
4. מוסיפים 5.2 מ"ל cDMEM ומערבבים כנ"ל עם פסים סרולוגיים 5 מ"ל.
5. בעזרת פיפטת העברה חד פעמית, מוסיפים את תערובת הטרנספקציה ישירות על חד-שכבה של תאי HEK293T (תוך הימנעות מדפנות הבקבוק), ומפזרים את התערובת בנקודות שונות בצלוחית.
6. מפזרים את הפלסמיד על ידי נדנוד עדין של הבקבוק מצד לצד. יש להימנע מחדירת נוזלים למכסה הבקבוק.
7. לדגור את הבקבוק ב 37 ° C ב 5% CO₂ אינקובטור במשך 48 שעות. לאשר transfection יעיל של תאים HEK293T על ידי הופעת סמן פלואורסצנטי, כאן GFP, בתוך 24 שעות של transfection מנוטר תחת מיקרוסקופ הדמיה תא פלואורסצנטי.
   הערה: עבור מבנים ללא סמן פלואורסצנטי, תאים HEK293T חייבים להיבדק לנוכחות גן הסמן המשומש או על ידי שינוי ביטוי בגן / חלבון מעניין על ידי טכניקות מתאימות, למשל, qPCR. לחלופין, ניתן לאמת בעקיפין טרנספקציה מוצלחת במהלך בדיקת אוסף הלנטיוירוס על תאי Jurkat בשלבים מאוחרים יותר של הפרוטוקול על ידי הטכניקות לעיל.
   זהירות: תאי HEK293T נגועים נחשבים זיהומיים, ויש לנקוט אמצעי זהירות מתאימים בעת הטיפול בתאים אלה. יש לעקוב אחר כללים מקומיים, אשר יכולים לכלול בדרך כלל עבודה תחת ארון בטיחות ביולוגי קטגוריה II, שימוש בכפפות כפולות, ותמיסת טיהור מתאימה לחיטוי, למשל, ריכוז מוגבר של אקונומיקה פסולת (2,000 ppm) או פתרון שווה ערך על פי הנחיות בטיחות ביולוגית מוסדיות. יש לחטא את כל התמיסות והפלסטיק הבאים במגע עם תכשיר לנטיוירוס בהתאם לנוהלי בטיחות ביולוגית מוסדיים.

3. אוסף של חלקיקים lentiviral

1. הכינו תמיסת טיהור, תמיסת אקונומיקה (נתרן היפוכלוריט) בריכוז גבוה (2,000 ppm) או חומר שווה ערך בהתאם להנחיות בטיחות ביולוגית מוסדיות בדלי והניחו אותה בארון הבטיחות הביולוגי.
2. הכינו את ארון הבטיחות הביולוגי על ידי הסרת פריטים עודפים, כגון מתלי צינורות ריקים וכו'.
3. יש לסמן מראש צינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל לכל בקבוק תאי T175 HEK293T ולהסיר את המכסה מצינור הצנטריפוגה. הניחו את הצינורות במדף יציב.
4. שלפו את הבקבוק מהאינקובטור ואשרו ביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם לייזר של 488 ננומטר (איור 1A). עוצמת האות תלויה ביעילות הטרנספקציה של ההליך ובמבנים המשומשים.
5. אספו את המדיה מהתאים לתוך צינור הצנטריפוגה 50 מ"ל המסומן מראש. הטה את T175 HEK293T בקבוק עם תאים נגועים כך המדיום נאסף בפינה התחתונה של הצלוחית. באמצעות פס סרולוגי 25 מ"ל, לאסוף את המדיום מבלי להפריע monolayer התא. תאים צפים מסוימים עשויים להיות גלויים בשלב זה. מעבירים את המדיום לצינור צנטריפוגה נקי של 50 מ"ל וסוגרים את המכסה.
   1. באמצעות פס סרולוגי 25 מ"ל, להוסיף 25 מ"ל של cDMEM טרי וחם לצלוחית. הקפידו לכוון את הזרימה המדיום על דפנות הבקבוק כדי לא להפריע לחד-שכבה של התא. להחזיר את הבקבוק עם תאי HEK293T נגועים לאינקובטור (37 ° C, 5% CO₂).
      הערה: ניתן לבצע אוסף שני של lentivirus וטיהור נוסף לאחר 24 שעות נוספות בעקבות ההליך המתואר בשלבים לעיל.
6. כאשר איסוף lentivirus הושלם לאחר 24 שעות או 48 שעות, להוסיף פתרון טיהור לתאים, להבטיח שהוא מכסה את monolayer התא. שמור את הבקבוק אופקי למשך 24 השעות הבאות, ולאחר מכן השליך אותו בהתאם לתקנות קטגוריה II המתאימות.

4. טיהור של lentivirus

1. סנן איסוף בינוני משלב 3.5.
   1. הסר את הבוכנה מהמזרק 50 מ"ל והכנס מסנן סטרילי פוליאתר קושר חלבון נמוך או פוליווינילידן פלואוריד 0.45 מיקרומטר לקצה המזרק. באמצעות פס סרולוגי 25 מ"ל, מוסיפים את המדיום שנאסף משלב 3.5.1 למזרק ומחזירים בעדינות את הבוכנה.
   2. דחפו את התקע באיטיות כדי להעביר את המדיום דרך המסנן לתוך צינור צנטריפוגה טרי של 50 מ"ל. אם הזרימה פוחתת באופן משמעותי, מקמו את המזרק כשהמסנן מצביע כלפי מעלה ומשכו את הבוכנה מספיק כדי לנקות את המדיום מהמסנן.
   3. בזהירות, להחליף את המסנן על מזרק עם אחד חדש להיפטר המסנן בשימוש בתמיסת טיהור. המשך סינון בינוני. בסיום, לטהר את המסנן ואת המזרק על ידי השקעת המסנן ומילוי המזרק בתמיסת הטיהור.
2. קררו מראש את האולטרה-צנטריפוגה על ידי הגדרת הטמפרטורה ל-4°C וסגרו את המכסה כדי לאפשר לטמפרטורה להתאקלם.
3. הוסף 3 מ"ל של תמיסת 20% סוכרוז (20% w/v במים טהורים במיוחד, סינון מעוקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר) לתחתית צינור אולטרה-צנטריפוגה חרוטי.
4. באמצעות פס סרולוגי 25 מ"ל, כיסוי מדיום מסונן על גבי שכבת הסוכרוז, נזהר לא להפריע את השכבות.
   1. השתמש בהגדרת המהירות הנמוכה ביותר בילד פיפטה. סובבו את צינור האולטרה-צנטריפוגה החרוטי לכ-45° והוסיפו באיטיות את התווך המסונן המכיל לנטיוירוס משלב 4.1 לדופן הצינור. ודאו שהמדיום והסוכרוז אינם מתערבבים, ונראה הפרדה ברורה בין השכבות (איור 1B). ככל שנפח השכבה הבינונית גדל, הטו באיטיות את צינור האולטרה-צנטריפוגה חזרה למצב זקוף.
5. אם הנפח הכולל, כולל הסוכרוז והמדיום, בצינור האולטרה-צנטריפוגה קטן מ-29 מ"ל, מלאו ב-cDMEM טרי כדי למנוע את קריסת הצינור במהלך הסיבוב. עבור אוספי T175 מ"ל מרובים, ערבבו תכשירים בינוניים מסוננים והשתמשו במספר צינורות אולטרה-צנטריפוגה. מלא את צינור האולטרה-צנטריפוגה הסופי בתווך לפי הצורך.
6. ודא כי דליי אולטרה צנטריפוגות נקיים; אין שאריות בינוניות בתחתית הדלי או בכובעים. במידת הצורך, יש לנגב עם ~70% אלכוהול. שימו מתאמי צינור מתאימים בתחתית כל דלי (איור 1C) והורידו בעדינות את צינורות האולטרה-צנטריפוגות לתוך הדליים.
7. סגור היטב את הדליים ותלה אותם על החללים שהוקצו ברוטור המסתובב.
8. ודאו שהדליים מאוזנים עם אותם נפחים של סוכרוז ומדיום. אסור להפעיל רוטור מסתובב ללא דליים, אף על פי שדליים יריבים עשויים להישאר ריקים²⁰ (איור 1D).
9. בזהירות להכניס את הרוטור לתוך ultracentrifuge ולהפעיל את האבק. הגדר את קצב ההאצה וההאטה של אולטרה-צנטריפוגות להגדרה הנמוכה ביותר, והפעל את מכיני ה- lentivirus ב- 85,000 x g למשך 90 דקות ב- 4 °C.
10. המתן עד שהאולטרה-צנטריפוגה תגיע למהירות הנדרשת (כ-3-5 דקות) לפני שתתרחק כדי לוודא שהרוטור מוכנס כראוי והסחרור לא יסתיים.
11. בזמן שהאולטרה-צנטריפוגה פועלת, נקו את סביבת העבודה בהתאם לדרישות הבטיחות בקטגוריה II והכינו את החלל לשלבים הבאים.
12. כאשר הסחרור מסתיים, השבת את הוואקום והסר בזהירות את הרוטור כדי לא להפריע לדגימות.
13. חקור את האולטרה-צנטריפוגה לאיתור דליפות וודא שאין דליפות מהדליים. במקרה של שפיכה, הכפפה כפולה לטהר את הצנטריפוגה ואת פני השטח החיצוניים של דליים עם מוצרים אנטי ויראליים.
14. הוציאו את הדליים מהאולטרה-צנטריפוגה והעבירו בזהירות את הדליים לארון הבטיחות הביולוגי בקטגוריה II.
    הערה: חלקיקי לנטיוירוס נאספים בתחתית צינור האולטרה-צנטריפוגה. הגלולה אינה נראית לעין בלתי.
15. יוצקים את הסוכרוז והמדיום בתנועה חלקה אחת ישירות למיכל הפסולת עם תמיסת הטיהור.
16. שמירה על צינור ultracentrifuge הפוך, להעביר אותו לשכבה כפולה של רקמה ולהשאיר אותו להתייבש במשך 10 דקות. בינתיים, נגבו את החלק הפנימי של הדליים עם רקמות ספוגות מים וייבשו באוויר הפוך.
17. בזהירות לייבש את כל הנוזל שנותר משפת צינור ultracentrifuge עם רקמה לפני להפוך אותו זקוף. יש לחטא את הרקמה ואת פני השטח שמתחתיה.
18. יש להשהות מחדש את גלולת הנגיף ב-1 מ"ל של מדיה או תמיסה נטולת סרום הדרושה לניסויים נוספים על ידי פיפטציה עדינה של התמיסה מעלה ומטה. השאירו אותו למשך 15 דקות ב-RT בתוך ארון הבטיחות לביולוגיה בקטגוריה II.
19. ערבבו בעדינות את תכשירי הלנטיוירוס באמצעות פיפטה של 1 מ"ל לפני שתכנסו לצינורות עליונים בורגיים של 1.5 מ"ל (למשל, צינוריות קריו). הכן את aliquots עבור עבודה in vivo (ריבוי של 100 μL) ועבור titer lentivirus בתאי Jurkat T (1 x 20 μL) (ראה שלב 5).
20. הימנע מחזורי הקפאה-הפשרה; תכשירים lentiviral ניתן לאחסן ב -80 ° C עד 6 חודשים ללא השפעה שלילית על זיהומיות.

5. טיטרציה של ייצור lentivirus בתאי Jurkat T

1. הכינו מדיום שלם של Roswell Park Memorial Institute 1640 (cRPMI-1640) עבור תאי Jurkat T על ידי השלמת 500 מ"ל של RPMI-1640 עם 10% (v/v) נסיוב עגל עוברי וריכוז סופי של 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין.
2. כדי להבטיח תרבית בריאה של תאי Jurkat T, לשמור על התאים בתרבית עד שבוע לפני ההדבקה.
3. ביום הטיטרציה של הלנטיוירוס, צלחת החוצה תאי Jurkat T קיימא בצלחת 24 בארות ב 2 x 10⁵ תאים / באר ב 200 μL לכל באר של cRPMI-1640.
4. השתמש lentivirus שנאסף טרי או להפשיר את בקבוקון lentivirus המכיל 20 μL על קרח ולערבב בעדינות על ידי pipeting למעלה ולמטה.
5. באמצעות דילול סדרתי ב- cRPMI-1640, להדביק תאי Jurkat T עם 0.25 μL, 0.5 μL, 1 μL, 2.5 μL, 5 μL, ו 10 μL של מלאי lentivirus. נענע בעדינות את הצלחת כדי להבטיח הפצה שווה של lentivirus. תאי Jurkat T שאינם נגועים משמשים כבקרה שלילית.
6. לדגור את הצלחת ב 37 ° C. לאחר 4 שעות, מלא כל באר עם cRPMI לנפח כולל של 400 μL. להחזיר את הצלחת לאינקובטור ב 37 ° C למשך 3 ימים.
7. לאחר 48 שעות לאחר ההדבקה, יש לאשר את ביטוי ה-GFP תחת מערכת הדמיה פלואורסצנטית.
8. 3 ימים לאחר ההדבקה, לאסוף כל באר של צלחת 24 באר לתוך צינורות איסוף נפרדים 1.5 מ"ל צנטריפוגה את התאים ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
9. השליכו את הסופרנטנט. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-300 μL של 2% פרפורמלדהיד (PFA) מוכנה ל-2% (w/v) ב-DPBS ולהשאיר אותה למשך 15 דקות על קרח בחושך.
10. צנטריפוגה את התאים ב 350 x גרם ב 4 ° C למשך 5 דקות ולהשהות מחדש את הגלולה במאגר מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) (DPBS סטרילי + 4% FCS + 1 mM EDTA סטרילי).
11. נתחו את תדירות ביטוי ה-GFP ואת העוצמה הפלואורסצנטית הממוצעת של הלנטיוירוס הנגוע ותאי הבקרה שלו באמצעות ציטומטריית זרימה (איור 2).

6. זיהום In vivo lentivirus של מקרופאגים פריטוניאליים תושבי רקמות

1. בארון בטיחות ביולוגי בקטגוריה II, יש להעמיס מחטי אינסולין בנפח כולל של 200 μL של אמצעי מדיה ללא סרום המכילים את הכמות הנדרשת של לנטיוירוס (השתמש במחטים חד פעמיות, 30 גרם לרווחת בעלי החיים וכדי למנוע אובדן נוזלים במחט).
2. הניחו את נדן המחט בחזרה על המחט בטכניקת כף מדידה ביד אחת. שמור את המחט על קרח והזריק תוך 30 דקות.
3. במתקן לבעלי חיים, התקינו ארון בטיחות ביולוגי בקטגוריה II לפני הזרקות (איור 1E).
   1. הניחו יריעה של טישו נקי. שחררו את הנדן על מחט האינסולין המכילה לנטיוירוס.
   2. הכינו צלחת פטרי המכילה חתיכות קטנות של רקמה וחומר חיטוי על בסיס גלוקונאט כלורהקסידין, צינור 50 מ"ל המכיל תמיסת טיהור (תמיסת אקונומיקה של 2,000 ppm) ומיכל חד ובטוח.
4. לרסן את העכבר על ידי אחיזת העור בעורף²¹. עכבר מרוסן כראוי אינו נייד, וזה נדרש לבטיחות.
5. כאשר הבטן פונה כלפי מעלה, כוונו את ראשה של החיה מעט כלפי מטה. להזריק את lentivirus Intraperitoneally לתוך הרביע הימני התחתון של חלל הבטן. זאת כדי למנוע הזרקה לכל איברי חלל הצפק.
6. לפני שחרור העכבר, מלא את המזרק בתמיסת טיהור והשליך אותו בבטחה בתיבה הבטוחה החדה.
7. נגבו את אתר ההזרקה על בטנו של העכבר ברקמה ספוגה בחומר חיטוי והחזירו את החיה לכלוב.
8. אחסנו את העכבר המוזרק לנטיוירוס בסקנטינר מקטגוריה II או בכלובים מאווררים בנפרד (IVC) (כלובים מבודדים עם סינון אוויר ביעילות גבוהה) למשך 72 שעות לפחות לאחר ההזרקה. הניחו כרטיס מידע מתאים בחזית הכלוב.
9. העבר את העכבר לקטגוריה החדשה I מחזיק כלוב לאחר 72 שעות לאחר ההדבקה, בהתאם לאישורי בטיחות מקומיים. יש לעקוב אחר עכברים מדי יום במשך 3 ימים מההזרקה.

7. איסוף תאי צפק מעכבר נגוע בלנטיוירוס

אזהרה: עבור אוספים בטווח של 72 שעות לאחר הזרקת לנטיוירוס, פעל בהתאם לכללי הבטיחות הביולוגית המוסדיים בקטגוריה II. מצעים וכלוב החזקה שבו הוחזקו בעלי חיים נגועים ב-72 השעות הראשונות לאחר הזרקת הלנטיוירוס חייבים לעבור טיהור בהתאם לכללי הבטיחות הביולוגיים המוסדיים בקטגוריה II.

1. המתת חסד של עכברים בהתאם לתקנות מוסדיות, למשל, על ידי שאיפת ריכוז הולך וגובר של_CO2, ולאחר מכן אישור מוות על ידי נקע צוואר הרחם.
2. נקה את הבטן של העכבר עם 70% isopropanol בזהירות לחתוך את העור כדי לחשוף את קרום חלל הצפק.
3. שטפו את חלל הצפק עם 6 מ"ל של חיץ FACS קר כקרח באמצעות מזרק 10 מ"ל ומחט 23 גרם. הימנע ניקוב כל איברים.
4. עסו בעדינות את הצפק כדי לעקור תאים למאגר FACS.
5. לאסוף את נוזל הצפק באמצעות מזרק ומחט אותו.
6. הסר את המחט והעבר את התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
7. שמור את שטיפות הצפק על קרח.
8. לאסוף איברים נדרשים אחרים ולאחסן אותם בהתאם למחקר.
9. יש להשליך פגרי בעלי חיים בהתאם להנחיות המקומיות בנושא בעלי חיים ובטיחות.

8. צביעה וניתוח של תאי הצפק

1. צנטריפוגה את שטיפת הצפק ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות, להשליך את supernatant בתמיסת טיהור, ולהשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מאגר FACS.
2. ספרו את התאים שנאספו ואת הצלחת 4 x 10⁵ תאים לכל באר בצלחת V תחתונה 96 בארות.
3. בצע צביעת כדאיות באמצעות מגיב הניתן לתיקון (לדוגמה, ערכת צביעת תאים מתים הניתנת לתיקון קרוב לאינפרא-אדום המשמש כאן) בהתאם להוראות היצרן.
4. אם תאים נדבקו במהלך 72 השעות האחרונות, תקן את התאים ב- 2% PFA למשך 15 דקות על קרח. הוסף נפח שווה של DPBS קר וצנטריפוגה שוב ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
5. הכינו את המאגר החוסם: ערבבו נוגדנים 4 מיקרוגרם/מ"ל 2.4G2 בסרום חולדות של 10% (v/v) בחיץ FACS לצביעת פני השטח או בחיץ חלחול לצביעה תוך תאית.
6. יש להשהות מחדש כל באר המכילה גלולת תא ב-50 מיקרוליטר של חיץ חוסם ולדגור בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות.
7. הכינו תערובת נוגדנים ב-50 מיקרוליטר של חיץ FACS (לצביעה על פני השטח) או בחיץ חדירה (לצביעה תוך-תאית) לכל דגימה. נפח הצביעה הסופי עבור כל דגימה יהיה 100 μL, כולל 50 μL של חיץ חוסם. חישוב ריכוזי הנוגדנים בהתאם (טבלה 1).
8. הוסף 50 μL של תערובת נוגדנים לדגימות ו 50 μL של בקרת איזוטיפ ומאגר בקרה כדי לשלוט דגימות. דגרו על הדגימות במשך 30 דקות על קרח בחושך. כלול תאים לא מוכתמים ופקדי איזוטיפ לפי הצורך.
9. שטפו היטב כל באר עם 100-200 מיקרוליטר של DPBS קר כקרח וצנטריפוגה את הצלחת ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. חזור על שלב זה כדי לשטוף נוגדנים לא קשורים. נתח את הדגימות על ציטומטר זרימה.

9. מיצוי תאים מאיברים

1. הכינו 1 מ"ל של תערובת עיכול לכל איבר: ערבבו את תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS), 2 מ"ג/מ"ל קולגנאז מסוג IV ו-0.03 מ"ג/מ"ל DNase I (כולל 1.5 מ"ג/מ"ל היאלורונידאז לעיכול ריאות).
2. מעבירים את האיבר שנאסף ל 1 מ"ל של תערובת העיכול וטוחנים אותו במספריים.
3. סנן את התאים דרך מסננת 40 מיקרומטר וצנטריפוגה ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
4. אם מבודדים תאים מהריאה, הטחול או הכבד, ליז תאי דם אדומים באמצעות מאגר ACK lysis (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM Na₂EDTA pH = 7.4). סנן את התאים דרך מסננת 40 מיקרומטר וצנטריפוגה ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
5. לצבוע ולנתח את התאים כמתואר בסעיף 8.

תוצאות

כאשר מתבצע באופן מלא ונכון, פרוטוקול זה מניב סך של 1.5 מ"ל של מלאי לנטיוירוס באיכות גבוהה לכל תכשיר יחיד, מספיק עבור שתים עשרה זריקות in vivo בנפח האופטימלי שנקבע במחקר זה¹⁸. ניתן להעריך את הצלחת הטרנספקציה בשלב מוקדם של הפרוטוקול. תאי HEK293T בריאים וקולפים צריכים להציג, אם הם קיימים בפלסמידים, אות סמן שניתן לזהות בקלות (למשל, GFP המשמש במחקר זה) לאחר 48 שעות לאחר התפשטות פלסמיד (איור 1A). העוצמה הנמוכה של האות, ניתוק יתר של תאים ומפגש נמוך בשלבים המוקדמים של הפרוטוקול עלולים להצביע על מוות תאי ולגרום לתפוקה נמוכה של הכנת הלנטיוירוס. חלק מניתוק התאים לפני איסוף אופציונלי II (שלב 3.5.1.) גלוי וצפוי.

שלושה פלסמידים משמשים בפרוטוקול זה ליצירת חלקיקי לנטיוירוס: pCMV-ΔR8.91 אריזת פלסמיד המקודד חלבון HIV-1 מבני (Gag), חלבוני עזר Tat ו- Rev, ופולימראז שעתוק הפוך (Pol)²²; pMD2.G קידוד מעטפת VSV-G תחת מקדם CMV¹³; ופלסמיד pHR'SIN-cPPT-SEW (קידוד סמן GFP משופר)¹⁹ שונה בהתאם לביטוי shRNA או microRNA.

תכשירי Lentivirus הם titrated בקו תאי Jurkat T בשל זיהומיות גבוהה שלהם²³. הכנה מוצלחת של לנטי-וירוס תשיג שיעור הדבקה של יותר מ-95% במינון קטן כמו 5 מיקרוליטר (איור 2A). העוצמה הפלואורסצנטית הממוצעת של התאים הנגועים ממשיכה לעלות עם המינונים הגבוהים יותר (איור 2B,C). במידת הצורך, ניתן למדוד טיטרים נגיפיים באמצעות PCR בזמן אמת של רכיבים נגיפיים משולבים, למשל מקדם SFFV, אשר נמצא בקורלציה ליניארית עם אחוז התאים המבטאים GFP ולוגריתמית עם GFP MFI (איור 2D). בהתאם למבנה, במיוחד אלה עם תוספת^{גדולה 24}, חלק מתכשירי הלנטיוירוס יכולים להציג זיהומיות מופחתת בתאי Jurkat T, כפי שהודגם עבור מבנה Cre-GFP ששימש במחקר זה (איור 2E,F). במקרה כזה, תכשירים מרובים של חלקיקי lentivirus יכול להיות משולב resuspended ב 1 מ"ל. אנו ממליצים לאמת את התגובה החיסונית לתכשירים אלה in vivo לפני הניסויים. באופן טבעי, תכשירי לנטיוירוס עם קולטני כניסה חלופיים ל- VSV-G המשמשים כאן עשויים להציג יעילות זיהום שונה בקו תאי Jurkat T, בהתאם לביטוי הקולטן על התאים. יש לבחור קווי תאים המשמשים לטיטרציה כך שיבטאו את הקולטן המשמש את חלקיקי הלנטיוירוס להיכנס לתאים ויעדיפו חוסר או ביטוי נמוך מאוד של גורמי ההגבלה²⁵.

ייצור מוצלח של חלקיקים לנטי-ויראליים מוכח גם על-ידי זיהום של pMφ (המוגדר כאוכלוסיית CD11b⁺, F4/80⁺ ו-Tim4⁺)¹⁸ (איור 3A). קבענו כי הזרקה תוך-צפקית של 100 μL lentivirus (בנפח כולל של 200 μL של מדיה נטולת סרום) מניבה את האחוז והעוצמה הגבוהים ביותר של אות GFP בתאים אלה (איור 3B,C). זריקות במינונים גבוהים יותר (150 μL ו-200 μL של הכנת לנטיוירוס) לא השפיעו לטובה על ביטוי GFP ב-pMφ. ניסויי מסלול זמן שנערכו במשך 4 שעות, 3 ימים, 7 ימים ו-14 ימים לאחר הזרקה תוך-צפקית (i.p) עם 100 μL lentivirus חשפו אחוז משמעותי של pMφ תושב המבטא GFP בימים 3 ו-7, ולאחר מכן היעלמות האוכלוסייה הנגועה ביום ה-14 (איור 3D, E). באופן מעניין, pMφ המבטא GFP נעלם לרוב ביום ה-14 שלאחר ההדבקה, בין היתר הודות לזיהוי חיסוני של סמן ה-GFP. ואכן, ניסויים בלנטי-וירוס עם סמן GFP בעכברי T-Reg סלקטיביים, Foxp3-DTR-eGFP מונעים דחייה של pMφ תושב נגוע לפחות עד היום ה-21 (איור 3F). עבור תכשירי לנטיוירוס עם יעילות מופחתת בתאי Jurkat, תידרש כמות גבוהה יותר כדי להשיג את שיעור הזיהום הצפוי in vivo. אולם כפי שהודגם עם הכנת Cre-GFP lentivirus, בהתאם לתכנון המבנה, אפילו מנה של 300 μL ב-7 ימים לאחר הזרקת i.p עשויה להניב תוצאה גרועה (איור 3G). הדגמנו בעבר שימוש מוצלח בפרוטוקול זה לביטוי יתר ולהפלה של גנים in vivo בעכבר pMφ, כולל הפלת Map3k8 ו-Gata6 בתיווך shRNA לנטי-ויראלי, וביטוי יתר של Gata6 ¹⁹. כאן, אנו מראים שניתן להשתמש בהצלחה בפרוטוקול זה גם לביטוי יתר של מיקרו-רנ"א מורין 146b (mmu-miR-146b) ולהפלה של מולקולת היצמדות בין-תאית 1 (ICAM1, CD54) באמצעות shRNA נגזר לנטי-ויראלי ב-pMφ תושב (איור 3H,I).

זיהום של תאים ראשוניים, כגון מקרופאגים, דורש קלט לנטיוירוס גבוה יותר, ככל הנראה בשל נוכחותם של גורמי הגבלה בתאים אלה. גורמי הגבלה הם מנגנוני הגנה טבעיים של תאים המפריעים לשלבי מחזור החיים של הנגיפים, כגון שעתוק לאחור או אינטגרציה, מה שמוביל לעיכוב ביטוי גנים מהמבנים.

אימות in vivo נוסף של הפרוטוקול לא הראה שום השפעה של העברת i.p lentivirus על יכולת הקיום של תאי חיסון פריטוניאליים (איור 4A) והצביע על הדבקה מובהקת של תת-אוכלוסיות pMφ תושבות (המוגדרות על-ידי ביטוי של סמני CD73 ו-Tim4) (איור 4B,C). חשוב לציין, זיהום לנטי-וירוס פרודוקטיבי הוגבל לתושב Mφ במקום ההזרקה, כפי שמעיד היעדר ביטוי GFP משמעותי בבלוטות לימפה מזנטריות (mLN), ריאות, כבד או טחול Mφ לאחר 7 ימים לאחר האתגר (איור 4D). בהתחשב בכך שבמקרים רבים, מיקוד גנטי של Mφ נדרש להתבצע בתנאים דלקתיים, חקרנו את היעילות של פרוטוקול זה בעכברים המאותגרים תוך צפקית עם 0.1 מ"ל של 4% תיוגליקולט. הזרקת תיוגליקולט מעוררת זרם של תאי Mφ ומונוציטים דלקתיים שמקורם במונוציטים שניתן לחלק ל-5 אוכלוסיות נפרדות (איור 4E). ניתוח ציטומטריית זרימה גילה פנוטיפ עקשן של תאים דמויי מונוציטים (Ly6C^hi אוכלוסיות 1 ו -2) לזיהום lentivirus, בהתאם לממצאים קודמים בתאים אנושיים²⁶. לעומת זאת, תושבים Mφ ומונוציטים (קבוצות 3-5) נותרו הרגישים ביותר לזיהום (איור 4F).

ניתוח ציטומטרי מפורט של זרימה זיהה ביטוי GFP בעיקר ב- Mφ פריטוניאלי תושב ו- Major histocompatibility complex (MHC) Class II⁺ resident pMφ (MHCII⁺ F4/80⁺ Tim4⁺) (עד 60% ביום 3 לאחר ההזרקה) (איור 5A). אות GFP מועט, אם בכלל, זוהה באוכלוסיות אחרות של תאי הצפק, כולל Mφs/DCs שמקורם במח עצם (MHCII⁺, CD11b⁺, CD11c⁺), תאי B (CD19⁺), תאי T (CD3⁺), תאי פיטום (CD11b^-, FcεR1⁺), אאוזינופילים (Siglec-F⁺), תאי NK (CD19^-, NK1.1⁺) ונויטרופילים (Ly6G⁺) (איור 5A,B). תוחלת החיים של ביטוי GFP (איור 5C) בכל האוכלוסיות עקבה אחרי זה של Mφ פריטוניאלי תושב (איור 1D). עלייה חולפת בתדירות הנויטרופילים נרשמה לאחר הזרקה של 100 μL (בנפח כולל של 200 μL של מדיה נטולת נסיוב) של lentivirus (איור 5D), מה שמצביע על דלקת קלה מוקדמת הקיימת בבעלי חיים מאותגרים. לבסוף, pMφ תושב חווה ירידה משמעותית בתדירות בין ימים 7 ו-14 לאחר ההדבקה (איור 5E), מה שמרמז על חלון הניסויים הטוב ביותר בין ימים 3 ו-7 לאחר ההזרקה.

איור 1: ייצור לנטיוירוס בתאי HEK293T. (A) תמונות אימונופלואורסצנטיות מייצגות של תאי HEK293T 48 שעות לאחר העברה מוצלחת (מיקרוסקופ פלואורסצנטי [שיא עירור 488 ננומטר, שיא פליטה של 510 ננומטר], הגדלה פי 20, סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר). (B) תצלום של צינור חרוטי אולטרה-צנטריפוגה המכיל שכבה של 20% סוכרוז (למטה, שקוף) ושכבת תווך שנאספה מתאי HEK293T נגועים (למעלה, אדום). (ג) צילום של החדרה נכונה של האולטרה-צנטריפוגה החרוטית בדלי, כולל מתאם. (D) תצלומים המראים איזון נכון ולא נכון של רוטור האולטרה-צנטריפוגה. (ה) צילום ההתקנה האופטימלית של ארון Cat II וחומרים להזרקות in vivo לאדם ימני. נתון זה שונה באישור Ipseiz N et ^al.18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: טיטרציה של לנטיוירוס בתאי Jurkat T. (A) אנליזה ציטומטרית של זרימה מייצגת של תאי Jurkat T 72 שעות לאחר ההדבקה במינונים הולכים וגדלים של לנטיוירוס המכיל פלסמיד GFP המראה את אחוז תאי GFP⁺ (GFP⁺), (B) עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת (MFI) של תאי GFP⁺ ו-(C) היסטוגרמה מייצגת של ביטוי GFP. (D) תרשים פיזור המראה MFI (שמאל Y) ואחוז התאים הנגועים בלנטיוירוס המבטא GFP (ימין Y) לעומת מספר העתק הנגיף שזוהה לכל pg של דנ"א (ציר x). (E) היסטוגרמה מייצגת של זיהום תאי Jurkat T עם הכנה ובקרה תת-אופטימלית של Cre-GFP lentivirus (Cre-GFP LV) ו-(F) המציגה את אחוז תאי Jurkat T הנגועים ב-Cre-GFP lentivirus (GFP⁺). נתון זה שונה באישור Ipseiz N et ^al.18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: יעילות הזיהום של pMФ התושב. (A) אסטרטגיית Gating של pMφ תושב (CD11b⁺, Tim4⁺, F4/80⁺) ותאי Tim4^-, F4/80⁺ . התאים היו מגודרים על סינגלט, ואחריו CD11b⁺. (B) תרשימי נקודות מייצגות, ו-(C) סיכום של תדירות ההדבקה (% תאי GFP+) והעוצמה (MFI) של תאי GFP⁺ שבודדו 3 ימים לאחר ההדבקה in vivo עם כמויות שונות של הכנת GFP lentivirus. (D) תרשים נקודות מייצג, ו-(E) סיכום של תדירות ההדבקה (% תאי GFP+) והעוצמה (MFI) של תאי GFP+ שבודדו בנקודות זמן שונות לאחר הדבקה in vivo עם 100 μL של לנטיוירוס בנפח כולל של 200 μL של מדיום מדיה ללא סרום. (F) סיכום של מספרי התאים בימים 7, 14 ו-21 לאחר אספקה תוך-פריטוניאלית של לנטי-וירוס המבטא GFP בעכברי Foxp3-DTR-eGFP המראה את מספר pMφ המבטא GFP ומקרופאגים דלקתיים ותאים דנדריטיים (InfMØs/DCs [F480^נמוך]). (n = 1-2 לקבוצה). (G) חלקת נקודה מייצגת של זיהום suboptimal in vivo של Gata6-KO ^{mye 19} תושב pMφ עם 300 μL של Cre-GFP lentivirus 7 ימים לאחר הזרקת i.p. (H) כימות RT-qPCR של ביטוי mmu-miR-146b-5p של Mφ פריטוניאלי תושב המאותגר in vivo עם 100 μL lentivirus המקודד microRNA-146b (miR-146b) או בקרה (C). תושבים pMφ (עיגולים לבנים) ותאי Tim4^-, F4/80⁺ (עיגולים אפורים). (I) תרשים נקודה מייצג של הפחתת רגולציה מוצלחת של ICAM1 על pMφ בנקבות עכברים 129S6, 7 ימים לאחר הזרקת i.p של lentivirus המכיל shRNA ממוקד. בקרת shRNA מוצגת. שכבת העל מציגה בקרת איזוטיפ. הנתונים מבוטא כממוצע ± SEM, n≥2 עכברים. נתון זה שונה באישור Ipseiz N et ^al.18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: יעילות ההדבקה של תת-אוכלוסיות pMφ תושבות. (A) אחוז מכלל התאים הבודדים ותושב Mφ בר קיימא 7 ימים לאחר הזרקת 100 μL ללא סרום (-) או הזרקת GFP lentivirus (+). (B) אסטרטגיית Gating המראה ארבע אוכלוסיות עיקריות של pMφ שנמצאו in vivo: CD73⁺Tim4⁺, CD73-Tim4^-, CD73^+Tim4-, CD73-Tim4⁺ ו-(C) תדירות ההדבקה המתאימה (% תאי GFP+) ועוצמה (MFI של תאי GFP+) של אוכלוסיות אלה. (D) אחוז תאי GFP+ באיברים מרובים 7 ימים לאחר הזרקת 100 μL lentivirus i.p. קיצורים: mLN, בלוטת לימפה mesenteric. (E) לעכברים הוזרק i.p עם 0.1 מ"ל של 4% thioglycolate במשך 5 ימים ולאחר מכן הזרקת i.p עם lentivirus. אסטרטגיית Gating של pMφ ומונוציטים פוסט 3 ימים לאחר הזרקת lentivirus i.p. (F) תדירות זיהום, MFI וניתוח מספר תאים של מונוציטים GFP+ (Ly6C⁺) ו-Mφ (Ly6C^-). הנתונים מבוטא כממוצע ± SEM, n≥3 עכברים. נתון זה שונה באישור Ipseiz N et ^al.18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: השפעת הזרקת לנטיוירוס על דלקת הצפק. עכברים הוזרקו in vivo i.p עם GFP המבטא lentivirus. (A) שכיחות ההדבקה של אוכלוסיות תאים בחלל הצפק בעקבות כמויות שונות של זריקות לנטיוירוס (50 μL, 100 μL, 150 μL או 200 μL). (B) עוצמת ביטוי GFP באוכלוסיות תאים נגועות באופן פרודוקטיבי לאחר 7 ימים לאחר הזרקת i.p. (C) שכיחות הזיהום של אוכלוסיות תאים בחלל הצפק בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת i.p. (D) ו-(E) אחוז התאים בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת i.p. כל זריקות הלנטיוירוס בוצעו באותו נפח כולל של 200 μL שהושלם על ידי מדיום מדיה ללא סרום. אלא אם כן צוין אחרת, מינון lentivirus 100 μL שימש. עכברי ביקורת ("C") קיבלו 200 μL של מדיום מדיה מסודר ללא סרום. הנתונים מבוטא כממוצע ± SEM, n≥3 עכברים. נתון זה שונה באישור Ipseiz N et ^al.18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מטרת נוגדנים	פלואורופור	שיבוט	דילול בשימוש	ריכוז סופי [מק"ג/מ"ל]
אנטיגן ליבה HIV-1	RD1	FH190-1-1	1/100	1
I-A/I-E	PerCpCy5.5	M5/114.15.2	1/400	0.5
Ly6G	PerCpCy5.5	1א8	1/400	0.5
CD3e	PerCpCy5.5	17א2	1/200	1
CD3e	PE/Cy7	500א2	1/400	0.5
CD11c	PE/Cy7	N418	1/800	0.25
CD11c	BV605	N418	1/400	0.5
CD226	AF647	10 E 5	1/400	1.25
צרפת	AF647	RTM4-54	1/600	0.83
CD4	נגמ"ש	GK1.5	1/400	0.5
CD11b	AF700	M1/70	1/700	0.71
CD11b	PerCpCy5.5	M1/70	1/400	0.5
F4/80	כחול פסיפיק	BM8	1/700	0.71
F4/80	BV605	BM8	1/400	0.25
F4/80	BV711	BM8	1/400	0.5
CD73	eFluor450	TY/11.8	1/400	2.5
CD19	V450	1D3	1/400	0.5
CD19	נגמ"ש	1D3	1/400	0.5
CD8a	eFluor450	53-6.7	1/400	0.5
SiglecF	BV421	E50-2440	1/400	0.5
NK1.1	נגמ"ש/צי7	PK136	1/400	0.5
FceR1	eFluor450	מרץ-1	1/400	0.5
ICAM1	PE	1א29	1/100	2
חולדה IgG1, בקרת איזוטיפ κ	PE		1/100	2

טבלה 1: רשימת נוגדנים

דיון

מקרופאגים שוכני רקמות מבצעים מגוון תפקודים הומיאוסטטיים ודלקתיים ספציפיים לרקמה ^1,2 המוכתבים על ידי הסביבה הפיזיולוגית שלהם ^6,7,8,9. בפרוטוקול זה, שיטה^{יעילה 18} למניפולציה של מקרופאגים תושבי הצפק in vivo באמצעות חלקיקי לנטיוירוס הוצגה כדי לחקור את תפקוד המקרופאגים במיקרו-סביבה הביולוגית שלהם.

חיוני להצלחת הפרוטוקול להשתמש בתאי HEK293T בריאים. מומלץ להפשיר את התאים לפחות שבוע לפני תחילת פרוטוקול זה כדי להבטיח התאוששות תאים ומספרים טובים. תאים צריכים להיות זרעים בנפח מתאים של בינוני יום אחד לפני transfection מתוכנן צריך להגיע כ 80% מפגש ביום של transfection. תכשירי תאים תת-או תת-נפגשים יתר על המידה יגרמו לירידה בתפוקת הלנטיוירוס. אנו ממליצים להדביק תאי HEK293T עם מגיב הטרנספקציה בהתאם להוראות היצרן לקבלת התוצאות הטובות ביותר. שלבים חיוניים של הטרנספקציה כוללים ערבוב מתאים של פלסמידים וריאגנטים והוספה טיפתית של התערובת ישירות לחד-שכבה של התא HEK293T. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה בהתמרה של סידן פוספט של תאי HEK293T^27,28. עם זאת, המשתמש צריך להיות מודע לכך האפקטיביות של שיטה זו יכולה להשתנות, וזה יכול לגרום ליעילות transfection מופחתת.

יש לשקול אמצעי בטיחות בפרוטוקול מיום העברת התא HEK293T. אלה כוללים עבודה בארון בטיחות קטגוריה II, לבישת כפפות כפולות בעת טיפול בחומר מזוהם, והלבנה מתאימה של החומר המזוהם (עם תמיסת טיהור, למשל, תמיסת אקונומיקה של 2,000 ppm) למשך 4 שעות לפחות. על המשתמשים להתייחס לתקנות המוסדיות שלהם בנוגע לעבודה עם פתוגנים ופסולת מקטגוריה II.

בפרוטוקול זה, הכנת lentivirus מטוהרת תחילה באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר כדי להסיר פסולת HEK293T התא. יש להימנע משימוש במסננים קטנים יותר (0.22 מיקרומטר) וקרומי אסטר תאית מכיוון שזה יגרום לאובדן חלקיקי לנטיוירוס. מומלץ להשתמש במסנני פוליאתר סולפון או פוליווינילידן פלואוריד קושרי חלבון נמוכים²⁹. שלב הטיהור השני מבוצע על שכבת יחיד 20% סוכרוז באולטרה צנטריפוגה כדי להסיר זיהומים שנותרו, אשר חשוב במיוחד עבור ניהול in vivo כתוצאה מכך של הכנת lentivirus. במוסדות שבהם אולטרה-צנטריפוגה אינה זמינה,³⁰ אחרים תיארו טיהור לנטיוירוס מבוסס סוכרוז באמצעות צנטריפוגת מעבדה סטנדרטית. זה יכול להיות מיושם בפרוטוקול זה כחלופה. הכנת לנטיוירוס מתוארת בתאי Jurkat T על ביטוי אות הסמן (למשל, GFP המשמש בפרוטוקול זה). עבור מבנים ללא סמנים, חלקיקי לנטיוירוס פיזיים יכולים להיות מוערכים על ידי כימות של חלבון HIV-1 p24gag על ידי ערכת ELISA³¹, ניתוח ציטומטריית זרימה של אנטיגן ליבה^{HIV-1 18}, או מדידה של השינויים בגן היעד (עדיף באמצעות שיטות המאפשרות מדידה של שינויים בתאים בודדים, למשל, ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופיה). אם הטיטרציה של הבקרה והלנטיוירוס שונה באופן משמעותי בתאי Jurkat T, ניתן להתאים את הנפחים המשמשים למחקרי in vivo כדי להגיע לזיהום הדומה ביותר בין תכשירי lentivirus.

המגבלה העיקרית של הפרוטוקול היא היעלמות נצפתה של Mφ פריטוניאלי תושב GFP⁺ תוך 14 יום מהזרקת i.p lentivirus. עבור מחקרים ארוכי טווח, קווי עכבר עם שינוי גנטי יציב בסוג תא מסוים או רקמות צריך להיחשב³². לדוגמה, מאחר שמקרופאגים פריטוניאליים אינם מבטאים Foxp3 (חלבון T-Reg), השתמשנו בעכברי Foxp3-DTR-eGFP³³ ואישרנו שהביטוי של GFP נשמר ב-Mφ פריטוניאלי 21 יום לאחר ההדבקה (איור 3F). עם זאת, חשוב לציין כי lentiviruses מכילים רכיבים זרים אחרים, והרחבה זו בהתמדה של תאים נגועים בעכברי Foxp3-DTR-GFP לא יכול להיות קבוע. חולשה נוספת של שיטה זו היא רמה נמוכה של דלקת שניתן לראות בחלל הצפק לאחר הזרקת לנטיוירוס, כפי שניתן לראות על-ידי זרם של נויטרופילים ב-4 שעות לאחר ההזרקה (איור 5D), מה שעשוי לגרום לכך שזיהומים חוזרים יאיצו את האובדן הקשור לדלקת של Mφ פריטוניאלי תושב המבטא GFP. למרות שלא זיהינו אינטרפרונים מסוג I (IFNs) בחלל הצפק, חלקיקי לנטיוירוס פסאודו-טייפ VSV-G הוכחו בעבר כגורמים לחלק מהגנים המעוררים IFN ב-Mφ אנושי בהיעדר IFN³⁴ הניתנים לזיהוי. יש לקחת זאת בחשבון בעת שימוש בפרוטוקול זה לניסויים החוקרים תגובות חיסוניות אנטי-ויראליות. התרחשות של דלקת חריפה ומתמשכת לאחר הזרקת i.p של תכשיר lentivirus עשוי להצביע על זיהום של התכשיר.

תחומי פתרון הבעיות כוללים: 1) עבור titer lentivirus נמוך, להבטיח את בריאותם של תאים HEK293T transfection יעיל (למשל, ביטוי סמן, אם קיים, בתאים HEK293T). אם שיעור ההדבקה נשאר נמוך, שקול את גודל המבנה. מבנים עם תוספות גדולות יותר או מבנים משניים מורכבים יותר יכולים להשפיע על titer lentivirus הסופי זיהומיות²⁴. לכן, כל מבנה צריך להיבדק באופן עצמאי ובמקביל לווקטור הבקרה המתאים לו; 2) אם נדרשת כמות גבוהה של הלנטיוירוס, מומלץ להכין צלוחיות T175 מרובות של תאי HEK293T ולהגדיל את הייצור בהתאם. כדי למנוע וריאציה של ההכנות lentivirus, זה הנוהג הטוב ביותר למזג את האוספים הסופיים לפני aliquoting ואחסון. עבור ייצור גדול כזה, פלסמידים תערובת (סעיף 2) צריך להיות מוכן צינורות 50 מ"ל כדי להבטיח ערבוב יעיל של הרכיבים.

למרות הטרופיזם הרחב שלו, חלקיקים לנטי-ויראליים פסאודו-טייפ VSV-G מכוונים בעיקר למקרופאגים של רקמות כפי שהודגם בעבר עבור מכתשית³⁵, וכאן¹⁸ עבור pMФ כאשר הם ניתנים על ידי המסלולים המתאימים. שינויים במעטפת על חלקיקי לנטיוירוס יכולים, במקרים מסוימים, לגרום לירידה בהתמרה של מקרופאגים in vivo³⁶ והם מיותרים עבור פרוטוקול זה. בהשוואה לגישות נגיפיות אחרות למניפולציה של גנים in vivo במקרופאגים (נסקרו^ב-37), השימוש בווקטורים לנטי-ויראליים מציע אינטגרציה יציבה של הטרנסגן במקרופאגים³⁵ של רקמות, ביטוי טרנסגנים יעיל, ומגבלת גודל הווקטור הגדולה ביותר (כ-8 קילובייט).

Mφ פריטוניאלי ממלא תפקיד חשוב במניעה, הופעה, התקדמות ופתרון של מחלות שונות, כולל סרטן הבטן, דלקת הלבלב ודלקת הצפק³⁸. פרוטוקול זה מתאר כלי יעיל לשינוי גנים ב-murine pMφ, המאפשר לחקור את התהליכים הביולוגיים שמאחורי פתולוגיות אלה בתוך מיקרו-סביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. בעוד שהווקטורים הלנטי-ויראליים עצמם הופכים לכלי מעניין להתערבויות קליניות³⁹, בשל מקורו של נגיף הכשל החיסוני ואינטגרציה גנומית יציבה, חששות הבטיחות מעכבים את יישומם הטיפולי. הבנה נוספת של תגובות המקרופאגים לאפנון גנים לנטי-ויראלי עשויה לקדם את היישום של כלי יעיל מאוד זה בסביבה קלינית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.05% טריפסין-EDTA (1x) (טריפסין 500 מ"ג/ליטר או 0.02 מ"מ)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0.22 μ m מסנן Millex GP סטרילי	Merck	SLGS033SS
0.45 μ m מסנן סטרילי millex GP	Merck	SLHP033RS
0.5 מ"ל מזרק אינסולין U-100 עם מחט, 0.33 מ"מ x 12.7 מ"מ (29 גרם)	BD	324892
1 ליטר Sharps מיכל	N	/A N/A
2.4G2 נוגדן (TruStain FcX נגד עכבר CD16/32)	Biolegend	101320
40 μ m מסננת	תרמו פישר סיינטיפיק	22363547
מדיום AimV (דרגת מחקר), תוסף AlbuMax	תרמו פישר מדעי	31035025
חסימת מאגר מוכן	בבית
מבשלה תיוגליקולט בינוני	סיגמא-אולדריץ'	B2551	4% תמיסת מלאי שהוכנה במים, אוטוקלאב ונשמר קפוא.
CD11b	Biolegend	101222	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD11b	BD	550993	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD11c	Biolegend	117317	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD11c	Biolegend	117333	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD19	BD	560375	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD19	Biolegend	152410	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD226	Biolegend	128808	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD3e	BD	560527	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD3e	Biolegend	152313	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD4	Biolegend	100412	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD73	eBioscience	16-0731-82	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD8a	eBioscience	48-0081-82	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
בקבוק תרבית תאים (T175 fask, 175 cm2, 550 מ"ל)	גריינר ביו וואן	658175
צינורות צנטריפוגה, צינורות תחתונים חרוטיים 25 מ"מ x 89 מ"מ	בקמן קולטר	358126
צנטריפוגות	בקמן		צנטריפוגה וצנטריפוגה TC
קולגנאז מסוג IV	סיגמא-אולדריץ'	C5138
צינורות צנטריפוגה חרוטיים (15 מ"ל ו-50 מ"ל)	גריינר ביו וואן	11512303 & 11849650
Cryotubes	Greiner Bio One	123277	או Cryotubes
DMEM בינוני (1x) + 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, 400 ומיקרו; M L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
מגיב טרנספקציה אפקטן	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
F4/80	Biolegend	123133	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
F4/80	Biolegend	123147	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
FceR1	eBioscience	48-5898-80	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
סרום עגל עוברי (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	מושבת בחום למשך 30 דקות בטמפרטורה של 56 מעלות; C וסטרילי מסוננים דרך 0.22 μ m מסנן
זרימה ציטומטר	תרמו פישר מדעי	Attune NxT
Flow Cytometry (FACS)	מאגר מוכן בבית
מיקרוסקופ תרבית רקמות פלואורסצנטיות	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
מלקחיים	N/A	N/A	העדפת משתמש
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
קו		תאים HEK293T	גדל לפחות שבוע לפני הטרנספקציה.
אנטיגן ליבה נטול HIV-1	בקמן קולטר	6604667
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506
פילינג כירורגי Hydrex, כלורהקסידינג גלוקונאט 4% w/v ניקוי עור	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
ICAM1	Becton Dickinson	554970	עיין בטבלה 1 עבור
		תאי Jurkat T	שגדל לפחות שבוע לפני השימוש.
ערכת כתמי תאים מתים ללא מיקופלזמה חי/מת כמעט IR ניתנת לתיקון	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
עכברים			כאן השתמשו בנקבות C57BL/6, בגילאי 8-12 שבועות (נהרות צ'ארלס), אלא אם צוין אחרת
פיפטות מיקרו-נימיות (טווח נפח 0.5-1,000 μ L)	פישר סיינטיפיק & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	מוכן ל-2% w/v ב-PBS
pCMV-Δ אריזת R8.91 פלסמיד		Zuffrey, R., et al. 1997	מקודד חלבון Gag-Pol HIV המונע על ידי מקדם ציטומגלווירוס. עמידות לאמפיצילין.
פניצילין/סטרפטומיצין (100x, 10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
צלחת פטרי	Greiner Bio One	664160
pHR'SIN-cPPT-SEW פלסמיד		Rosas, M. et al. 2014	שונה למחקרי ביטוי shRNA ו-miR. מקודד סמן EGFP במורד הזרם מקדם SFFV ובמעלה הזרם של משפר נגיף ההפטיב של וודצ'אק. עמידות לאמפיצילין.
pMD2.G פלסמיד		Naldini, L. et al. 1996	מקודד מעטפת g-glycoprotein של נגיף סטומטיס שלפוחית (VSV-G). עמידות לאמפיצילין.
חולדה IgG1, κ בקרת איזוטיפ	Becton Dickinson	550617	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
סרום חולדה	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
מאגר ליזה ACK בדם אדום	שהוכן בבית
RPMI 1640 בינוני (1x) + 400 uM L-גלוטמין	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
טבליות נתרן היפוכלוריט (אקונומיקה, 2,000 ppm)	Guest Medical	H8818
צלחת תרבית תאים סטרילית 24 בארות	Greiner Bio One	662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ ו-Ca2+ - ללא	Thermo Fisher Scientific	14190144
סטרילי EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
צינורות העברה חד פעמיים סטריליים VWR (23.0 מ"ל, 30 ס"מ)	VWR	612-4515
סוכרוז	תרמו פישר	15503022
מספריים כירורגיים	N/A	N/A	העדפת משתמש
מזרקים (50 מ"ל ו-1 0 מ"ל)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
צלחת תרבית תאים 96 בארות U-bottom	Greiner Bio One	650180