הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנה וקטורית לנטיויראלית לאפנון יעיל של גנים ומיקרו-רנ"א של מקרופאגים שוכנים ברקמת חלל הצפק in vivo בעכברים

2.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64926

⸱

16 בפברואר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Systems Immunity Research Institute, Division of Infection and Immunity, Cardiff University, 2Biomedical Sciences Unit, Faculty of Medicine, Health and Life Science, Swansea University, 3UK Dementia Research Institute

במאמר זה

סיכום

אנו מדגימים פרוטוקול שלב אחר שלב לחקר תפקוד גנים במקרופאגים שוכנים ברקמת הצפק in vivo, באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים.

תקציר

למקרופאגים המתגוררים ברקמת הצפק יש תפקידים נרחבים בשמירה על הומאוסטזיס והם מעורבים בפתולוגיות בתוך רקמות מקומיות ושכנות. תפקידיהם מוכתבים על ידי רמזים מיקרו-סביבתיים; לכן, חיוני לחקור את התנהגותם בנישה פיזיולוגית in vivo . כיום, מתודולוגיות ספציפיות הממוקדות במקרופאגים פריטוניאליים משתמשות במודלים טרנסגניים של עכבר שלם. כאן מתואר פרוטוקול לאפנון יעיל in vivo של mRNA ומיני RNA קטנים (למשל, microRNA) במקרופאגים פריטוניאליים באמצעות חלקיקי לנטיוירוס. תכשירי לנטיוירוס נעשו בתאי HEK293T וטוהרו על שכבת סוכרוז אחת. אימות In vivo של יעילות לנטיוירוס לאחר הזרקה תוך צפקית גילה זיהום דומיננטי של מקרופאגים המוגבלים לרקמה מקומית. התמקדות במקרופאגים פריטוניאליים הייתה מוצלחת במהלך הומאוסטזיס ודלקת צפק הנגרמת על ידי תיוגליקולט. נדונות מגבלות הפרוטוקול, כולל דלקת ברמה נמוכה הנגרמת על ידי אספקה תוך צפקית של לנטיוירוס ומגבלות זמן לניסויים פוטנציאליים. בסך הכל, מחקר זה מציג פרוטוקול מהיר ונגיש להערכה מהירה של תפקוד גנים במקרופאגים פריטוניאליים in vivo.

מבוא

מקרופאגים תושבי רקמות (Mφ) הם אוכלוסייה הטרוגנית של תאי חיסון פגוציטיים החשים ומגיבים לפתוגנים פולשים 1,2. בנוסף, הם ממלאים תפקיד חיוני בפיתוח רקמות, שיפוץ ושמירה על הומאוסטזיס 1,3. רקמות רבות Mφ נובעות מאבות שק החלמון במהלך האמבריוגנזה ומתמידות ברקמה לאורך כל החיים 4,5. הפנוטיפ והפונקציות של תאים אלה מוכתבים על ידי אינטראקציות שיתופיות והיררכיות של גורמי שעתוק ספציפיים והמיקרו-סביבה המקומית 6,7,8,9. הבנה הולכת וגוברת של תלות זו מגבירה את הצורך בשיטות יעילות in vivo למניפולציה גנטית של Mφ בתוך הנישה הרלוונטית מבחינה פיזיולוגית.

וקטורים לנטי-ויראליים הם כלי נפוץ למניפולציה של חומצות גרעין באוכלוסיות תאים ספציפיות in vivo 10,11,12, במיוחד בשל יכולתם להדביק תאים מתחלקים ולא מתחלקים ולהשתלב ביציבות בגנום המארח13,14. במהלך שני העשורים האחרונים, טכנולוגיית העברת lentivirus עברה אופטימיזציה, ומעטפות חלופיות ומקדמים סינתטיים נחקרו כדי להגדיל את מיקוד ספציפי לשושלת 8,15. בשל הטרופיזם הרחב של התא, גליקופרוטאין מעטפת וירוס סטומטיטיס שלפוחית הרחם (VSV-G)16,17 הפך למעטפת "תקן הזהב" המשמשת בטכנולוגיית lentivirus.

בפרוטוקולזה 18, חלקיקים לנטי-ויראליים פסאודו-טייפ של VSV-G משמשים להדגמת העברה ממוקדת ויעילה של RNA קצר סיכת שיער (shRNA) ומיקרו-רנ"א (miR) לעכבר Mφ (pMφ) in vivo, במצב יציב19. ביטוי טרנסגנים הונע על ידי מקדם וירוס יצירת מוקד הטחול (SFFV). זיהום פרודוקטיבי של תאים הוגדר על ידי ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (GFP) שמקורו בלנטיוירוס. השימוש בגישה זו איפשר קריאה קלה לניסויי in vivo lentivirus כדי להגדיר את המינון האופטימלי ואת מסגרת הזמן של הניסוי. לבסוף, אתגר לנטיויראלי in vivo של עכברים במהלך דלקת הנגרמת על ידי תיוגליקולט חשף את הנטייה הטבעית לזיהום pMφ סלקטיבי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל עבודת בעלי החיים בוצעה בהתאם להנחיות המוסדיים ומשרד הפנים הבריטי.

הערה: כל מחקרי in vivo עם lentivirus צריכים להתבצע על פי הנחיות מקומיות ולאומיות לגבי שימוש אתי בבעלי חיים במחקר, כמו גם שמירה על כל התקנות הקשורות לשימוש בחומרים זיהומיים בקטגוריה II. כמו כן, יש לפקח על רווחת בעלי החיים בהתאם לתקנות המקומיות. בשלב זה של הפרוטוקול, יש לנקוט משנה זהירות בעבודה עם חלקיקים וחדים לנטי-ויראליים.

1. הכנת תאי HEK293T לטרנספקציה

הערה: בצע שלבים אלה תחת ארון בטיחות ביולוגי של תרבית רקמה סטרילית.

  1. הכינו את מדיום הנשר המעובד (cDMEM) המלא של דולבקו לתאי HEK293T על ידי שילוב של 450 מ"ל DMEM עם 10% (v/v) נסיוב עגל עוברי (50 מ"ל) וריכוז סופי של 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין.
  2. הפשיר תאי HEK293T לפחות שבוע לפני הטרנספקציה המתוכננת. לשמור על תנאי גידול בריאים ולעבור כל 2-3 ימים באמצעות טריפסין + EDTA כדי לנתק את התאים מן הצלוחית.
  3. יום אחד לפני הטרנספקציה, שאפו בזהירות את מדיום הגידול מהתאים ושטפו בעדינות תאים עם DPBS סטרילי. הוסיפו 1-5 מ"ל טריפסין לבקבוק ודגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של 5% CO2 למשך 2-5 דקות.
  4. הוסף 5-10 מ"ל של cDMEM ולסובב את התאים ב 350 x גרם במשך 5 דקות. הסר את הנוזל להשעות מחדש את גלולת התא ב 10 מ"ל של cDMEM. לספור את התאים ואת הזרע 10-11 x 106 קיימא HEK293T תאים לכל בקבוק T175 ב 20 מ"ל של cDMEM.
  5. דגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של 5%CO2 למשך הלילה כדי לאפשר לתאי HEK293T להגיע למפגש של 70%-80%.
  6. למחרת, לאשר את המפגש של תאים תחת מיקרוסקופ אור.
  7. הסר את המדיה מן הבקבוק עם פס סרולוגי 25 מ"ל מבלי להפריע monolayer התא.
  8. מוסיפים בעדינות 10 מ"ל של DPBS ומנדנדים את הצלחת כדי לשטוף את התאים, תוך הקפדה לא להפריע למונושכבה של התא.
  9. הסר DPBS עם פס סרולוגי 25 מ"ל.
  10. הוסף 15 מ"ל של cDMEM חדש על הקיר לכל בקבוק T175 כדי לא להפריע monolayer התא, ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור ב 37 ° C.

2. טרנספקציה של תאי HEK293T באמצעות מגיב טרנספקציה שומנים שאינם ליפוזומליים

  1. בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, הכינו את המרכיבים הלנטיויראליים: 2 מיקרוגרם פלסמיד לנטיויראלי, 1.5 מיקרוגרם pΔ8.91 (pCMV-Δ8.91) ו-1 מיקרוגרם pMD2.G (pCMV-MD2.G) עם Buffer EC (ערכת מגיב טרנספקציה) לנפח סופי של 600 מיקרוליטר.
  2. הוסף 36 μL של תמיסת משפר. ערבבו את הרכיבים באמצעות פיפטה של 1 מ"ל על ידי שאיבה חוזרת ונשנית של חלק מהנוזל והחזירו טיפה אחר טיפה ישירות על התמיסה הנותרת. השאירו למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  3. מוסיפים 120 μL של מגיב transfection ומערבבים כנ"ל בערך 20 פעמים. דגירה במשך 10 דקות ב- RT.
  4. מוסיפים 5.2 מ"ל cDMEM ומערבבים כנ"ל עם פסים סרולוגיים 5 מ"ל.
  5. בעזרת פיפטת העברה חד פעמית, מוסיפים את תערובת הטרנספקציה ישירות על חד-שכבה של תאי HEK293T (תוך הימנעות מדפנות הבקבוק), ומפזרים את התערובת בנקודות שונות בצלוחית.
  6. מפזרים את הפלסמיד על ידי נדנוד עדין של הבקבוק מצד לצד. יש להימנע מחדירת נוזלים למכסה הבקבוק.
  7. לדגור את הבקבוק ב 37 ° C ב 5% CO2 אינקובטור במשך 48 שעות. לאשר transfection יעיל של תאים HEK293T על ידי הופעת סמן פלואורסצנטי, כאן GFP, בתוך 24 שעות של transfection מנוטר תחת מיקרוסקופ הדמיה תא פלואורסצנטי.
    הערה: עבור מבנים ללא סמן פלואורסצנטי, תאים HEK293T חייבים להיבדק לנוכחות גן הסמן המשומש או על ידי שינוי ביטוי בגן / חלבון מעניין על ידי טכניקות מתאימות, למשל, qPCR. לחלופין, ניתן לאמת בעקיפין טרנספקציה מוצלחת במהלך בדיקת אוסף הלנטיוירוס על תאי Jurkat בשלבים מאוחרים יותר של הפרוטוקול על ידי הטכניקות לעיל.
    זהירות: תאי HEK293T נגועים נחשבים זיהומיים, ויש לנקוט אמצעי זהירות מתאימים בעת הטיפול בתאים אלה. יש לעקוב אחר כללים מקומיים, אשר יכולים לכלול בדרך כלל עבודה תחת ארון בטיחות ביולוגי קטגוריה II, שימוש בכפפות כפולות, ותמיסת טיהור מתאימה לחיטוי, למשל, ריכוז מוגבר של אקונומיקה פסולת (2,000 ppm) או פתרון שווה ערך על פי הנחיות בטיחות ביולוגית מוסדיות. יש לחטא את כל התמיסות והפלסטיק הבאים במגע עם תכשיר לנטיוירוס בהתאם לנוהלי בטיחות ביולוגית מוסדיים.

3. אוסף של חלקיקים lentiviral

  1. הכינו תמיסת טיהור, תמיסת אקונומיקה (נתרן היפוכלוריט) בריכוז גבוה (2,000 ppm) או חומר שווה ערך בהתאם להנחיות בטיחות ביולוגית מוסדיות בדלי והניחו אותה בארון הבטיחות הביולוגי.
  2. הכינו את ארון הבטיחות הביולוגי על ידי הסרת פריטים עודפים, כגון מתלי צינורות ריקים וכו'.
  3. יש לסמן מראש צינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל לכל בקבוק תאי T175 HEK293T ולהסיר את המכסה מצינור הצנטריפוגה. הניחו את הצינורות במדף יציב.
  4. שלפו את הבקבוק מהאינקובטור ואשרו ביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם לייזר של 488 ננומטר (איור 1A). עוצמת האות תלויה ביעילות הטרנספקציה של ההליך ובמבנים המשומשים.
  5. אספו את המדיה מהתאים לתוך צינור הצנטריפוגה 50 מ"ל המסומן מראש. הטה את T175 HEK293T בקבוק עם תאים נגועים כך המדיום נאסף בפינה התחתונה של הצלוחית. באמצעות פס סרולוגי 25 מ"ל, לאסוף את המדיום מבלי להפריע monolayer התא. תאים צפים מסוימים עשויים להיות גלויים בשלב זה. מעבירים את המדיום לצינור צנטריפוגה נקי של 50 מ"ל וסוגרים את המכסה.
    1. באמצעות פס סרולוגי 25 מ"ל, להוסיף 25 מ"ל של cDMEM טרי וחם לצלוחית. הקפידו לכוון את הזרימה המדיום על דפנות הבקבוק כדי לא להפריע לחד-שכבה של התא. להחזיר את הבקבוק עם תאי HEK293T נגועים לאינקובטור (37 ° C, 5% CO2).
      הערה: ניתן לבצע אוסף שני של lentivirus וטיהור נוסף לאחר 24 שעות נוספות בעקבות ההליך המתואר בשלבים לעיל.
  6. כאשר איסוף lentivirus הושלם לאחר 24 שעות או 48 שעות, להוסיף פתרון טיהור לתאים, להבטיח שהוא מכסה את monolayer התא. שמור את הבקבוק אופקי למשך 24 השעות הבאות, ולאחר מכן השליך אותו בהתאם לתקנות קטגוריה II המתאימות.

4. טיהור של lentivirus

  1. סנן איסוף בינוני משלב 3.5.
    1. הסר את הבוכנה מהמזרק 50 מ"ל והכנס מסנן סטרילי פוליאתר קושר חלבון נמוך או פוליווינילידן פלואוריד 0.45 מיקרומטר לקצה המזרק. באמצעות פס סרולוגי 25 מ"ל, מוסיפים את המדיום שנאסף משלב 3.5.1 למזרק ומחזירים בעדינות את הבוכנה.
    2. דחפו את התקע באיטיות כדי להעביר את המדיום דרך המסנן לתוך צינור צנטריפוגה טרי של 50 מ"ל. אם הזרימה פוחתת באופן משמעותי, מקמו את המזרק כשהמסנן מצביע כלפי מעלה ומשכו את הבוכנה מספיק כדי לנקות את המדיום מהמסנן.
    3. בזהירות, להחליף את המסנן על מזרק עם אחד חדש להיפטר המסנן בשימוש בתמיסת טיהור. המשך סינון בינוני. בסיום, לטהר את המסנן ואת המזרק על ידי השקעת המסנן ומילוי המזרק בתמיסת הטיהור.
  2. קררו מראש את האולטרה-צנטריפוגה על ידי הגדרת הטמפרטורה ל-4°C וסגרו את המכסה כדי לאפשר לטמפרטורה להתאקלם.
  3. הוסף 3 מ"ל של תמיסת 20% סוכרוז (20% w/v במים טהורים במיוחד, סינון מעוקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר) לתחתית צינור אולטרה-צנטריפוגה חרוטי.
  4. באמצעות פס סרולוגי 25 מ"ל, כיסוי מדיום מסונן על גבי שכבת הסוכרוז, נזהר לא להפריע את השכבות.
    1. השתמש בהגדרת המהירות הנמוכה ביותר בילד פיפטה. סובבו את צינור האולטרה-צנטריפוגה החרוטי לכ-45° והוסיפו באיטיות את התווך המסונן המכיל לנטיוירוס משלב 4.1 לדופן הצינור. ודאו שהמדיום והסוכרוז אינם מתערבבים, ונראה הפרדה ברורה בין השכבות (איור 1B). ככל שנפח השכבה הבינונית גדל, הטו באיטיות את צינור האולטרה-צנטריפוגה חזרה למצב זקוף.
  5. אם הנפח הכולל, כולל הסוכרוז והמדיום, בצינור האולטרה-צנטריפוגה קטן מ-29 מ"ל, מלאו ב-cDMEM טרי כדי למנוע את קריסת הצינור במהלך הסיבוב. עבור אוספי T175 מ"ל מרובים, ערבבו תכשירים בינוניים מסוננים והשתמשו במספר צינורות אולטרה-צנטריפוגה. מלא את צינור האולטרה-צנטריפוגה הסופי בתווך לפי הצורך.
  6. ודא כי דליי אולטרה צנטריפוגות נקיים; אין שאריות בינוניות בתחתית הדלי או בכובעים. במידת הצורך, יש לנגב עם ~70% אלכוהול. שימו מתאמי צינור מתאימים בתחתית כל דלי (איור 1C) והורידו בעדינות את צינורות האולטרה-צנטריפוגות לתוך הדליים.
  7. סגור היטב את הדליים ותלה אותם על החללים שהוקצו ברוטור המסתובב.
  8. ודאו שהדליים מאוזנים עם אותם נפחים של סוכרוז ומדיום. אסור להפעיל רוטור מסתובב ללא דליים, אף על פי שדליים יריבים עשויים להישאר ריקים20 (איור 1D).
  9. בזהירות להכניס את הרוטור לתוך ultracentrifuge ולהפעיל את האבק. הגדר את קצב ההאצה וההאטה של אולטרה-צנטריפוגות להגדרה הנמוכה ביותר, והפעל את מכיני ה- lentivirus ב- 85,000 x g למשך 90 דקות ב- 4 °C.
  10. המתן עד שהאולטרה-צנטריפוגה תגיע למהירות הנדרשת (כ-3-5 דקות) לפני שתתרחק כדי לוודא שהרוטור מוכנס כראוי והסחרור לא יסתיים.
  11. בזמן שהאולטרה-צנטריפוגה פועלת, נקו את סביבת העבודה בהתאם לדרישות הבטיחות בקטגוריה II והכינו את החלל לשלבים הבאים.
  12. כאשר הסחרור מסתיים, השבת את הוואקום והסר בזהירות את הרוטור כדי לא להפריע לדגימות.
  13. חקור את האולטרה-צנטריפוגה לאיתור דליפות וודא שאין דליפות מהדליים. במקרה של שפיכה, הכפפה כפולה לטהר את הצנטריפוגה ואת פני השטח החיצוניים של דליים עם מוצרים אנטי ויראליים.
  14. הוציאו את הדליים מהאולטרה-צנטריפוגה והעבירו בזהירות את הדליים לארון הבטיחות הביולוגי בקטגוריה II.
    הערה: חלקיקי לנטיוירוס נאספים בתחתית צינור האולטרה-צנטריפוגה. הגלולה אינה נראית לעין בלתי.
  15. יוצקים את הסוכרוז והמדיום בתנועה חלקה אחת ישירות למיכל הפסולת עם תמיסת הטיהור.
  16. שמירה על צינור ultracentrifuge הפוך, להעביר אותו לשכבה כפולה של רקמה ולהשאיר אותו להתייבש במשך 10 דקות. בינתיים, נגבו את החלק הפנימי של הדליים עם רקמות ספוגות מים וייבשו באוויר הפוך.
  17. בזהירות לייבש את כל הנוזל שנותר משפת צינור ultracentrifuge עם רקמה לפני להפוך אותו זקוף. יש לחטא את הרקמה ואת פני השטח שמתחתיה.
  18. יש להשהות מחדש את גלולת הנגיף ב-1 מ"ל של מדיה או תמיסה נטולת סרום הדרושה לניסויים נוספים על ידי פיפטציה עדינה של התמיסה מעלה ומטה. השאירו אותו למשך 15 דקות ב-RT בתוך ארון הבטיחות לביולוגיה בקטגוריה II.
  19. ערבבו בעדינות את תכשירי הלנטיוירוס באמצעות פיפטה של 1 מ"ל לפני שתכנסו לצינורות עליונים בורגיים של 1.5 מ"ל (למשל, צינוריות קריו). הכן את aliquots עבור עבודה in vivo (ריבוי של 100 μL) ועבור titer lentivirus בתאי Jurkat T (1 x 20 μL) (ראה שלב 5).
  20. הימנע מחזורי הקפאה-הפשרה; תכשירים lentiviral ניתן לאחסן ב -80 ° C עד 6 חודשים ללא השפעה שלילית על זיהומיות.

5. טיטרציה של ייצור lentivirus בתאי Jurkat T

  1. הכינו מדיום שלם של Roswell Park Memorial Institute 1640 (cRPMI-1640) עבור תאי Jurkat T על ידי השלמת 500 מ"ל של RPMI-1640 עם 10% (v/v) נסיוב עגל עוברי וריכוז סופי של 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין.
  2. כדי להבטיח תרבית בריאה של תאי Jurkat T, לשמור על התאים בתרבית עד שבוע לפני ההדבקה.
  3. ביום הטיטרציה של הלנטיוירוס, צלחת החוצה תאי Jurkat T קיימא בצלחת 24 בארות ב 2 x 105 תאים / באר ב 200 μL לכל באר של cRPMI-1640.
  4. השתמש lentivirus שנאסף טרי או להפשיר את בקבוקון lentivirus המכיל 20 μL על קרח ולערבב בעדינות על ידי pipeting למעלה ולמטה.
  5. באמצעות דילול סדרתי ב- cRPMI-1640, להדביק תאי Jurkat T עם 0.25 μL, 0.5 μL, 1 μL, 2.5 μL, 5 μL, ו 10 μL של מלאי lentivirus. נענע בעדינות את הצלחת כדי להבטיח הפצה שווה של lentivirus. תאי Jurkat T שאינם נגועים משמשים כבקרה שלילית.
  6. לדגור את הצלחת ב 37 ° C. לאחר 4 שעות, מלא כל באר עם cRPMI לנפח כולל של 400 μL. להחזיר את הצלחת לאינקובטור ב 37 ° C למשך 3 ימים.
  7. לאחר 48 שעות לאחר ההדבקה, יש לאשר את ביטוי ה-GFP תחת מערכת הדמיה פלואורסצנטית.
  8. 3 ימים לאחר ההדבקה, לאסוף כל באר של צלחת 24 באר לתוך צינורות איסוף נפרדים 1.5 מ"ל צנטריפוגה את התאים ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
  9. השליכו את הסופרנטנט. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-300 μL של 2% פרפורמלדהיד (PFA) מוכנה ל-2% (w/v) ב-DPBS ולהשאיר אותה למשך 15 דקות על קרח בחושך.
  10. צנטריפוגה את התאים ב 350 x גרם ב 4 ° C למשך 5 דקות ולהשהות מחדש את הגלולה במאגר מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) (DPBS סטרילי + 4% FCS + 1 mM EDTA סטרילי).
  11. נתחו את תדירות ביטוי ה-GFP ואת העוצמה הפלואורסצנטית הממוצעת של הלנטיוירוס הנגוע ותאי הבקרה שלו באמצעות ציטומטריית זרימה (איור 2).

6. זיהום In vivo lentivirus של מקרופאגים פריטוניאליים תושבי רקמות

  1. בארון בטיחות ביולוגי בקטגוריה II, יש להעמיס מחטי אינסולין בנפח כולל של 200 μL של אמצעי מדיה ללא סרום המכילים את הכמות הנדרשת של לנטיוירוס (השתמש במחטים חד פעמיות, 30 גרם לרווחת בעלי החיים וכדי למנוע אובדן נוזלים במחט).
  2. הניחו את נדן המחט בחזרה על המחט בטכניקת כף מדידה ביד אחת. שמור את המחט על קרח והזריק תוך 30 דקות.
  3. במתקן לבעלי חיים, התקינו ארון בטיחות ביולוגי בקטגוריה II לפני הזרקות (איור 1E).
    1. הניחו יריעה של טישו נקי. שחררו את הנדן על מחט האינסולין המכילה לנטיוירוס.
    2. הכינו צלחת פטרי המכילה חתיכות קטנות של רקמה וחומר חיטוי על בסיס גלוקונאט כלורהקסידין, צינור 50 מ"ל המכיל תמיסת טיהור (תמיסת אקונומיקה של 2,000 ppm) ומיכל חד ובטוח.
  4. לרסן את העכבר על ידי אחיזת העור בעורף21. עכבר מרוסן כראוי אינו נייד, וזה נדרש לבטיחות.
  5. כאשר הבטן פונה כלפי מעלה, כוונו את ראשה של החיה מעט כלפי מטה. להזריק את lentivirus Intraperitoneally לתוך הרביע הימני התחתון של חלל הבטן. זאת כדי למנוע הזרקה לכל איברי חלל הצפק.
  6. לפני שחרור העכבר, מלא את המזרק בתמיסת טיהור והשליך אותו בבטחה בתיבה הבטוחה החדה.
  7. נגבו את אתר ההזרקה על בטנו של העכבר ברקמה ספוגה בחומר חיטוי והחזירו את החיה לכלוב.
  8. אחסנו את העכבר המוזרק לנטיוירוס בסקנטינר מקטגוריה II או בכלובים מאווררים בנפרד (IVC) (כלובים מבודדים עם סינון אוויר ביעילות גבוהה) למשך 72 שעות לפחות לאחר ההזרקה. הניחו כרטיס מידע מתאים בחזית הכלוב.
  9. העבר את העכבר לקטגוריה החדשה I מחזיק כלוב לאחר 72 שעות לאחר ההדבקה, בהתאם לאישורי בטיחות מקומיים. יש לעקוב אחר עכברים מדי יום במשך 3 ימים מההזרקה.

7. איסוף תאי צפק מעכבר נגוע בלנטיוירוס

אזהרה: עבור אוספים בטווח של 72 שעות לאחר הזרקת לנטיוירוס, פעל בהתאם לכללי הבטיחות הביולוגית המוסדיים בקטגוריה II. מצעים וכלוב החזקה שבו הוחזקו בעלי חיים נגועים ב-72 השעות הראשונות לאחר הזרקת הלנטיוירוס חייבים לעבור טיהור בהתאם לכללי הבטיחות הביולוגיים המוסדיים בקטגוריה II.

  1. המתת חסד של עכברים בהתאם לתקנות מוסדיות, למשל, על ידי שאיפת ריכוז הולך וגובר שלCO2, ולאחר מכן אישור מוות על ידי נקע צוואר הרחם.
  2. נקה את הבטן של העכבר עם 70% isopropanol בזהירות לחתוך את העור כדי לחשוף את קרום חלל הצפק.
  3. שטפו את חלל הצפק עם 6 מ"ל של חיץ FACS קר כקרח באמצעות מזרק 10 מ"ל ומחט 23 גרם. הימנע ניקוב כל איברים.
  4. עסו בעדינות את הצפק כדי לעקור תאים למאגר FACS.
  5. לאסוף את נוזל הצפק באמצעות מזרק ומחט אותו.
  6. הסר את המחט והעבר את התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
  7. שמור את שטיפות הצפק על קרח.
  8. לאסוף איברים נדרשים אחרים ולאחסן אותם בהתאם למחקר.
  9. יש להשליך פגרי בעלי חיים בהתאם להנחיות המקומיות בנושא בעלי חיים ובטיחות.

8. צביעה וניתוח של תאי הצפק

  1. צנטריפוגה את שטיפת הצפק ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות, להשליך את supernatant בתמיסת טיהור, ולהשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מאגר FACS.
  2. ספרו את התאים שנאספו ואת הצלחת 4 x 105 תאים לכל באר בצלחת V תחתונה 96 בארות.
  3. בצע צביעת כדאיות באמצעות מגיב הניתן לתיקון (לדוגמה, ערכת צביעת תאים מתים הניתנת לתיקון קרוב לאינפרא-אדום המשמש כאן) בהתאם להוראות היצרן.
  4. אם תאים נדבקו במהלך 72 השעות האחרונות, תקן את התאים ב- 2% PFA למשך 15 דקות על קרח. הוסף נפח שווה של DPBS קר וצנטריפוגה שוב ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
  5. הכינו את המאגר החוסם: ערבבו נוגדנים 4 מיקרוגרם/מ"ל 2.4G2 בסרום חולדות של 10% (v/v) בחיץ FACS לצביעת פני השטח או בחיץ חלחול לצביעה תוך תאית.
  6. יש להשהות מחדש כל באר המכילה גלולת תא ב-50 מיקרוליטר של חיץ חוסם ולדגור בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות.
  7. הכינו תערובת נוגדנים ב-50 מיקרוליטר של חיץ FACS (לצביעה על פני השטח) או בחיץ חדירה (לצביעה תוך-תאית) לכל דגימה. נפח הצביעה הסופי עבור כל דגימה יהיה 100 μL, כולל 50 μL של חיץ חוסם. חישוב ריכוזי הנוגדנים בהתאם (טבלה 1).
  8. הוסף 50 μL של תערובת נוגדנים לדגימות ו 50 μL של בקרת איזוטיפ ומאגר בקרה כדי לשלוט דגימות. דגרו על הדגימות במשך 30 דקות על קרח בחושך. כלול תאים לא מוכתמים ופקדי איזוטיפ לפי הצורך.
  9. שטפו היטב כל באר עם 100-200 מיקרוליטר של DPBS קר כקרח וצנטריפוגה את הצלחת ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. חזור על שלב זה כדי לשטוף נוגדנים לא קשורים. נתח את הדגימות על ציטומטר זרימה.

9. מיצוי תאים מאיברים

  1. הכינו 1 מ"ל של תערובת עיכול לכל איבר: ערבבו את תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS), 2 מ"ג/מ"ל קולגנאז מסוג IV ו-0.03 מ"ג/מ"ל DNase I (כולל 1.5 מ"ג/מ"ל היאלורונידאז לעיכול ריאות).
  2. מעבירים את האיבר שנאסף ל 1 מ"ל של תערובת העיכול וטוחנים אותו במספריים.
  3. סנן את התאים דרך מסננת 40 מיקרומטר וצנטריפוגה ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
  4. אם מבודדים תאים מהריאה, הטחול או הכבד, ליז תאי דם אדומים באמצעות מאגר ACK lysis (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA pH = 7.4). סנן את התאים דרך מסננת 40 מיקרומטר וצנטריפוגה ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
  5. לצבוע ולנתח את התאים כמתואר בסעיף 8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאשר מתבצע באופן מלא ונכון, פרוטוקול זה מניב סך של 1.5 מ"ל של מלאי לנטיוירוס באיכות גבוהה לכל תכשיר יחיד, מספיק עבור שתים עשרה זריקות in vivo בנפח האופטימלי שנקבע במחקר זה18. ניתן להעריך את הצלחת הטרנספקציה בשלב מוקדם של הפרוטוקול. תאי HEK293T בריאים וקולפים צריכים להציג, אם הם קיימים בפלסמידים, אות סמן שניתן לזהות בקלות (למשל, GFP המשמש במחקר זה) לאחר 48 שעות לאחר התפשטות פלסמיד (איור 1A). העוצמה הנמוכה של האות, ניתוק יתר של תאים ומפגש נמוך בשלבים המוקדמים ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מקרופאגים שוכני רקמות מבצעים מגוון תפקודים הומיאוסטטיים ודלקתיים ספציפיים לרקמה 1,2 המוכתבים על ידי הסביבה הפיזיולוגית שלהם 6,7,8,9. בפרוטוקול זה, שיטהיעילה 18 למניפולציה של מקרופאגים תושבי הצפק in vivo באמצעות חלקיקי לנטיוירוס הוצגה כדי לחקור את תפקוד המקרופאגים במיקרו-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן, כולו או חלקו, על ידי פרס Wellcome Trust Investigator Award [107964/Z/15/Z]. P.R.T נתמך גם על ידי המכון הבריטי לחקר דמנציה. M.A.C נתמך על ידי מלגת גילוי המועצה למחקר ביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BB/T009543/1). לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון זכויות יוצרים ציבורי CC BY על כל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר הנובעת מהגשה זו. L.C.D הוא מרצה באוניברסיטת סוונסי ועמית מחקר לשם כבוד באוניברסיטת קרדיף. עבודה זו נתמכת על ידי עבודה שבוצעה על ידי Ipseiz et al. 202018.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% טריפסין-EDTA (1x) (טריפסין 500 מ"ג/ליטר או 0.02 מ"מ)Thermo Fisher Scientific25300054
0.22 μ m מסנן Millex GP סטריליMerckSLGS033SS
0.45 μ m מסנן סטרילי millex GPMerckSLHP033RS
0.5 מ"ל מזרק אינסולין U-100 עם מחט, 0.33 מ"מ x 12.7 מ"מ (29 גרם)BD324892
1 ליטר Sharps מיכלN/A N/A
2.4G2 נוגדן (TruStain FcX נגד עכבר CD16/32)Biolegend101320
40 μ m מסננתתרמו פישר סיינטיפיק22363547
מדיום AimV (דרגת מחקר), תוסף AlbuMaxתרמו פישר מדעי31035025
חסימת מאגר מוכןבבית
מבשלה תיוגליקולט בינוניסיגמא-אולדריץ'B25514% תמיסת מלאי שהוכנה במים, אוטוקלאב ונשמר קפוא.
CD11bBiolegend101222עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD11bBD550993עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD11cBiolegend117317עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD11cBiolegend117333עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD19BD560375עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD19Biolegend152410עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD226Biolegend128808עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD3eBD560527עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD3eBiolegend152313עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD4Biolegend100412עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD73eBioscience16-0731-82עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
CD8aeBioscience48-0081-82עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
בקבוק תרבית תאים (T175 fask, 175 cm2, 550 מ"ל)גריינר ביו וואן658175
צינורות צנטריפוגה, צינורות תחתונים חרוטיים 25 מ"מ x 89 מ"מבקמן קולטר358126
צנטריפוגותבקמןצנטריפוגה וצנטריפוגה TC
קולגנאז מסוג IVסיגמא-אולדריץ'C5138
צינורות צנטריפוגה חרוטיים (15 מ"ל ו-50 מ"ל)גריינר ביו וואן11512303 & 11849650
CryotubesGreiner Bio One123277או Cryotubes
DMEM בינוני (1x) + 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, 400 ומיקרו; M L-glutamineThermo Fisher Scientific41965-062
Dnase ISigma-Aldrich11284932001
מגיב טרנספקציה אפקטןQiagen301425
F4/80Biolegend123123עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
F4/80Biolegend123133עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
F4/80Biolegend123147עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
FceR1eBioscience48-5898-80עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
סרום עגל עוברי (FCS) Thermo Fisher Scientific10270-106מושבת בחום למשך 30 דקות בטמפרטורה של 56 מעלות; C וסטרילי מסוננים דרך 0.22 μ m מסנן
זרימה ציטומטרתרמו פישר מדעי  Attune NxT
Flow Cytometry (FACS)מאגר מוכן בבית
מיקרוסקופ תרבית רקמות פלואורסצנטיותThermo Fisher ScientificEVOS FL
מלקחייםN/AN/Aהעדפת משתמש
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)Gibco, Life Technologies14175-053
קותאים HEK293Tגדל לפחות שבוע לפני הטרנספקציה.
אנטיגן ליבה נטול HIV-1בקמן קולטר6604667
HyaluronidaseSigma-AldrichH3506
פילינג כירורגי Hydrex, כלורהקסידינג גלוקונאט 4% w/v ניקוי עורEcolab3037170
I-A/I-EBiolegend107625עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
ICAM1Becton Dickinson554970עיין בטבלה 1 עבור
תאי Jurkat Tשגדל לפחות שבוע לפני השימוש.
ערכת כתמי תאים מתים ללא מיקופלזמה חי/מת כמעט IR ניתנת לתיקוןThermo Fisher ScientificL34975
Ly6GBiolegend127615עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
עכבריםכאן השתמשו בנקבות C57BL/6, בגילאי 8-12 שבועות (נהרות צ'ארלס), אלא אם צוין אחרת
פיפטות מיקרו-נימיות (טווח נפח 0.5-1,000 μ L)פישר סיינטיפיק & Starlab11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1Biolegend108724עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148-500Gמוכן ל-2% w/v ב-PBS
pCMV-Δ אריזת R8.91 פלסמידZuffrey, R., et al. 1997מקודד חלבון Gag-Pol HIV המונע על ידי מקדם ציטומגלווירוס. עמידות לאמפיצילין.
פניצילין/סטרפטומיצין (100x, 10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
צלחת פטריGreiner Bio One664160
pHR'SIN-cPPT-SEW פלסמידRosas, M. et al. 2014שונה למחקרי ביטוי shRNA ו-miR. מקודד סמן EGFP במורד הזרם מקדם SFFV ובמעלה הזרם של משפר נגיף ההפטיב של וודצ'אק. עמידות לאמפיצילין.
pMD2.G פלסמידNaldini, L. et al. 1996מקודד מעטפת g-glycoprotein של נגיף סטומטיס שלפוחית (VSV-G). עמידות לאמפיצילין.
חולדה IgG1, κ בקרת איזוטיפBecton Dickinson550617עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
סרום חולדהSigma-AldrichR9759-10ML
מאגר ליזה ACK בדם אדוםשהוכן בבית
RPMI 1640 בינוני (1x) + 400 uM L-גלוטמיןThermo Fisher Scientific21875-091
SaponinSigma-AldrichS4521
SiglecFBD562681עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
טבליות נתרן היפוכלוריט (אקונומיקה, 2,000 ppm)Guest MedicalH8818
צלחת תרבית תאים סטרילית 24 בארותGreiner Bio One662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ ו-Ca2+ - ללאThermo Fisher Scientific14190144
סטרילי EDTAThermo Fisher Scientific15575020
צינורות העברה חד פעמיים סטריליים VWR (23.0 מ"ל, 30 ס"מ)VWR612-4515
סוכרוזתרמו פישר15503022
מספריים כירורגייםN/AN/Aהעדפת משתמש
מזרקים (50 מ"ל ו-1 0 מ"ל)Fisher Scientific10084450 & 768160
Tim4Biolegend130007עיין בטבלה 1 לדילול וריכוז
צלחת תרבית תאים 96 בארות U-bottomGreiner Bio One650180
קולטר ללא מיקופלזמה קו לדילול וריכוז

מקורות

  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Jantsch, J., Binger, K. J., Muller, D. N., Titze, J. Macrophages in homeostatic immune function. Front Physiol. 5, 146(2014).
  3. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  4. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  5. Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
  6. Amit, I., Winter, D. R., Jung, S. The role of the local environment and epigenetics in shaping macrophage identity and their effect on tissue homeostasis. Nat Immunol. 17 (1), 18-25 (2016).
  7. Gosselin, D., et al. Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities. Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).
  8. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  9. Davies, L. C., et al. Peritoneal tissue-resident macrophages are metabolically poised to engage microbes using tissue-niche fuels. Nat Commun. 8 (1), 2047(2017).
  10. Shi, J., Hua, L., Harmer, D., Li, P., Ren, G. Cre driver mice targeting macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 263-275 (2018).
  11. Wang, X., et al. Recent advances in lentiviral vectors for gene therapy. Sci China Life Sci. 64 (11), 1842-1857 (2021).
  12. Kosaka, Y., et al. Lentivirus-based gene delivery in mouse embryonic stem cells. Artif Organs. 28 (3), 271-277 (2004).
  13. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  14. Yamashita, M., Emerman, M. Capsid is a dominant determinant of retrovirus infectivity in nondividing cells. J Virol. 78 (11), 5670-5678 (2004).
  15. Wilson, A. A., et al. Lentiviral delivery of RNAi for in vivo lineage-specific modulation of gene expression in mouse lung macrophages. Mol Ther. 21 (4), 825-833 (2013).
  16. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  17. Finkelshtein, D., Werman, A., Novick, D., Barak, S., Rubinstein, M. LDL receptor and its family members serve as the cellular receptors for vesicular stomatitis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7306-7311 (2013).
  18. Ipseiz, N., et al. Effective in vivo gene modification in mouse tissue-resident peritoneal macrophages by intraperitoneal delivery of lentiviral vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 21-31 (2020).
  19. Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
  20. BeckmanCoulter. , https://www.mybeckman.uk/resources/technologies/centrifugation/principles/rotor-balancing (2023).
  21. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
  22. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechnol. 15 (9), 871-875 (1997).
  23. Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  24. Optimized production and concentration of lentiviral vectors containing large inserts. J Gene Med. al Yacoub, N., Romanowska, M., Haritonova, N., Foerster, J. 9 (7), 579-584 (2007).
  25. Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV restriction factors and mechanisms of evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940(2012).
  26. Sonza, S., et al. Susceptibility of human monocytes to HIV type 1 infection in vitro is not dependent on their level of CD4 expression. AIDS Res Hum Retroviruses. 11 (7), 769-776 (1995).
  27. Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.1(2003).
  28. Brown, L. Y., Dong, W., Kantor, B. An Improved protocol for the production of lentiviral vectors. STAR Protoc. 1 (3), 100152(2020).
  29. Moce-Llivina, L., Jofre, J., Muniesa, M. Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions. J Virol Methods. 109 (1), 99-101 (2003).
  30. Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Sci Rep. 5, 13875(2015).
  31. Czubala, M. A., et al. TGFbeta induces a SAMHD1-independent post-entry restriction to HIV-1 infection of human epithelial langerhans cells. J Invest Dermatol. 136 (10), 1981-1989 (2016).
  32. Bouabe, H., Okkenhaug, K. Gene targeting in mice: a review. Methods Mol Biol. 1064, 315-336 (2013).
  33. Kim, J. M., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y. Regulatory T cells prevent catastrophic autoimmunity throughout the lifespan of mice. Nat Immunol. 8 (2), 191-197 (2007).
  34. Decalf, J., et al. Sensing of HIV-1 entry triggers a Type I Interferon response in human primary macrophages. J Virol. 91 (15), e00147-e00217 (2017).
  35. Wilson, A. A., et al. Amelioration of emphysema in mice through lentiviral transduction of long-lived pulmonary alveolar macrophages. J Clin Invest. 120 (1), 379-389 (2010).
  36. Markusic, D. M., van Til, N. P., Hiralall, J. K., Elferink, R. P., Seppen, J. Reduction of liver macrophage transduction by pseudotyping lentiviral vectors with a fusion envelope from Autographa californica GP64 and Sendai virus F2 domain. BMC Biotechnol. 9, 85(2009).
  37. Burke, B., Sumner, S., Maitland, N., Lewis, C. E. Macrophages in gene therapy: cellular delivery vehicles and in vivo targets. J Leukoc Biol. 72 (3), 417-428 (2002).
  38. Bain, C. C., Jenkins, S. J. The biology of serous cavity macrophages. Cell Immunol. 330, 126-135 (2018).
  39. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מקרופאגים פריטוניאלייםמודולציה של גניםהובלה למסלול בתוך הגוף (In Vivo Delivery)תאי HEK293Tהזרקה תוך-פריטוניאליתאולטרה-צנטריפוגציהפלואורסצנציית GFP
הכנה וקטורית לנטיויראלית לאפנון יעיל של גנים ומיקרו-רנ"א של מקרופאגים שוכנים ברקמת חלל הצפק in vivo בעכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.