מאמר שיטה

יצירת אורגנואידים פונקציונאליים בכבד אנדודרמלי

DOI:

10.3791/65027

⸱

2 במאי 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Department of Histology and Embryology, Health Science Institute, Dokuz Eylul University, 3Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Izmir Tinaztepe University, 4Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 5Department of Pediatric Gastroenterology and Metabolism, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 6Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Koc University, 7Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את היצירה של אורגנואידים אנדודרמליים בכבד (eHEPOs) מהירים וניתנים לשחזור. בעזרת פרוטוקול זה, ניתן לייצר eHEPOs תוך שבועיים ולהתרחב לטווח ארוך (יותר משנה) מבלי לאבד את הבידול והפונקציונליות שלהם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיית אורגנואידים אפשרה לנו ליצור מגוון של מיני מבנים דמויי איברים אנושיים, כגון עבור הכבד, המוח והמעי, במבחנה. ההתקדמות המדהימה במודלים אורגנואידים פתחה לאחרונה עידן ניסיוני חדש ליישומים שונים במודלים של מחלות, ביולוגיה התפתחותית וגילוי תרופות. תאי גזע בוגרים או אורגנואידים בכבד שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) שולטים ביצירת הפטוציטים לשימוש ליישומים מגוונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חזק וניתן לשחזור ליצירת אורגנואידים בכבד מתאי גזע פלוריפוטנטיים. פרוטוקול זה חל על תאים בריאים שמקורם בחולה. כדי להשיג אורגנואידים בכבד (eHEPOs) שמקורם באנדודרם תלת-ממדי, iPSCs התמיינו תחילה ישירות לתאים אנדודרמליים, ולאחר מכן נעשה שימוש בתאי EpCAM חיוביים (EpCAM+) מועשרים ב-FACS כדי לבסס אורגנואידים בכבד באמצעות מדיום ההתפשטות. אנו מספקים שיטה מהירה ויעילה ליצירת אורגנואידים בכבד תוך שבועיים. האורגנואידים הנוצרים מחקים את התכונות והתפקודים החיוניים של הפטוציטים, כגון הפרשת אלבומין, אחסון גליקוגן ופעילות אנזים ציטוכרום P450. מלבד הדמיון בביטוי הגנים הספציפיים לכבד, eHEPOs מורכבים מתאי אפיתל מקוטבים עם תעלות מרה ביניהם. בנוסף, ניתן להרחיב את ה-eHEPOs ולעבור מעברים סדרתיים לטווח ארוך (שנה) מבלי לאבד את יכולתם להתמיין להפטוציטים בוגרים. לפיכך, eHEPOs מספקים מקור חלופי לייצור הפטוציטים פונקציונליים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים הם מבנים דמויי איברים ממוזערים הגדלים בתנאי תרבית תלת מימדיים המחקים את המיקרו-סביבה של האיבר וכוללים את הגורמים המהותיים הדרושים לארגון עצמי והתחדשות עצמית בהתפתחות האיברים עצמה. אורגנואידים יכולים להיגזר מתאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs) או מתאים בוגרים שמקורם ברקמות (תאי גזע או אב)1. למרות שהארגון המדויק דמוי האיבר והדמיון התפקודי לאיבר הספציפי הופכים אותם לכלים רבי ערך למידול מחלות, הם עדיין זקוקים לשיפורים נוספים במונחים של סטנדרטיזציה בתרבית. בפרט, פורסמו מספר פרוטוקולים ליצירת אורגנואידים בכבד, והם נבדלים זה מזה במורכבותם וביכולת השחזור שלהם2. לדוגמה, האורגנואידים של ניצני הכבד שפותחו על ידי Takebe ואחרים לובשים צורה של מבנים צפופים ורב-תאיים המכילים את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים הבאים (iPSCs): אבות אנדודרמליים בכבד, תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVECs) ותאי גזע מזנכימליים (MSCs). עם זאת, לאורגנואידים אלה אין יכולת חידוש עצמי לטווח ארוך 3,4.

מנקודת מבט היסטורית, Huch et al. דיווחו לראשונה על ייצור אורגנואידים אפיתל כבד אנושי שמקורם ברקמה בוגרת, שבה התאים מקוטבים ומתמחים בשכפול היבטים של האפיתל המקומי5. לאחר מכן, גואן ועמיתיו השתמשו באורגנואידים בכבד שמקורם ב-iPSC כדי לדגמן את תסמונת אלגיל (ALGS), הפרעה גנטית נדירה הקשורה להפחתת דרכי המרה בכבד6. לשני האורגנואידים הללו יש יכולת חידוש עצמי ויכולים להשיג פונקציות הפטוציטים בוגרות, כגון הפרשת מרה ואלבומין, אחסון גליקוגן וניקוי רעלים ספציפי לכבד. במחקר שנערך לאחרונה, רמלי ועמיתיו הציגו מודל אורגנואיד כבד שמקורו ב-PSC המכיל רשתות תעלות מרה פונקציונליות בין תאים דמויי הפטוציטים מקוטבים (HLCs) המרוקנים תרופות כולסטטיות לציסטות מרה המורכבות מתאים דמויי כולנגיוציטים (CLCs)7.

מחקר זה מציג תרבית ייחודית ליצירת אורגנואידים אנדודרמליים בכבד שמקורם ב-iPSC, הנקראים eHEPOs. תרבית ה-iPSC וההתמיינות לאנדודרם מתוארים צעד אחר צעד, ומודגם יצירת eHEPOs מאבות EpCAM+ מועשרים. לבסוף, מתוארים אפיון הפונקציונליות והארגון המבני של ה-eHEPOs, כמו גם שימור בהקפאה של האורגנואידים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אישורים הקשורים לצעדים ניסיוניים התקבלו מוועדת האתיקה המקומית למחקר קליני של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת דוקוז אילול (2013/25-4, 12 במאי 2013; 2016/30-29, 24 בנובמבר 2016).

1. הכנת פתרונות לתרבית תאים

  1. הכן את מדיום ההתמיינות של האנדודרם על ידי ערבוב הרכיבים הבאים במכסה זרימה למינרית: 1% B27, 100 ננוגרם/מ"ל Activin A, Wnt3a או 30% wnt3a-CM, ו-R-spo1 או 10% R-spo1-CM (ראה טבלת החומרים).
  2. הכן את מאגר מיון התאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) עם ההרכב הבא: PBS, 1 מ"מ EDTA, 25 מ"מ HEPES, 1% FBS.
  3. הכן את מדיום ההרחבה (EM): 1% N2, 1% B27, 1.25 מ"מ N-אצטיל-L-ציסטאין, 50 ננוגרם/מ"ל EGF, 10% מדיום מותאם R-spo1, 100 ננוגרם/מ"ל FGF 10, 10 מ"מ ניקוטינאמיד, 5 מיקרומטר A8301 ו-10 מיקרומטר פורסקולין (FSK) ב-DMEM/F-12 מתקדם. הוסף 10 ננומטר Y-27632 ו-0.3 ננומטר WNT3a (ראה טבלת החומרים).
    הערה: שמור את המדיום המלא למשך שבועיים לכל היותר בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
  4. הכן את מדיום ההתמיינות (DM): 1% N2, 1% B27, 10 ננומטר גסטרין, 50 ננוגרם/מ"ל EGF, 100 ננוגרם/מ"ל FGF 10, 25 ננוגרם/מ"ל HGF, 500 ננומטר A8301, 10 מיקרומטר DAPT, 25 ננוגרם/מ"ל BMP7 ו-30 מיקרומטר דקסמתזון ב-Ad-DMEM/F-12 (ראה טבלת החומרים).
    הערה: שמור את המדיום המלא למשך שבועיים בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.

2. הפשרת ה-iPSCs על הצלחת נטולת המזין

  1. מצפים את צלחת תרבית התאים במטריצת קרום מרתף (BMM).
    1. הפשירו בקבוקון אחד של בקבוקון של BMM למשך הלילה על קרח או לפחות שעתיים לפני תחילת הציפוי. הוסף 6 מ"ל DMEM/F-12 קר לצינור חרוטי של 15 מ"ל, הוסף מיד 80 מיקרוליטר של BMM מופשר וערבב היטב.
    2. השתמש בצלחות באר שטופלו בתרבית רקמות, צפה את צלחת התרבות בתמיסת BMM והחלק אותה כדי לכסות את משטח צלחת הבאר. דגרו את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות לפני השימוש. לאחר זמן הדגירה, השליכו את תמיסת ה-BMM והוסיפו מיד את המדיום הספציפי ל-iPSC.
  2. הסר בקבוקון אחד של iPSCs מאחסון החנקן הנוזלי באמצעות כפפות קריוגניות. הניחו מיד את הבקבוקון על מתלה צינור צף, וטבלו את המתלה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד שגבישי הקרח נמסים.
    1. הוציאו את הבקבוקון מאמבט המים, ונגבו היטב את החלק החיצוני שלו עם 70% אתנול. לאחר מכן, הניחו אותו במכסה המנוע הלמינר. חשוב להיות מהיר בשלב זה.
    2. בתנאים אספטיים, במכסה מנוע למינר, העבירו את התאים המופשרים לצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום ספציפי ל-iPSC.
      1. צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 200 × גרם (בטמפרטורת החדר) למשך 3 דקות. השליכו את הסופרנטנט לאט, השעו מחדש את התאים ב-2 מ"ל של מדיום ספציפי ל-iPSC על ידי פיפטינג עדין מאוד כמה פעמים עם פיפט סרולוגי של 5 מ"ל, וזרעו את התאים על הבארות המצופות.
    3. הזיזו את הצלחת במהירות כדי לפזר את התאים על פני הבאר. דגרו את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 .
    4. רענן את מדיום התרבות מדי יום.

3. בידול אנדודרם

  1. מצפים לוחית באר חדשה ב-BMM שעה אחת לפני פיצול ה-iPSCs, כפי שהוזכר בסעיף 2.
  2. לשלוט בתקינותם ובכדאיותם של תאי ה-iPSC במיקרוסקופ אור. iPSCs לא ממוינים הם תאים עם גרעינים גדולים, ציטופלזמה קטנה ומושבות תאים קומפקטיות עם קצוות ברורים.
    הערה: ישנם שני פתרונות אנזימטיים לפיצול תאים. במקרה של שימוש בדיספאז (1 U/mL), יש להסיר אזורים של תאים מובחנים. אם משתמשים באנזים ספציפי, אין צורך להבדיל ידנית בין האזורים באמצעות גירוד או יניקה. שמור את האנזים הספציפי בטמפרטורת החדר.
  3. יש לחמם את ה-iPSC בטמפרטורת החדר. שאפו את המדיום ושטפו את לוחית ה-iPSC עם DMEM/F-12 או D-PBS. הוסף 1 מ"ל של האנזים הספציפי לבאר אחת של צלחת של 6 בארות, דגירה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שאב את האנזים הספציפי, ודגר את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-7 דקות.
    הערה: יש למטב את זמן הטיפול האופטימלי באנזימים על סמך קו ה-iPSC בו נעשה שימוש.
  4. לאחר זמן הדגירה, הוסיפו 1 מ"ל של מדיום iPSC שחומם מראש, והקישו בעדינות על צד הצלחת כדי לנתק אגרגטים של מושבות לא מובחנים מפני השטח של הצלחת. הגודל האופטימלי של האגרגטים הוא 50-200 מיקרומטר.
    1. בעזרת פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, מערבבים בעדינות את התרחיף ולאחר מכן זורעים את תרחיף התאים בצפיפות הרצויה על הבאר המצופה BMM. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 ימים כדי להגיע למפגש של 70%.
  5. לפני תחילת ההתמיינות, החלף את מדיום ה-iPSC בתווך האנדודרם (שלב 1.1). רענן את המדיום כל יום. לשלוט בשינויים המורפולוגיים של התאים במהלך שלבי ההתמיינות. אינטראקציות תא-תא מתחילות להופיע לאחר התמיינות, והתאים מקבלים צורה קוצנית.

4. הקמת eHEPO

  1. בצע העשרה של תאי האנדודרמיס EpCAM+ עם FACS.
    1. הפשירו בקבוקון אחד של BMM ספציפי לאורגנואידים (ראו טבלת החומרים) על קרח לפני ניסוי מיון התאים. יש לחמם מראש את צלחות תרבית הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני ניסוי מיון התאים.
    2. שטפו את תאי האנדודרם עם 1x PBS. מוסיפים 300 מיקרוליטר טריפסין, ודוגרים במשך 5 דקות בחממה. הוסף 3 מ"ל של DMEM-F12 קר, ופיפט עם קצות מסנן של 1,000 מיקרוליטר ליצירת תאים בודדים.
    3. אוספים את תרחיף התאים בצינור חרוטי של 15 מ"ל. צנטריפוגה של התאים ב -300 x גרם (בטמפרטורת החדר) למשך 5 דקות. השליכו את ה-supernatant ושטפו את הגלולה עם 10 מ"ל של מאגר FACS (שלב 1.2).
    4. כדי ליצור תרחיף חד-תאי, סנן את התאים תחילה עם מסננת רשת של 100 מיקרומטר ולאחר מכן מסננת רשת של 40 מיקרומטר.
      הערה: לפני השימוש במסננת, שטפו את פני המסננת עם 1 מ"ל של מאגר FACS.
    5. צנטריפוגה את מתלה התאים ב -300 x גרם (בטמפרטורת החדר) למשך 5 דקות. ספור את מספר התא באמצעות Trypan Blue8.
    6. היחס לצביעה הוא 1:11. לדוגמה, השעו מחדש 15 x 106 תאים עם 105 מיקרוליטר של מאגר FACS, והוסיפו 45 מיקרוליטר של FcR ו-15 מיקרוליטר של EpCAM (ראה טבלת החומרים). דגרו על התאים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס, והגנו על הצינור מפני אור. לאחר הדגירה, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר FACS כדי לשטוף את תרחיף התא. צנטריפוגה של התאים ב -300 x גרם (בטמפרטורת החדר) למשך 5 דקות.
    7. השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר FACS. הוסף DAPI (0.5 מיקרומטר/1 מ"ל, ריכוז סופי) לתרחיף התא כדי לכמת את התאים המתים. שמור את התאים על הקרח עד לתחילת שלב מיון התאים.
  2. הטמע את ה-EpCAM ואת התאים הממוינים ב-BMM. לאחר מיון התאים, צנטריפוגה את התאים ב-300 x g למשך 5 דקות כדי למשוך את מאגר ה-FACS. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש 3,000-5,000 תאים ב-20 מיקרוליטר של BMM.
    1. זרעו את התאים על ידי הוספת טיפת BMM למרכז כל צלחת של 48 בארות. דגרו על התאים למשך 2 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להתמצקות ה-BMM. החזירו בזהירות את הצלחת ושמרו אותה בחממה למשך 10 דקות נוספות. שכבו את הטיפה עם מדיום ההרחבה (250 מיקרוליטר לבאר לצלחת של 48 בארות).
    2. רענן את המדיום האורגנואיד כל 3 ימים. בימים 10-11, גודל האורגנואיד יהיה גדול מ-100 מיקרומטר.
  3. בצע דיסוציאציה ובידול מכני של eHEPO.
    1. פצלו כל טיפת אורגנואיד ביחס של 1:4. לפיצול, השליכו את המדיום האורגנואיד והוסיפו 500 מיקרוליטר של Ad-DMEM/F12 קר. עם קצות מסנן של 1,000 μL, פיפטה את טיפות ה-BMM במרץ.
    2. אסוף מקסימום 10 טיפות BMM לצינורות חרוטיים של 15 מ"ל, והוסף 5 מ"ל של Ad-DMEM/F12 קר. שמור את הצינור על קרח למשך 3-5 דקות.
    3. צנטריפוגה של התאים ב-200 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט עד שיישאר 1 מ"ל. צנרת במרץ את גלולת התא 30-40 פעמים באמצעות קצות מסנן של 200 מיקרוליטר. בדוק את גודל האורגנואיד במיקרוסקופ אור, הימנע בזהירות מהיווצרות תרחיף חד-תאי.
    4. לאחר דיסוציאציה מכנית, הוסף 5 מ"ל של Ad-DMEM/F12 קר, וצנטריפוגה את התאים ב-200 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    5. השליכו את הסופרנטנט והשאירו את התרחיף על הקרח עד לזריעת התאים.
    6. זרע טיפת BMM של 50 מיקרוליטר (המכילה 35 מיקרוליטר BMM + 15 מיקרוליטר תאים ו-Ad-DMEM/F-12 לבאר לצלחת של 24 בארות).
    7. הוסף BMP7 (25 ננוגרם/מ"ל, ראה טבלת החומרים) למדיום EM, ותרבית למשך 3 ימים. ביום 4, החלף את המדיום במדיום ההתמיינות (שלב 1.4). רענן את המדיום כל 3 ימים, ותרבית את התאים למשך 14 יום לפחות.

5. אפיון של eHEPOs

  1. לבצע בדיקות היסטולוגיות.
    1. בצע הטמעת פרפין.
      1. הסר את המדיום, הוסף 1-2 מ"ל של PBS 1x קר, והשהה בעדינות את ה-BMM ב-1x PBS הקר. העבירו בזהירות את האורגנואידים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. אפשר לאורגנואידים להתיישב תחת כוח הכבידה, ואז שאב בזהירות את ה- PBS. חזור על שלב הכביסה שלוש פעמים.
      2. הוסף 10 מ"ל של קיבוע טרי (10% פורמלין ניטרלי חוצץ) לאורגנואידים, ודגירה למשך 30 דקות. הסר בעדינות את הקיבוע, הוסף 10 מ"ל PBS קר 1x ודגירה למשך 10 דקות. שאפו בזהירות את ה-PBS.
      3. צבעו את האורגנואידים בתמיסת אאוזין של 0.5% (ראה טבלת חומרים) מומסת באתנול 96% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
        הערה: אם יש לבצע צביעה חיסונית, אין להכתים באאוזין.
      4. ייבשו את האורגנואידים על ידי שטיפה באמצעות סדרת אלכוהול (70% אתנול, 80% אתנול ו-96% אתנול) למשך 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. משרים את האורגנואידים באתנול 100% (אתנול מוחלט) למשך 30 דקות.
      5. נקה את האורגנואידים באמצעות קסילן (ראה טבלת החומרים) שלוש פעמים למשך 20 דקות בכל פעם9.
        זהירות: קסילן היא תרכובת רעילה ודליקה מאוד, לכן טפל בה באמצעות ציוד בטיחות מתאים. הימנע מעבודה בכמויות גדולות.
      6. העבירו בעדינות את האורגנואידים לתבנית בסיס מתכת שחוממה מראש (ראה טבלת החומרים) עם פרפין מותך באמצעות פיפטה מפלסטיק. החזיקו את האורגנואידים בפרפין מותך שלוש פעמים למשך 30 דקות כל אחד באינקובטור של 65 מעלות צלזיוס (החליפו אותו בפרפין מומס טרי חדש בכל החלפה).
      7. לאחר מכן, הטמיעו את האורגנואידים בפרפין טרי חדש. העבירו את האורגנואידים בעדינות לאמצע תבנית בסיס המתכת.
        הערה: לשלב זה, חיוני לעבוד במהירות מכיוון שפרפין מתמצק בטמפרטורת החדר.
      8. העבירו את תבנית בסיס המתכת לצלחת הקרה למשך 10-20 שניות כדי לייצב את האורגנואידים. לאחר מכן, שפכו פרפין מותך כדי לכסות את תבנית בסיס המתכת, והוסיפו קלטת רקמות (ראה טבלת החומרים) על החלק העליון של תבנית בסיס המתכת לתיוג. ודא שיש מספיק פרפין בתבנית, ולאחר מכן תן להם להתמצק על הצלחת הקרה. הסר את תבנית בסיס המתכת.
      9. חותכים קטעים בעובי 5-7 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום סטנדרטי (ראה טבלת החומרים). הנח קטעי פרפין סדרתיים על שקופיות מיקרוסקופ דביקות. תן למגלשות להתייבש למשך הלילה.
    2. בצע צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) וצביעה תקופתית של חומצה-שיף (PAS).
      1. הכניסו את השקופיות המוטבעות בפרפין לחממה של 63 מעלות צלזיוס למשך הלילה לדפרפיניזציה. למחרת, הניחו את השקופיות בקסילן שלוש פעמים למשך 20 דקות בכל פעם. אל תאפשר למגלשות להתייבש.
      2. לחות את השקופיות עם סדרת אלכוהול מדורגת (100% אתנול, 96% אתנול, 80% אתנול ו-70% אתנול) למשך 2 דקות. לאחר מכן, הניחו את השקופיות במים המזוקקים למשך דקה.
      3. לצביעה של H&E, בצע את השלבים הבאים.
      4. הכניסו את השקופיות לתמיסת המטוקסילין למשך 5 דקות. שוטפים את המגלשות במי ברז זורמים למשך 5 דקות. צבעו את השקופיות בתמיסת 1% אאוזין Y (ראה טבלת חומרים) למשך 10 שניות.
      5. ייבשו את החלקים בסדרה של 80% אתנול, 96% אתנול ושני שינויים של 100% אתנול למשך 30 שניות כל אחד.
      6. הכניסו את השקופיות לתוך הקסילן לניקוי שלוש פעמים למשך 20 דקות בכל פעם.
      7. התקן בזהירות את הכיסויהחלקות על החלקים במגלשות הזכוכית עם אמצעי הרכבה (ראה טבלת החומרים). ודא שלא נותרו בועות.
      8. עבור צביעת PAS, בצע את השלבים 5.1.2.4-5.1.2.6, ולאחר מכן את ההליכים לצביעת PAS כפי שדווח על ידי Akbari et al.10. לאחר מכן הרכיב בזהירות את הכיסויים על החלקים במגלשות הזכוכית עם מדיום ההרכבה. ודא שלא נותרו בועות.
    3. בצע צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC).
      1. בצע את שלב 5.1.2.1 ושלב 5.1.2.2 בפרוטוקול הצביעה של H&E.
      2. מחממים את השקופיות במאגר ציטראט של 0.1 M (pH 6.0) במיקרוגל למשך 10 דקות.
      3. החזק עד שהמגלשות יתקררו לטמפרטורת החדר (כ-20 דקות), ושטוף את השקופיות במים מזוקקים.
      4. הכניסו את השקופיות ל-3% H2O2 שהוכנו טריים במתנול למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את השקופיות במים מזוקקים למשך דקה.
      5. חסום את הקישור הלא ספציפי של נוגדני פריימר על ידי דגירה של החלקים בתמיסת חסימה (2% סרום + 0.1% טריטון X-100 + 0.1% BSA) בטמפרטורת החדר למשך שעה.
      6. הסר בעדינות את תמיסת החסימה, והוסף את הנוגדנים העיקריים (E-CAD, ALB, EpCAM, A1AT, CK19) (ראה טבלת החומרים) מדולל בתמיסת החסימה ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      7. למחרת יש לשטוף את השקופיות בזהירות פעמיים למשך 10 דקות (.
      8. הוסף את הנוגדנים המשניים (עז נגד ארנב, עז נגד עכבר) (ראה טבלת החומרים) למשך שעה בטמפרטורת החדר, ושטוף את השקופיות במים מזוקקים למשך 5 דקות (שלוש פעמים).
      9. הכן תמיסת 3'3 diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB, ראה טבלת החומרים) (יש להכין אותה 30 דקות לפני השימוש).
      10. מרחו את תמיסת ה-DAB על המגלשות למשך 1-5 דקות, ושטפו את השקופיות במים מזוקקים למשך 5 דקות (שלוש פעמים).
      11. מכתים את החלקים בהמטוקסילין למשך דקה אחת, ושוטפים את המגלשות במי ברז זורמים למשך דקה.
      12. ייבשו את החלקים בסדרה של 80% אתנול, 96% אתנול ושני שינויים של 100% אתנול למשך 30 שניות כל אחד.
      13. הכניסו את השקופיות לקסילן למשך 20 דקות (שלוש פעמים).
      14. התקן בזהירות את הכיסוי על החלק במגלשת הזכוכית עם מדיום הרכבה. ודא שלא נותרו בועות.
    4. בצע הטמעת OCT.
      1. מקבעים את האורגנואידים באמצעות 4% PFA טרי שהוכן למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את הקיבוע ושטוף עם 1x PBS למשך 15 דקות (שלוש פעמים).
      2. הכינו תמיסת סוכרוז של 30% (w/v) באמצעות מים מזוקקים. הסר את ה-PBS 1x, והוסף את 30% הסוכרוז כדי לייבש את האורגנואידים.
      3. דגרו על האורגנואידים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בתחילה, רוב הרקמות יצופו ב-30% סוכרוז וישקעו לאחר השלמת החלחול. ההגנה בהקפאה עשויה להיחשב שלמה בשלב זה.
      4. הכן קרח יבש או חנקן נוזלי לתהליך ההטמעה.
      5. הכניסו שתיים עד שלוש טיפות של OCT (ראו טבלת החומרים) לתוך תבניות פלסטיק. הניחו את האורגנואידים מעל בכיוון הנכון לחיתוך.
      6. שפכו לאט ובזהירות את ה-OCT על גבי האורגנואידים. היזהר להימנע מבועות. הניחו לאורגנואידים להתיישב תחת כוח הכבידה למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר.
      7. סמן את הקריו-תבניות לפני שלב ההקפאה. מניחים את התבניות על קרח יבש או חנקן נוזלי להקפאה מהירה. מעבירים את הקריו-תבניות ל-80 מעלות צלזיוס, ושומרים אותן שם עד לתהליך החיתוך.
    5. בצע צביעה אימונופלואורסצנטית (IF).
      1. בצע צביעת קטע קפוא.
        1. יבש באוויר את חלקי הקריו למשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר. יש להרטיב את המגלשות במים מזוקקים למשך 5 דקות (שלוש פעמים). הקיפו את הרקמה במחסום הידרופובי באמצעות עט פאפ (ראו טבלת החומרים).
        2. הוסף 200-300 מיקרוליטר של 0.2% טריטון X-100 לכל חלק. שטפו בזהירות את השקופיות למשך 5 דקות (שלוש פעמים). ודא שהחלקים לא נופלים מהמגלשות במהלך שלבי הכביסה.
        3. יש להוסיף תמיסת חסימה (2% סרום + 0.1% טריטון X-100 + 0.1% BSA) למשך שעה בטמפרטורת החדר.
        4. הסר בעדינות את התמיסה החוסמת, הוסף את הנוגדנים העיקריים (E-CAD, A1AT, HNF4α) המדוללים בתמיסת החסימה (ראה טבלת החומרים), ודגר את השקופיות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
        5. הוסף נוגדנים משניים מתאימים (Alexa Fluor 488 [עכבר], Alexa Fluor 594 [עכבר], Alexa Fluor 594 [ארנב]) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (ראה טבלת החומרים), ושטוף את השקופיות במים מזוקקים למשך 5 דקות (שלוש פעמים).
        6. הוסף 100-200 מיקרוליטר של צבע גרעיני Hoechst או DAPI לכל קטע למשך 3 דקות, שטוף את השקופיות עם 1x PBS וחזור על שלב הכביסה שלוש פעמים.
        7. התקן את הכיסויים על החלקים על מגלשות זכוכית עם מדיום הרכבה נגד דהייה. שמור את השקופיות למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והגן עליהן מפני אור עד לתהליך ההדמיה.
      2. בצע צביעה שלמה.
        1. בצע את שלב 5.1.1.1 ושלב 5.1.1.2 בהליך הטמעת הפרפין.
        2. הוסף תמיסת חסימה (0.1%-1% טריטון X-100, 1% DMSO, 1% BSA ו-1% סרום עיזים ב-1x PBS, ראה טבלת החומרים), ודגירה על האורגנואידים בתמיסת חסימה למשך 2-3 שעות בטמפרטורת החדר.
        3. הסר בעדינות את תמיסת החסימה, והוסף את הנוגדנים העיקריים (CK19, CK18, ZO-1, ALB) המדוללים בתמיסת החסימה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס (ראה טבלת החומרים).
        4. למחרת, הסר בעדינות את התמיסה והוסף 1x PBS. תן לאורגנואידים להתיישב תחת כוח הכבידה עד 10 דקות. הסר את התמיסה בזהירות וחזור על שלב הכביסה שלוש פעמים.
        5. דגרו על האורגנואידים עם הנוגדנים המשניים (Alexa Fluor 594 [עכבר], Alexa Fluor 488 [ארנב], Alexa Fluor 488 [עכבר]) למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר. הסר את התמיסה בזהירות וחזור על שלב הכביסה ארבע פעמים.
        6. לצביעה גרעינית, דגרו את האורגנואידים בצבע גרעיני Hoechst או DAPI למשך 10 דקות. שטפו את האורגנואידים על ידי הוספת PBS 1x, וחזרו על שלב הכביסה שלוש פעמים. תן לאורגנואידים להתיישב בתחתית הצינור.
        7. בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק, הסר את האורגנואידים מהצינור והניח אותם על שקופיות זכוכית. הקפד לעשות זאת עם נזק מינימלי לאורגנואידים.
        8. הסר את ה-PBS העודף והוסף כמות (טיפה אחת עד שתיים) של אמצעי הרכבה. הרכיבו בזהירות את הכיסויים על האורגנואידים על מגלשות הזכוכית עם מדיום ההרכבה. שמור את השקופיות ב-4 מעלות צלזיוס, והגן עליהן מפני אור עד לתהליך ההדמיה.
  2. בצע מיקרוסקופ אלקטרונים.
    1. תקן את האורגנואידים באמצעות תמיסת קרנובסקי (2.5% גלוטראלדהיד חוצץ + 2% פרפורמלדהיד במאגר נתרן פוספט 0.1 M [מאגר סורנסן], pH 7.4, ראה טבלת החומרים) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. שטפו את האורגנואידים עם 0.1 M מאגר סורנסון + 0.1 M סוכרוז (1:1) למשך 15 דקות (שלוש פעמים). לאחר מכן, מקבעים את האורגנואידים באוסמיום טטרוקסיד 2% נתרן פוספט (ראה טבלת החומרים) למשך 90 דקות.
    3. הטמיעו את האורגנואידים באגר חם של 2%. חותכים את עודפי האגר סביב האורגנואידים בעזרת lancet. שטפו את האורגנואידים במאגר של סורנסן למשך 15 דקות (שלוש פעמים).
    4. יש לייבש באמצעות 50% אצטון למשך 15 דקות (פעמיים).
    5. ניגוד בן לילה באמצעות 70% אצטון + 1% חומצה פוספוטונגסטית + 0.5% אורניל אצטט (ראה טבלת החומרים) ב-4 מעלות צלזיוס.
    6. למחרת, יבשו את האורגנואידים באמצעות סדרת אצטון (80% אצטון, 90% אצטון, 96% אצטון ו-100% אצטון) למשך 15 דקות (פעמיים).
    7. נקה את האורגנואידים באמצעות תחמוצת פרופילן למשך 10 דקות (פעמיים), ולאחר מכן הכניס את האורגנואידים לתערובת אפון: תחמוצת פרופילן (ראה טבלת החומרים) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. הוסיפו תמיסת אפון חדשה לאורגנואידים, ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    9. למחרת, הכניסו תמיסת אפון טרייה חדשה לתבנית הבסיס, ולאחר מכן הטמיעו את האורגנואידים. הכניסו לאינקובטור למשך 48 שעות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס לפילמור.
    10. חותכים את גושי האפון האורגנואידים בעזרת אולטרה-מיקרוטום המוגדר לעובי חתך של 50-100 ננומטר. שים את החלקים לרשתות מכוסות פורמוריות.
  3. מדוד את פעילות האנזים CYP3A4.
    1. מדוד את פעילות ה-CYP באמצעות ערכה זמינה מסחרית (ראה טבלת החומרים) בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: אנזימי CYP ממירים את המצע לתוצר ביניים הניתן לזיהוי 11,12,13. ישנן שתי אפשרויות (תא ליטי ולא ליטי) למדידת פעילות האנזים CYP. הערכה מספקת אפליקציה לניתוח פעילויות ה-CYP הבסיסיות ופעילויות CYP המושרות לאחר טיפול בתרכובת.
    2. הפעל את הניסוי בשלוש עותקים. קרא את הזוהר עם לומינומטר, וחשב את האות. לנורמליזציה, נסו את האורגנואידים וספרו את מספר התאים.
  4. לבצע כימות אלבומין אנושי.
    1. החלף את מדיום תרבית התאים במדיום טרי 24 שעות לפני בדיקת ELISA. לאחר 24 שעות של דגירה, אספו את מדיום תרבית התאים (300-500 מיקרוליטר), ואת הצנטריפוגה ב-500 x גרם (ב-4 מעלות צלזיוס) למשך 2 דקות כדי להסיר את פסולת התא והחלקיקים. יש להצטער על הסופרנטנט, ולאחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס (עד 3 חודשים).
    2. הפעל את הסטנדרט והדגימה בשכפול. אורגנואידים בוגרים מפרישים אלבומין למדיום התרבותי; כמת אלבומין זה עם ערכת כימות ELISA (ראה טבלת החומרים). מדוד את הספיגה עם קורא צלחות ELISA ב-450 ננומטר תוך 30 דקות לאחר הפסקת הוספת התמיסה. נסה את האורגנואידים, וספור את מספר התאים לנורמליזציה.
  5. בצע את בדיקת חיסול האמוניה.
    1. בצע את בדיקת סילוק האמוניה בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת החומרים). בקצרה, הוסף 1.5 מ"מ NH4Cl למדיום התרבית, ודגירה למשך 24 שעות.
    2. לאחר הדגירה, קבע את ריכוז האמוניה בעזרת ערכת בדיקת אמוניה (ראה טבלת החומרים). חשב את המדידות באמצעות קורא רב-מצבי מרובה צלחות ונרמל את הערכים למספרי התאים.
  6. בצע את בדיקת כוליל גליצילאמידו-פלואורסצאין (CLF).
    1. בקצרה, טפלו באורגנואידים עם 10 מיקרומול/ליטר CLF (ראו טבלת החומרים), ודגרו במשך שעה אחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה יש לשטוף את האורגנואידים עם PBS 1x. לבצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
  7. לבצע ניתוח ביטוי גנים.
    1. עקוב אחר הוראות ערכת RNeasy (ראה טבלת החומרים) כדי לבודד את סך ה-RNA מה-eHEPOs.
    2. הגדר את תגובת ה-PCR באמצעות תערובת מאסטר זמינה מסחרית (ראה טבלת החומרים), בהתאם להוראות היצרן. לאחר הכנת תערובת ה-PCR עבור כל ערכת פריימר, הנח 10 מיקרוליטר מכל דגימה לתוך צלחות ה-qPCR בעלות 96 בארות (טבלה 1).
    3. אטמו את הצלחות בעזרת אוטם דבק, ולאחר מכן צנטריפוגה את הלוחות ב-1,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. טען את הצלחות למכונת PCR. לנרמל את ביטוי הגנים היחסי לבקרה פנימית (RPL41, טבלה 1), ולנתח באמצעות שיטת 2−ΔΔCt 14.

6. שימור בהקפאה של ה-eHEPOs

  1. סמן קריוביאלים עם טוש עמיד בחנקן. בדוק את רמת האיזופרופנול של מיכל ההקפאה, ושמור אותו על 4 מעלות צלזיוס למשך 15-30 דקות לפני תחילת הניסוי.
  2. הקפיאו טיפה אחת של 50 מיקרוליטר BMM בקריוביאל אחד. המשך עם דיסוציאציה מכנית אורגנואידית כמתואר בשלב 4.3. לאחר דיסוציאציה, השעו מחדש את מצבור התאים ב-500 מיקרוליטר של מדיום הקפאה קר, ולאחר מכן העבירו בעדינות את התרחיף לקריוביאלים, ושמרו אותם במיכל ההקפאה.
  3. העבירו את מיכל הקפאת התאים ל-80 מעלות צלזיוס, ולאחר 24 שעות, העבירו את הקריוביאלים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

7. הפשרת ה-eHEPOs

  1. יש לחמם מראש אמבט מים ו-Ad-DMEM/F12 עד 37 מעלות צלזיוס.
  2. הסר בקבוקון אחד של eHEPOs מאחסון החנקן הנוזלי באמצעות כפפות קריוגניות. מניחים את הבקבוקון באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד שגבישי הקרח נמסים. העבירו את מתלה התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל, וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. שאפו את הסופרנטנט, והמשיכו לזרוע את ה-eHEPOs כמתואר בסעיף 4. שכב על טיפת ה-BMM עם מדיום ההרחבה בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 (ראה טבלת החומרים). רענן את המדיום כל 3 ימים, והסר את מעכב ה-ROCK לאחר 3 ימים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ראשית, תאי פיברובלסטים אנושיים או תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMC) תורבו והומרו ל-iPSCs באמצעות תכנות מחדש אפיזומלי. סרום הנוקאאוט הטרי היה חיוני להשגת iPSCs בריאים. לאחר מכן, ה-iPSCs נזרעו לתוך לוחות התרבית המצופים ב-BMM עם מפגש של 50%-60%. קיומם של מושבות iPSC בגודל קטן/בינוני שיפר את יעילות ההתמיינות. לאחר מכן, ה-iPSCs הובחנו לאנדודרם סופי עם מדיום המכיל גורמי Activin A, Wnt3a ו-R-spo1 למשך 5 ימים. במהלך ההתמיינות, מספר התאים וגודלם גדלו באופן משמעותי; לכן, יש לשים לב לרענון המדיום. בתום התמיינות האנדודרם, ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מקיפה לייצור, הרחבה והקפאה/הפשרה של אורגנואידים בכבד החל מ-iPSCs. פרוטוקול זה מכסה את כל השלבים, כולל תרבית ה-iPSCs על המזין והתרבית נטולת המזין, התמיינות אנדודרם דו-ממדית, העשרת תאי האב עם FACS והיווצרות אורגנואידים, ויצירת אורגנואידים המשפרים תפקוד. יתר על כן, ניתנות גם הוראות מפורטות לאימות ואפיון האורגנואידים. המכשול העיקרי ליישום נרחב של הפטוציטים בוגרים ופונקציונליים הוא המקורות המוגבלים של הפטוציטים ראשוניים, חוסר היכולת להרחיב את הפטוציטים לטווח ארוך וש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף. למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם. אסרא ארדל היא מייסדת שותפה של חברת הביוטכנולוגיה ORGANO-ID.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מועצת המחקר המדעי והטכנולוגי של טורקיה (TÜBİTAK) באמצעות פרויקטים SBAG-115S465 ו-SBAG-213S182. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות צנטריפוגה חרוטיים 15 מ"לקורנינג430052
37 מעלות; אמבט מים CNü ve210.NB9
37 מעלות; C, 5% CO2 אינקובטורממרטאינקו 153
צינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"לקורנינג430290
70 ומיקרו; M ו-40 ומיקרו; מסננת תאים mבז352350/ 352340
70% אתנולסיגמא1009832511
A1ATאבקםאילן אילן אילןדילול: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (מעכב TGF ובטא)טוקריס ביוסקיאן2939
אצטוןאיזולאב9,01,026
שקופית מיקרוסקופ דבקהיסטובונדC981040
DMEM-F12 מתקדםג'יבקו12634-010
סוכנות הידיעות הצרפתיתאבקםאב3980דילול: 1/25 (IHC)
אגרEMS10200
אלבאבקםאילן אלכסנדרדילול: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
קמח אלקסה 488 (עכבר)Invitrogenא 11001דילול: 1/1000 (אם)
קמח אלקסה 488 (ארנב)InvitrogenA110034דילול: 1/1000 (אם)
קמח אלכסה 594 (עכבר)Invitrogenא11005דילול: 1/1000 (אם)
קמח אלקסה 594 (ארנב) Invitrogenא11037דילול: 1/1000 (אם)
ערכת בדיקת אמוניהסיגמא-אולדריץ'מק-310
אמוניום קלורידסנטה קרוזSC-202936
תוסף B27 50xג'יבקו12587010
תבנית בסיססאקורה4216
ב-FGFפפרוטק100-18 ב
בטיחות ביולוגית, CLASS II, ארון בטיחותתרמובטוח 2020
פיפטות מכוילותגילסוןF167380
צנטריפוגהאפנדורף5702
כוליל גליצילאמידו-פלואורסצאיןקורנינג451041
חוצץ ציטראט pH 6.0ביו-אופטיקה15-מ103
CK-18סנטה קרוזSC-51582דילול: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19סנטה קרוזSC-6278דילול: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
מיקרוסקופ קונפוקליצייסLSM880
כפפות טיפול קריוגניות והגנה על העינייםקריוקיט5274
קריוסטטלייקהס"מ 1950
צינורות קריוביאלייםקורנינג430659
דברוש11718096001
DAPTסיגמא-אולדריץ'א5942
דקסמתזוןסיגמא-אולדריץ'D4902
Dispase טכנולוגיות תאי גזע7923
DMEM F12ג'יבקו31330038
E-CADסנטה קרוזSC-8426דילול: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTAInvitrogen15575-020
מיקרוסקופ אלקטרוניםצייססיגמא500
ערכת ELISAפורטיס מדעי החיים בתילE88-129
ערכת הטמעה 812EMS14121
אנטלןמרק107961
אאוזין Y %1סיגמא-אולדריץ'HT110332
אפקאםמילטני ביוטק130-059-901דילול: 1/11 (FACS)
אתנולמרק1,00,98,32,511
סרום בקר עוברי (FBS)ג'יבקו26010066
פורסקולין (FSK)טוקריס ביוסקיאן1099
מיכל הקפאה (מר פרוסטי)תרמו5100-0001
מקפיא בינוניג'יבקו12648010
פיפטה פסטר מזכוכיתאיזולאב084.01.001
גלוטמקס 100xג'יבקו35050-068
גלוטרלדהיד %25, דרגת EMEMS16210-1 ליטר
עיזים נגד עכבר HRPתרמו פישר62-6520דילול: 1/1000 (IHC)
עיזים נגד ארנב HRPתרמו פישר31460דילול: 1/1000 (IHC)
סרום עיזיםג'יבקו162-10-072
H2O2מרק107209
המטוקסיליןמיליפורHX86017674
HEPES, 1 מ 'ג'יבקו15630-056
HNF-4&אלפא;אבקםאב55223דילול: 1/50 (IHC)
קרח וקרח יבשתוצרת ביתתוצרת בית
אינקובטור (65 מעלות; C)Nü veEN 400
איזופרופנולסיגמא-אולדריץ'24137
Leu15 גסטרין I אנושיסיגמא-אולדריץ'G9145
לומינומטרברטולד טקליברות 960
מיקס מאסטר אפלייד ביוסיסטמס43676659
מטריצת Matrigel, מורשית hESCקורנינג354277
מטריצת מטריג'ל, ללא פנול אדוםקורנינג356231
מתנולמרק179337
צינורות מיקרוצנטריפוגהאקסיג'ן321-02-501
מיקרוסקופצייסAXIO VERT A1
להב מיקרוטוםנוצהS35, C35
mTeSR1טכנולוגיות תאי גזעSC-05850
צלחות תרבית מתלים מרובות בארותסרשטדט83,39,21,500
תוספת N2 100xג'יבקו17502048
N-אצטילציסטאיןסיגמא-אולדריץ'א9165
פורמלין ניטרלי חומצי %10טקיםTK.60161.05001
ניקוטינאמידסיגמא-אולדריץ'N0636
חומצת אמינו לא חיונית (NEAA)ג'יבקו11140050
אוקטובררקמה-טק4583
אוסמיום טטרוקסידEMS19110
ערכת בדיקות P450-Glo פרומגהV9001
פאפ-פןסיגמאZ377821-1EA
פרפיןטקיםTK.200661.01002
ערכת כתמי PASאבקםab150680
PBSלונזהב17-516
פניצילין/סטרפטומיציןג'יבקו15630-056
חומצה פוספוטונגוסטיתטד פלה19402
סיוע לפיפטהאקסיג'ןמוטופט-1
קורא צלחות varioskan פלאש תרמו5250040
הארכת תושבת אנטי-דהייהInvitrogenעמ' 36980
תחמוצת פרופילן, דרגת EMEMS20401
מערכת PCR בזמן אמתאפלייד ביוסיסטמס7500 מהיר 
אקטיבין אנושי רקומביננטי Aמו"פ D338-AC-050
BMP7 אנושי רקומביננטיפפרוטק120-03
EGF אנושי רקומביננטיפפרוטקAF-100-15
FGF10 אנושי רקומביננטיפפרוטק100-26
FGF19 אנושי רקומביננטיפפרוטק100-32
HGF אנושי רקומביננטיפפרוטק100-39
מעכב רו קינאז, Y-27632 דיהידרוכלורידסיגמא-אולדריץ'Y0503
צינור 1.5 מ"ל ללא RNase/DNaseאקסיג'ן31108101
טיפים לסינון RNase/DNase בחינםסרשטדט703031255
מיקרוטום סיבובילייקה₪2245
RPMI 1640 בינוניג'יבקו61870010
מדיום מותנה Rspo1תוצרת בית
תבנית בסיס לשקופיותביו-אופטיקה15-מק"ק001
סורנסון' s מאגר פוספטEMS11600-10
טווהתרמוהספין שלי 6
פיפטות סרולוגיות סטריליותבז357543
קלטת טישולייקה3802240
גוזםלייקהגימור EM2
טריטון X-100תרמו סיינטיפיק28314
אנזים TrypLE אקספרסג'יבקו12605010
טריפסין-EDTAג'יבקו25200-056
אולטרה-מיקרוטוםלייקהEM UC7
אורנילאצטטEMS22400
מערבולתתרמו88880018
Wnt Surrogate-Fc חלבון פיוז'ןאימונופרסיירסN001
קסילןסיגמא 16446
ZO-1Invitrogen40-2200דילול: 1/400 (אם)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).
  2. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  3. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  4. Takebe, T., et al. Massive and reproducible production of liver buds entirely from human pluripotent stem cells. Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).
  5. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  6. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  7. Ramli, M. N. B., et al. Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease. Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486 (2020).
  8. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 3(1997).
  9. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Histopathology: Methods and Protocols. 1180, 31-43 (2014).
  10. Akbari, S., et al. long-term culture of endoderm-derived hepatic organoids for disease modeling. Stem Cell Reports. 13 (4), 627-641 (2019).
  11. Meisenheimer, P. L., et al. Proluciferin acetals as bioluminogenic substrates for cytochrome P450 activity and probes for CYP3A inhibition. Drug Metabolism and Disposition. 39 (12), 2403-2410 (2011).
  12. Cali, J. J., Ma, D., Wood, M. G., Meisenheimer, P. L., Klaubert, D. H. Bioluminescent assays for ADME evaluation: dialing in CYP selectivity with luminogenic substrates. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (9), 1115-1130 (2012).
  13. Cali, J. J., et al. Luminogenic cytochrome P450 assays. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (4), 629-645 (2006).
  14. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  15. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  16. Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
  17. Akbari, S., Arslan, N., Senturk, S., Erdal, E. Next-generation liver medicine using organoid models. Frontiers in Cell Development and Biology. 7, 345(2019).
  18. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mule, K., Stolz, D. B. Histological organization in hepatocyte organoid cultures. American Journal of Pathology. 159 (5), 1877-1887 (2001).
  19. Shinozawa, T., et al. High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids. Gastroenterology. 160 (3), 831-846 (2021).
  20. Wu, F., et al. Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Hepatology. 70 (6), 1145-1158 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ocytesFACSEpCAMCytochrome P450

מאמרים קשורים