מאמר שיטה

יצירת אורגנואידים פונקציונאליים בכבד אנדודרמלי

DOI:

10.3791/65027

⸱

2 במאי 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Department of Histology and Embryology, Health Science Institute, Dokuz Eylul University, 3Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Izmir Tinaztepe University, 4Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 5Department of Pediatric Gastroenterology and Metabolism, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 6Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Koc University, 7Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את היצירה של אורגנואידים אנדודרמליים בכבד (eHEPOs) מהירים וניתנים לשחזור. בעזרת פרוטוקול זה, ניתן לייצר eHEPOs תוך שבועיים ולהתרחב לטווח ארוך (יותר משנה) מבלי לאבד את הבידול והפונקציונליות שלהם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיית אורגנואידים אפשרה לנו ליצור מגוון של מיני מבנים דמויי איברים אנושיים, כגון עבור הכבד, המוח והמעי, במבחנה. ההתקדמות המדהימה במודלים אורגנואידים פתחה לאחרונה עידן ניסיוני חדש ליישומים שונים במודלים של מחלות, ביולוגיה התפתחותית וגילוי תרופות. תאי גזע בוגרים או אורגנואידים בכבד שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) שולטים ביצירת הפטוציטים לשימוש ליישומים מגוונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חזק וניתן לשחזור ליצירת אורגנואידים בכבד מתאי גזע פלוריפוטנטיים. פרוטוקול זה חל על תאים בריאים שמקורם בחולה. כדי להשיג אורגנואידים בכבד (eHEPOs) שמקורם באנדודרם תלת-ממדי, iPSCs התמיינו תחילה ישירות לתאים אנדודרמליים, ולאחר מכן נעשה שימוש בתאי EpCAM חיוביים (EpCAM+) מועשרים ב-FACS כדי לבסס אורגנואידים בכבד באמצעות מדיום ההתפשטות. אנו מספקים שיטה מהירה ויעילה ליצירת אורגנואידים בכבד תוך שבועיים. האורגנואידים הנוצרים מחקים את התכונות והתפקודים החיוניים של הפטוציטים, כגון הפרשת אלבומין, אחסון גליקוגן ופעילות אנזים ציטוכרום P450. מלבד הדמיון בביטוי הגנים הספציפיים לכבד, eHEPOs מורכבים מתאי אפיתל מקוטבים עם תעלות מרה ביניהם. בנוסף, ניתן להרחיב את ה-eHEPOs ולעבור מעברים סדרתיים לטווח ארוך (שנה) מבלי לאבד את יכולתם להתמיין להפטוציטים בוגרים. לפיכך, eHEPOs מספקים מקור חלופי לייצור הפטוציטים פונקציונליים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים הם מבנים דמויי איברים ממוזערים הגדלים בתנאי תרבית תלת מימדיים המחקים את המיקרו-סביבה של האיבר וכוללים את הגורמים המהותיים הדרושים לארגון עצמי והתחדשות עצמית בהתפתחות האיברים עצמה. אורגנואידים יכולים להיגזר מתאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs) או מתאים בוגרים שמקורם ברקמות (תאי גזע או אב)1. למרות שהארגון המדויק דמוי האיבר והדמיון התפקודי לאיבר הספציפי הופכים אותם לכלים רבי ערך למידול מחלות, הם עדיין זקוקים לשיפורים נוספים במונחים של סטנדרטיזציה בתרבית. בפרט, פורסמו מספר פרוטוקולים ליצירת אורגנואידים בכבד, והם נבדלים זה מזה במורכבותם וביכולת השחזור שלהם2. לדוגמה, האורגנואידים של ניצני....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אישורים הקשורים לצעדים ניסיוניים התקבלו מוועדת האתיקה המקומית למחקר קליני של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת דוקוז אילול (2013/25-4, 12 במאי 2013; 2016/30-29, 24 בנובמבר 2016).

1. הכנת פתרונות לתרבית תאים

  1. הכן את מדיום ההתמיינות של האנדודרם על ידי ערבוב הרכיבים הבאים במכסה זרימה למינרית: 1% B27, 100 ננוגרם/מ"ל Activin A, Wnt3a או 30% wnt3a-CM, ו-R-spo1 או 10% R-spo1-CM (ראה טבלת החומרים).
  2. הכן את מאגר מיון התאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) עם ההרכב הבא: PBS, 1 מ"מ EDTA, 25 מ"מ HEPES, 1% FBS.
  3. הכן את מדיום ההרחבה (EM): 1% N2, 1% B27, 1.25 מ"מ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ראשית, תאי פיברובלסטים אנושיים או תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMC) תורבו והומרו ל-iPSCs באמצעות תכנות מחדש אפיזומלי. סרום הנוקאאוט הטרי היה חיוני להשגת iPSCs בריאים. לאחר מכן, ה-iPSCs נזרעו לתוך לוחות התרבית המצופים ב-BMM עם מפגש של 50%-60%. קיומם של מושבות iPSC בגודל קטן/בינוני שיפר את יעילות ההתמיינות. לאחר מכן, ה-iPSCs הובחנו לאנדודרם סופי עם מדיום המכיל גורמי Activin A, Wnt3a ו-R-spo1 למשך 5 ימים. במהלך ההתמיינות, מספר התאים וגודלם גדלו באופן משמעותי; לכן, יש לשים לב לרענון המדיום. בתום התמיינות האנדודרם, ת.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מקיפה לייצור, הרחבה והקפאה/הפשרה של אורגנואידים בכבד החל מ-iPSCs. פרוטוקול זה מכסה את כל השלבים, כולל תרבית ה-iPSCs על המזין והתרבית נטולת המזין, התמיינות אנדודרם דו-ממדית, העשרת תאי האב עם FACS והיווצרות אורגנואידים, ויצירת אורגנואידים המשפרים תפקוד. יתר על כן, ניתנות גם הוראות מפורטות לאימות ואפיון האורגנואידים. המכשול העיקרי ליישום נרחב של הפטוציטים בוגרים ופונקציונליים הוא המקורות המוגבלים של הפטוציטים ראשוניים, חוסר היכולת להרחיב את הפטוציטים לטווח ארוך וש.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף. למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם. אסרא ארדל היא מייסדת שותפה של חברת הביוטכנולוגיה ORGANO-ID.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מועצת המחקר המדעי והטכנולוגי של טורקיה (TÜBİTAK) באמצעות פרויקטים SBAG-115S465 ו-SBAG-213S182. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות צנטריפוגה חרוטיים 15 מ"לקורנינג430052
37 מעלות; אמבט מים CNü ve210.NB9
37 מעלות; C, 5% CO2 אינקובטורממרטאינקו 153
צינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"לקורנינג430290
70 ומיקרו; M ו-40 ומיקרו; מסננת תאים mבז352350/ 352340
70% אתנולסיגמא1009832511
A1ATאבקםאילן אילן אילןדילול: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (מעכב TGF ובטא)טוקריס ביוסקיאן2939
אצטוןאיזולאב9,01,026
שקופית מיקרוסקופ דבקהיסטובונדC981040
DMEM-F12 מתקדםג'יבקו12634-010
סוכנות הידיעות הצרפתיתאבקםאב3980דילול: 1/25 (IHC)
אגרEMS10200
אלבאבקםאילן אלכסנדרדילול: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
קמח אלקסה 488 (עכבר)Invitrogenא 11001דילול: 1/1000 (אם)
קמח אלקסה 488 (ארנב)InvitrogenA110034דילול: 1/1000 (אם)
קמח אלכסה 594 (עכבר)Invitrogenא11005דילול: 1/1000 (אם)
קמח אלקסה 594 (ארנב) Invitrogenא11037דילול: 1/1000 (אם)
ערכת בדיקת אמוניהסיגמא-אולדריץ'מק-310
אמוניום קלורידסנטה קרוזSC-202936
תוסף B27 50xג'יבקו12587010
תבנית בסיססאקורה4216
ב-FGFפפרוטק100-18 ב
בטיחות ביולוגית, CLASS II, ארון בטיחותתרמובטוח 2020
פיפטות מכוילותגילסוןF167380
צנטריפוגהאפנדורף5702
כוליל גליצילאמידו-פלואורסצאיןקורנינג451041
חוצץ ציטראט pH 6.0ביו-אופטיקה15-מ103
CK-18סנטה קרוזSC-51582דילול: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19סנטה קרוזSC-6278דילול: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
מיקרוסקופ קונפוקליצייסLSM880
כפפות טיפול קריוגניות והגנה על העינייםקריוקיט5274
קריוסטטלייקהס"מ 1950
צינורות קריוביאלייםקורנינג430659
דברוש11718096001
DAPTסיגמא-אולדריץ'א5942
דקסמתזוןסיגמא-אולדריץ'D4902
Dispase טכנולוגיות תאי גזע7923
DMEM F12ג'יבקו31330038
E-CADסנטה קרוזSC-8426דילול: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTAInvitrogen15575-020
מיקרוסקופ אלקטרוניםצייססיגמא500
ערכת ELISAפורטיס מדעי החיים בתילE88-129
ערכת הטמעה 812EMS14121
אנטלןמרק107961
אאוזין Y %1סיגמא-אולדריץ'HT110332
אפקאםמילטני ביוטק130-059-901דילול: 1/11 (FACS)
אתנולמרק1,00,98,32,511
סרום בקר עוברי (FBS)ג'יבקו26010066
פורסקולין (FSK)טוקריס ביוסקיאן1099
מיכל הקפאה (מר פרוסטי)תרמו5100-0001
מקפיא בינוניג'יבקו12648010
פיפטה פסטר מזכוכיתאיזולאב084.01.001
גלוטמקס 100xג'יבקו35050-068
גלוטרלדהיד %25, דרגת EMEMS16210-1 ליטר
עיזים נגד עכבר HRPתרמו פישר62-6520דילול: 1/1000 (IHC)
עיזים נגד ארנב HRPתרמו פישר31460דילול: 1/1000 (IHC)
סרום עיזיםג'יבקו162-10-072
H2O2מרק107209
המטוקסיליןמיליפורHX86017674
HEPES, 1 מ 'ג'יבקו15630-056
HNF-4&אלפא;אבקםאב55223דילול: 1/50 (IHC)
קרח וקרח יבשתוצרת ביתתוצרת בית
אינקובטור (65 מעלות; C)Nü veEN 400
איזופרופנולסיגמא-אולדריץ'24137
Leu15 גסטרין I אנושיסיגמא-אולדריץ'G9145
לומינומטרברטולד טקליברות 960
מיקס מאסטר אפלייד ביוסיסטמס43676659
מטריצת Matrigel, מורשית hESCקורנינג354277
מטריצת מטריג'ל, ללא פנול אדוםקורנינג356231
מתנולמרק179337
צינורות מיקרוצנטריפוגהאקסיג'ן321-02-501
מיקרוסקופצייסAXIO VERT A1
להב מיקרוטוםנוצהS35, C35
mTeSR1טכנולוגיות תאי גזעSC-05850
צלחות תרבית מתלים מרובות בארותסרשטדט83,39,21,500
תוספת N2 100xג'יבקו17502048
N-אצטילציסטאיןסיגמא-אולדריץ'א9165
פורמלין ניטרלי חומצי %10טקיםTK.60161.05001
ניקוטינאמידסיגמא-אולדריץ'N0636
חומצת אמינו לא חיונית (NEAA)ג'יבקו11140050
אוקטובררקמה-טק4583
אוסמיום טטרוקסידEMS19110
ערכת בדיקות P450-Glo פרומגהV9001
פאפ-פןסיגמאZ377821-1EA
פרפיןטקיםTK.200661.01002
ערכת כתמי PASאבקםab150680
PBSלונזהב17-516
פניצילין/סטרפטומיציןג'יבקו15630-056
חומצה פוספוטונגוסטיתטד פלה19402
סיוע לפיפטהאקסיג'ןמוטופט-1
קורא צלחות varioskan פלאש תרמו5250040
הארכת תושבת אנטי-דהייהInvitrogenעמ' 36980
תחמוצת פרופילן, דרגת EMEMS20401
מערכת PCR בזמן אמתאפלייד ביוסיסטמס7500 מהיר 
אקטיבין אנושי רקומביננטי Aמו"פ D338-AC-050
BMP7 אנושי רקומביננטיפפרוטק120-03
EGF אנושי רקומביננטיפפרוטקAF-100-15
FGF10 אנושי רקומביננטיפפרוטק100-26
FGF19 אנושי רקומביננטיפפרוטק100-32
HGF אנושי רקומביננטיפפרוטק100-39
מעכב רו קינאז, Y-27632 דיהידרוכלורידסיגמא-אולדריץ'Y0503
צינור 1.5 מ"ל ללא RNase/DNaseאקסיג'ן31108101
טיפים לסינון RNase/DNase בחינםסרשטדט703031255
מיקרוטום סיבובילייקה₪2245
RPMI 1640 בינוניג'יבקו61870010
מדיום מותנה Rspo1תוצרת בית
תבנית בסיס לשקופיותביו-אופטיקה15-מק"ק001
סורנסון' s מאגר פוספטEMS11600-10
טווהתרמוהספין שלי 6
פיפטות סרולוגיות סטריליותבז357543
קלטת טישולייקה3802240
גוזםלייקהגימור EM2
טריטון X-100תרמו סיינטיפיק28314
אנזים TrypLE אקספרסג'יבקו12605010
טריפסין-EDTAג'יבקו25200-056
אולטרה-מיקרוטוםלייקהEM UC7
אורנילאצטטEMS22400
מערבולתתרמו88880018
Wnt Surrogate-Fc חלבון פיוז'ןאימונופרסיירסN001
קסילןסיגמא 16446
ZO-1Invitrogen40-2200דילול: 1/400 (אם)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).
  2. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ocytesFACSEpCAMCytochrome P450

מאמרים קשורים