לסוסים יש יכולת פעילות אירובית יוצאת דופן, מה שהופך את שרירי השלד של הסוסים לרקמה חשובה הן לחקר הפיזיולוגיה של פעילות גופנית של סוסים והן לפיזיולוגיה של המיטוכונדריה של יונקים. מאמר זה מתאר טכניקות להערכה מקיפה של תפקוד המיטוכונדריה בשרירי השלד של סוסים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פלואורו-רספירומטריה ברזולוציה גבוהה של שרירי השלד של סוסים
במאמר זה
סיכום
תקציר
תפקוד המיטוכונדריה - זרחן חמצוני ויצירת מיני חמצן תגובתי - הוא קריטי הן לבריאות והן למחלות. לפיכך, מדידת תפקוד המיטוכונדריה היא בסיסית במחקר ביו-רפואי. שרירי השלד הם מקור חזק למיטוכונדריה, במיוחד אצל בעלי חיים עם יכולת אירובית גבוהה מאוד, כגון סוסים, מה שהופך אותם לנושאים אידיאליים לחקר הפיזיולוגיה של המיטוכונדריה. מאמר זה מדגים את השימוש ברספירומטריה ברזולוציה גבוהה עם פלואורומטריה בו-זמנית, עם מיטוכונדריה של שרירי השלד שזה עתה נקטפו, כדי לכמת את היכולת לחמצן מצעים במצבים מיטוכונדריאליים שונים ולקבוע את היכולות היחסיות של אלמנטים שונים של נשימה מיטוכונדריאלית. טטרמתילרודאמין מתילאסטר משמש להדגמת ייצור פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי הנובע מחמצון המצע, כולל חישוב היעילות היחסית של המיטוכונדריה על ידי חישוב פוטנציאל הממברנה היחסי שנוצר ליחידת זרם חמצן בו-זמני. ההמרה של ADP ל-ATP גורמת לשינוי בריכוז המגנזיום בתא התגובה, עקב זיקות שונות של האדנילטים למגנזיום. לכן, מגנזיום ירוק יכול לשמש למדידת קצב סינתזת ATP, המאפשר חישוב נוסף של יעילות הזרחן החמצוני (היחס בין זרחן לחמצון [P/O]). לבסוף, השימוש ב- Amplex UltraRed, המייצר מוצר פלואורסצנטי (resorufin) בשילוב עם מי חמצן, מאפשר לכמת את ייצור מיני החמצן הריאקטיבי במהלך נשימה מיטוכונדריאלית, כמו גם את הקשר בין ייצור ROS לנשימה בו-זמנית. טכניקות אלה מאפשרות כימות חזק של הפיזיולוגיה המיטוכונדריאלית במגוון תנאים מדומים שונים, ובכך שופכות אור על תרומתו של מרכיב תאי קריטי זה לבריאות ולחולי כאחד.
מבוא
המיטוכונדריה של תאים איקריוטים מייצרים את רוב ה-ATP המשמש את התאים לעבודה ולתחזוקה1. שלב מפתח בייצור המיטוכונדריה של ATP הוא המרת חמצן למים, ולכן היכולת המטבולית של המיטוכונדריה והתאים הקשורים אליה מכומתת לעתים קרובות באמצעות מדידת צריכת חמצן2. עם זאת, הפיזיולוגיה של המיטוכונדריה מורכבת יותר מהתהליך הפשוט של צריכת חמצן, והסתמכות על נקודת קצה זו מספקת הערכה חלקית בלבד של ההשפעה של תפקוד מיטוכונדריאלי ותפקוד לקוי על בריאות התאים. אפיון מלא של תפקוד המיטוכונדריה דורש הערכה לא רק של צריכת חמצן, אלא גם של ייצור ATP כמו גם מיני חמצן תגובתי (ROS).
מדדים נוספים של תפקודי מיטוכונדריה מרכזיים יכולים להת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אוקלהומה סטייט. במחקר זה נעשה שימוש בארבעה ג'לדינגים מסוג ת'ורוברד (17.5 ± 1.3 שנים, 593 ± 45 ק"ג) כדי להפיק את התוצאות המייצגות.
1. השגת דגימת ביופסיה של שריר השלד
- יש להשיג ביופסיות שריר השלד (בטכניקה סטרילית) ממרכז שריר הסמיטנדינוסוס (או שריר מעניין אחר), באמצעות מחט ביופסיה 12 G University College Hospital (UCH) (ראה טבלת חומרים) תחת טשטוש קל, ושימוש בהרדמה מקומית בעקבות דו"חשפורסם בעבר 11.
- העבר את דגימות הביופסיה באופן מיידי לבקבוקונים עם תמיסת מדיה להובלת ביופסיה קרה כקרח (2.77 mM CaK 2-E....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מצב הייחוס המוצע הוא של ת'ורוברד יושבני בריא (ללא כושר מוגבר עקב פעילות גופנית כפויה) ודגימת שריר טרייה שנאספה ממרכז שריר יציבה, המכילה אחוז גבוה של סיבי שריר שלד עשירים במיטוכונדריה מסוג I ומודגרת בתנאים הקרובים לחילוף חומרים במנוחה (כלומר, 38 מעלות צלזיוס ו- pH 7.0). בתנאים אלה, החוקר יכול לצפות לערכי L N של 2.71 ± 0.90, ערכי PN של 62.40 ± 26.22, ערכי PN+S של 93.67 ± 34.76, וערכי PS של 46.93 ± 14.58 pmol O2 x s-1 x mL-1 (איור 3
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הוספת אותות פלואורסצנטיים לפלט הסטנדרטי של הרספירומטר ברזולוציה גבוהה מספקת מידע רב ערך בנוגע לפיזיולוגיה של המיטוכונדריה, אך כיול קפדני של האות הפלואורסצנטי הוא קריטי לאיכות הנתונים. הפרוטוקולים המקוריים לשימוש ב-MgG מציעים כי עקומות הכיול שנוצרו בעת חישוב קבועי דיסוציאציה של מגנזיום-אדנילט יכולות להיות מיושמות על בדיקות עוקבות4; עם זאת, ייתכן שהאות הפלואורסצנטי מה- MgG אינו ניתן לשחזור מספיק מבדיקה לבדיקה עבור גישה זו. לכן, כל בדיקה מכויילת עם טיטרציה אוטומטית של MgCl2, ועקומת הכיול ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים הקשורים לכתב יד זה.
תודות
המחברים רוצים להודות על התמיכה הנדיבה של הקתדרה לרפואת ספורט סוסים ע"ש ג'ון ודבי אוקסלי וקרן המחקר של מועדון הג'וקי גרייסון.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| סידן פחמתי | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | תוכנה להפעלת O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| גלוטמט | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | H7523 | |
| חזרת פרוקסידאז | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | P8250 | |
| מי חמצן | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | 516813 | יש להכין טרי מדי יום לפני הבדיקה |
| אימידזול | סיגמא-אולדריץ' ( MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | M8250 | |
| מגנזיום כלוריד הקסהידרט | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | M9272 | |
| מגנזיום | ירוק תרמו פישר סיינטיפיק | M3733 | |
| מלאט | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | M1000 | |
| מניטול | סיגמא-אולדריץ' ( MilliporeSigma) | M9647 | |
| ערכת בידוד מיטוכונדריאלי | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | יחידות מרובות הנדרשות להפעלת ספקטרום מלא של בדיקות בו זמנית. | |
| פוספוקריאטין | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | P7936 | |
| אשלגן הידרוקסיד | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | P1767 | |
| אשלגן לקטוביונאט | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | L2398 | |
| אשלגן פוספט | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | P0662 | |
| פירובט | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | P2256 | יש להכין טרי מדי יום לפני הבדיקה |
| רוטנון | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | R8875 | |
| סוקסינט | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | S2378 | |
| סוכרוז | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | 84097 | |
| סופראוקסיד דיסמוטאז | סיגמא-אולדריץ' (MilliporeSigma) | S8160 | |
| טאורין | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| משאבת טיטרציה | Oroboros Inc | ||
| מזרקי טיטרציה | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH מחט ביופסיה | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | זמין במגוון גדלים |
מקורות
- Wilson, D. F. Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization. Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introdu....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
