מאמר שיטה

יצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לשומן חום באמצעות מערכת RNA חד-מנחה משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-Adeno-Associated Virus

DOI:

10.3791/65083

⸱

24 במרץ 2023

 ,  , 
1Section on Integrative Physiology and Metabolism, Research Division, Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההליכים הטכניים ליצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לרקמת שומן חומה (BAT) הממנפים מערכת משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו- ADENO-associated virus (AAV) Single Guide RNA (sgRNA). השלבים המתוארים כוללים את התכנון של sgRNAs, הכנת חלקיקי AAV-sgRNA, ואת microinjection של AAV לתוך אונות BAT.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמת שומן חומה (BAT) היא מחסן שומן המתמחה בפיזור אנרגיה שיכול לשמש גם כאיבר אנדוקריני באמצעות הפרשת מולקולות ביו-אקטיביות. יצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים ל-BAT היא אחת הגישות הפופולריות ביותר להבנת תרומתו של גן מעניין לוויסות אנרגיה בתיווך BAT. אסטרטגיית מיקוד הגנים הקונבנציונלית המשתמשת במערכת Cre-LoxP הייתה הגישה העיקרית ליצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לרקמות. עם זאת, גישה זו גוזלת זמן ומייגעת. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לנוקאאוט מהיר ויעיל של גן בעל עניין ב-BAT באמצעות מערכת משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-ADENO-associated virus (AAV) Single Guide RNA (sgRNA). ה- BAT interscapular ממוקם בשכבה העמוקה בין השרירים. לכן, ה-BAT חייב להיות חשוף על מנת להזריק את ה-AAV בצורה מדויקת וישירה לתוך ה-BAT בתוך שדה הראייה. טיפול כירורגי מתאים הוא חיוני למניעת נזק לעצבים ולכלי הדם הסימפתטיים, כגון וריד הזולצר המתחבר ל- BAT. כדי למזער את הנזק לרקמות, יש צורך קריטי להבין את המיקום האנטומי התלת מימדי של ה- BAT ואת המיומנויות הכירורגיות הנדרשות בשלבים הטכניים. פרוטוקול זה מדגיש את ההליכים הטכניים העיקריים, כולל תכנון sgRNA המכוון לגן המעניין, הכנת חלקיקי AAV-sgRNA, והניתוח למיקרו-הזרקה ישירה של AAV לשתי אונות BAT ליצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים ל-BAT, שניתן ליישם באופן נרחב כדי לחקור את הפונקציות הביולוגיות של גנים ב-BAT.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השמנת יתר עולה בקצב משמעותי ברחבי העולם, מה שמוביל למגוון רחב של מחלות מטבוליות 1,2,3. רקמת השומן היא המפתח לפתולוגיות אלה. שני הסוגים השונים מבחינה תפקודית של רקמת השומן הקיימים הם רקמת השומן הלבנה (WAT), המאחסנת קלוריות עודפות, ורקמת השומן החומה (BAT) ושומן הבז'/בריט הקשור אליה, המפזרים אנרגיה לצורך תרמוגנזה. בעוד BAT כבר מוכר על תפקוד פיזור האנרגיה שלה, יש לו גם פונקציות אנדוקריניות באמצעות ייצור של מולקולות ביו-אקטיביות המווסתות את חילוף החומרים באיברים דיסטליים 4,5. מחקרים רבים במכרסמים הוכיחו כי הגדלת כמות או פעילות השומן החום או הבז' מובילה להוצאה אנרגטית מוגברת ולשיפור הרגישות לאינסולין. בבני אדם, אנשים עם BAT לגילוי יש שכיחות נמוכה משמעותית של מחלות cardiometabolic6. לפיכך, BAT טומן בחובו פוטנציאל טיפולי מצוין עבור sequelae מטבולי הקשור להשמנת יתר 7,8,9.

כדי לחקור את הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של התפתחות ותפקוד BAT ולהבהיר את המנגנונים המולקולריים המעורבים בתהליכים אלה, מודל העכבר המהונדס הספציפי ל-BAT הוא שיטה לבחירה10. מערכת הרקומבינציה Cre-LoxP היא האמצעי הנפוץ ביותר לייצור עכברי נוקאאוט מותנה על ידי עריכת גנום העכבר. מערכת זו אפשרה שינוי (ביטוי יתר או נוקאאוט) של גנים בעלי עניין באופן ספציפי לרקמה/תא11. ניתן להשתמש בו גם כדי לתייג סוג תא מסוים על ידי ביטוי גן כתב פלואורסצנטי סלקטיבי.

לאחרונה, גישת מערכת Cre-LoxP פותחה עוד יותר על ידי שילוב של טכנולוגיית CRISPR-Cas9 ומערכת RNA (sgRNA)12 הקשורה לווירוס אדנו (AAV). מערכת CRISPR-Cas9 היא כלי ספציפי ויעיל לעריכת גנים כדי לשנות, לווסת או להתמקד באזורים מדויקים של גנום13. עריכת גנום מבוססת CRISPR-Cas9 מאפשרת מניפולציה גנטית מהירה של אתרים גנומיים מכיוון שהיא אינה דורשת רקומבינציה הומולוגית עם וקטור מיקוד גנים. טכניקות משולבות של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-AAV-sgRNA מאפשרות לחוקרים להבין את תפקודי הגנים בצורה מדויקת יותר בכך שהן מאפשרות לחקור את תפקידם של גנים מעניינים בזמנים רצויים ברקמות/תאים. בנוסף, טכניקות משולבות אלה מפחיתות את הזמן והמאמץ הנדרשים ליצירת עכברים טרנסגניים ומאפשרות בקרה זמנית של פעילות CRISPR-Cas9 לעריכת גנום אינדוקטיבי בעכברים אם נעשה שימוש בקו Cre מושרה14.

וקטורי AAV בטוחים ויעילים במערכות העברת גנים vivo. עם זאת, AAVs המכוונים לרקמת שומן פיגרו אחרי יישומים ברקמות אחרות, כגון המוח, הלב, הכבד ושריר15. בשל יעילות ההולכה הנמוכה יחסית והטרופיזם עם וקטורי סרוטיפ טבעיים, העברת גנים מונחי AAV לרקמת השומן עדיין מאתגרת15. במהלך 5 השנים האחרונות, אנו ואחרים ביססנו בהצלחה דרכים יעילות וזעיר פולשניות להעברת גנים מונחי AAV לרקמת השומן ויצרנו מודלים עכבריים המאפשרים לנו להבין את הגנים המעורבים בוויסות תפקוד BAT16,17,18,19. לדוגמה, על ידי שימוש ב- AAV8 כדי לספק sgRNA המכוון ל- Alox12, המקודד 12-lipoxygenase (12-LOX), לתוך ה- BAT של עכברי Ucp1-Cre/Cas9, גילינו כי BAT פעיל מייצר מטבוליטים של 12-LOX, כלומר 12-hydroxy-eicosapentaenoic acid (12-HEPE) ו- 13R, 14S-dihydroxy docosahexaenoic acid (maresin 2), כדי לווסת את חילוף החומרים של גלוקוז ולפתור דלקת הקשורה להשמנת יתר, בהתאמה16, 17. כאן, אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב על ההליכים הטכניים, במיוחד הניתוח למיקרו-הזרקה ישירה של AAV-sgRNA לאונות העטלף, כדי ליצור עכברי נוקאאוט ספציפיים ל-BAT באמצעות מערכת Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-AAV-sgRNA המשולבת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים והליכי הטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז ג'וסלין לסוכרת.

1. סינון sgRNA יעיל בתאים בתרבית

הערה: כדי להפוך את הבדיקה לחסכונית, לפני אריזת ה-sgRNA לחלקיקי AAV, אנו ממליצים לבדוק sgRNA שונים בתאים בתרבית באמצעות מערכת מבוססת לנטיוירוס עבור ביטוי Cas9/sgRNA (איור 1) ולבחור את ה-sgRNA שנותנים את יעילות ההפלות הגבוהה ביותר עבור ניסויי in vivo .

  1. עיצוב CRISPR-Cas9 sgRNA
    1. עצב sgRNA באמצעות כלים מקוונים, כגון כלי העיצוב הרחב sgRNA (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)20,21, הכלי המקוון CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)22 וכלים זמינים אחרים.
    2. הזן שמות גנים או רצפי יעד DNA בתיבה שם גן, ובחר NGG כמוטיב הסמוך לפרוטוספייסר (PAM) עבור SpCas9 ליצירת רצפי sgRNA פוטנציאליים.
    3. בחר את sgRNAs עם יעילות חזויה גבוהה על המטרה ופעילות נמוכה מחוץ למטרה. לדוגמה, sgRNA עם ציון ספציפיות של לפחות 50 בפלט CRISPOR מומלצים לשימוש. מבין ה-sgRNA הספציפיים שעוברים את המסנן, בחרו את אלה עם ציוני יעילות גבוהים23.
      הערה: באופן כללי, שלושה או ארבעה sgRNA נבחרים כדי להבטיח זיהוי של sgRNA יעיל.
  2. בניית פלסמיד CRISPR-Cas9 sgRNA
    1. סינתזה של זוגות אוליגו sgRNA המקודדים 20 רצפים ממוקדים של נוקלאוטידים (nt) עם שלוחות (הן 5' והן '3) מאתר ההגבלה BsmBI (טבלה 1) באמצעות פלטפורמת סינתזת DNA.
    2. Ligate oligo anneal pairs עם וקטור LentiCRISPR v2 ליניארי BsmBI.
    3. הפוך את מוצר הקשירה לזן Stbl3 E. coli , ואשר את החדרת sgRNA על ידי ריצוף DNA Sanger באמצעות פריימר קדמי U6.
      הערה: ראה את הליך השיבוט המפורט בפרוטוקול של Addgene שנקרא LentiCRISPRv2 ו- lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 ו- Single Guide RNA24.
  3. ייצור חלקיקים לנטי-ויראליים
    1. כ 24 שעות לפני הטרנספקציה, צלחת 7 x 105 תאים HEK-293 ב 4 מ"ל של מדיום גידול מלא בצלחת תרבית רקמה 6 ס"מ.
    2. הוסף 15 μL של מגיב טרנספקציה LT1 ל 250 μL של תווך ללא סרום, ודגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    3. הכינו קוקטייל טרנספקציה לכל sgRNA לפי טבלה 2 ב-250 μL של מדיום ללא סרום. מערבבים את מגיב הטרנספקציה שהוכן בשלב 1.3.2 עם קוקטייל הפלסמיד, ודגרים במשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. החלף את מדיום הגידול המלא ב- 3.5 מ"ל של מדיום גידול טרי עבור תאי HEK-293, ולאחר מכן הוסף את תערובת מגיב הטרנספקציה של ה- DNA טיפתית לתאי HEK-293 שגודלו בתרבית של 3.5 מ"ל של מדיום גידול טרי.
    5. לאחר 12-15 שעות של transfection, לשנות את המדיום כדי להסיר מגיב transfection, ולהחליף אותו עם 4 מ"ל של מדיום צמיחה טרי.
    6. לאחר 24 שעות של דגירה, אספו את מדיום תרבית התאים המכיל חלקיקים לנטי-ויראליים, וסננו את התווך דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר תאי HEK-293. הנגיפים עשויים להיות מאוחסנים ב 4 °C במשך כמה ימים. לאחסון לטווח ארוך, יש להקפיא את הנגיפים ב -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: עקוב אחר הנחיות הבטיחות הביולוגית בעת הכנת חלקיקים לנטי-ויראליים, ועבוד בסביבה (למשל, BL2+) המתאימה לטיפול בלנטיוירוס. ראה את הליך הכנת הלנטיוירוס המפורט בפרוטוקול של Addgene שכותרתו pLKO.1 - TRC Cloning Vector (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G).
  4. זיהום של preadipocytes חום וקביעת sgRNA בתיווך knockdown
    1. צלחת 1 x 10 6 עכבר מונצח חום preadipocytes ב 1 מ"ל של מדיום טרי המכיל 8 מיקרוגרם / מ"ל פוליברן לכל באר בצלחת6 באר.
      הערה: במחקר זה, הפרדיפויטים החומים המונצחים נוצרו באמצעות אנטיגן SV40 T25. פרדיפוציטים חומים מגודלים בתרבית DMEM עתיר גלוקוז עם 10% FBS.
    2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת חלקיקים לנטי-ויראליים משלב 1.3 כדי להדביק את התאים. שמור על באר אחת לא נגועה של תאים במקביל כדי לשמש בקרת בחירת אנטיביוטיקה.
    3. יש להחליף לבינוני טרי 24 שעות לאחר ההדבקה. הוסף את האנטיביוטיקות המתאימות (למשל, פורומיצין עם ריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל) למדיום כדי להרוג את התאים הלא נגועים ובחר את אלה נגועים. יש להחליף למדיום טרי המכיל את האנטיביוטיקה שנבחרה אחת ליומיים עד שכל תאי הבקרה הלא נגועים מתים.
    4. לאסוף חלבון מהתאים הנגועים בנגיף, ולקבוע את יעילות ההפלות של sgRNA על ידי ניתוח כתמים מערביים. בצע את הליך ההכתמה המערבי המפורט באסלאמי ובלוג'אן26. בשל קצב התחלופה המשתנה בין חלבונים, בדוק נקודות זמן מרובות (למשל, מיום 6 עד יום 12 לאחר הדבקה בנגיף) כדי לראות את אובדן אות החלבון.
      הערה: אם נוגדן המזהה את החלבון המקודד על ידי הגן המעניין אינו זמין, ניתן להשתמש בריצוף סנגר כדי לקבוע את יעילות עריכת הגנום של כל sgRNA. בקצרה, להגביר את הדנ"א הגנומי באמצעות פריימרים המקיפים את האזור הממוקד sgRNA כדי ליצור אמפליקונים PCR באורך ~ 700 bp. עדיף שאתר ההפסקה הצפוי יהיה ~ 200 bp במורד הזרם מאתר התחלת הרצף. לאחר מכן, הכפיפו את מוצר ה-PCR לריצוף Sanger. נתח את תוצאות הריצוף באמצעות הכלים המקוונים, כגון מעקב אחר Indels by DEcomposition (TIDE), כדי לקבוע את התדירות של indels קטנים שנוצרו על ידי כל sgRNA במאגר של תאים27.

2. בניית פלסמיד AAV-sgRNA

הערה: בשלב זה, ה-sgRNA האפקטיבי שזוהה מהמסך לעיל משוכפל לווקטור pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP28 (איור 2). בינתיים, sgRNA שאינו מכוון (למשל, TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29) שאינו מזהה שום רצף בגנום העכבר משובט גם הוא לאותו וקטור כדי לשמש כבקרה לא ערוכה.

  1. לינארית pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP עמוד שדרה באמצעות BbsI, אשר יוצר שלוחות זהות עם אוליגוס sgRNA מסונתז.
  2. קשרו את זוגות האוליגו המחושלים עם וקטור pAAV ליניארי, ואשרו את החדרות ה-sgRNA כמתואר בשלב 1.2.
    הערה: הליך השיבוט עבור lentiCRISPRv2-sgRNA מיושם גם עבור בניית פלסמיד AAV-sgRNA.

3. אריזת AAV

  1. ארוז את וקטורי AAV שנוצרו בסעיף 2 לתוך סרוטיפ AAV 8. הכינו AAV בעל טיטר גבוה בהתאם לפרוטוקול30 קודם, או בקשו שירות אריזה AAV מליבות ויראליות או משירותים מסחריים. לדלל את titer הנגיף ל 1 x 1013 עותקים גנום / מ"ל.
    הערה: גנום AAV2 שונה המבטא sgRNA ארוז בסרוטיפ AAV 8. סרוטיפ זה נבחר בשל יעילותו הגבוהה לרקמת שומן18,31. כדי למנוע תגובה חיסונית הנגרמת על ידי מזהמים, כגון פסולת תאים וכמויות קטנות של רכיבים בינוניים, AAV מטוהר במיוחד נדרש להזרקת in vivo. טיהור אולטרה יכול להיות מושג על ידי שיפועים יודיקסנול אולטרה צנטריפוגה30.

4. הכנת עכברי Ucp1 Cre/Cas9

  1. רכוש את זן העכבר Ucp1-Cre (ראה טבלת חומרים) המבטא את Cre recombinase תחת שליטתו של מקדם Ucp1. רכשו עכברי STOP-Cas9 הומוזיגוטיים מסוג Rosa26-floxed STOP-Cas932 (ראו טבלת חומרים), שבהם הביטוי של Cas9 מווסת באופן תלוי Cre recombinase.
  2. חוצים זנים אלה כדי ליצור עכברי Ucp1-Cre/Cas9, כפי שתואר קודם לכן16,17. שמרו את כל העכברים בחדר מבוקר טמפרטורה ולחות (23°C, 30% לחות) במחזור אור-חושך של 12 שעות (אורות דולקים בשעה 06:30; אורות כבויים בשעה 18:30) עם גישה חופשית לדיאט צ'או ולמים.
  3. טפל בעכברי Ucp1-Cre/Cas9 המתקבלים באמצעות AAVs הנושאים sgRNA בקרה או sgRNA המכוונים לגן המעניין באמצעות השיטה המתוארת להלן. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי Ucp1-Cre/Cas9 זכרים בני 12-15 שבועות במשקל של כ-30 גרם.

5. ניתוח להזרקת AAV לעטלף בעכברים

  1. מרדימים את העכברים בשאיפה מתמשכת של 2.5% איזופלורן לצורך זירוז ותחזוקה.
  2. יש לשמן את שתי העיניים כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, תן משככי כאבים (בנאמין, 2.5 מ"ג / ק"ג משקל גוף [BW], הזרקה תת עורית, ראה טבלת חומרים) לעכברים כדי למזער ולמנוע כאב ומצוקה לאחר הניתוח.
  3. יש לגלח את פרוות העכבר על האזור הבין-סקפולרי באמצעות מכונת גילוח ולעקר את אזור הניתוח עם לפחות שלושה סיבובים לסירוגין של פילינג על בסיס יוד או כלורהקסידין ואחריו 70% אתנול. לאחר מכן, להחיל וילונות כירורגיים סטריליים סביב אתר החתך.
  4. חתכו את העור שבין עצם השכמה באמצעות אזמל (איור 3A-B), ואז קלפו את העור המגולח כדי לחשוף את רקמות השומן על הצוואר באמצעות מספריים כירורגיים (איור 3C-D). גודל החתך תלוי בגודל הגוף, אך בדרך כלל, החתך צריך להיות כ 2 ס"מ כדי לחשוף את רקמות השומן על האזור interscapular.
  5. חתכו את רקמות השומן בגבול שבין האזור הדיסטלי של רקמות השומן לשרירים באמצעות חתך יחיד (איור 3E-F). גודל החתך צריך להיות כ 1 ס"מ רק לפתוח את הכניסה להחדרת מספריים כירורגיים עבור קילוף קהה של רקמות השומן.
  6. בעזרת היד הדומיננטית, קלפו את רקמות השומן בצורה בוטה ואנכית בעזרת מספריים כירורגיים כדי לחשוף את ה-BAT תוך כדי צביטת רקמות השומן, כולל ה-BAT, עם היד הלא דומיננטית (איור 3G). השתמש בווריד של זולצר כנקודת ציון כדי לציין את המיקום המדויק של BAT.
    הערה: העטלף באיור 3H נחשף לחלוטין לצורך הדגמת תמונה. דיסקציה עודפת עלולה לגרום נזק לעצבים של עטלף שמסביב. כיוון לא נכון של המספריים עלול לפגוע בשרירים הסובבים ובווריד של הזלצר המנקז את ה-BAT ועלול להוביל לדימום עודף.
  7. עבור כל עכבר, יש להזריק 40 μL של AAV באיטיות לשתי אונות ה-BAT (20 μL לכל אונה אחת של ה-BAT) באמצעות מחט חדה (32 G, ראו טבלת חומרים) המחוברת למזרק המילטון (100 μL, ראו טבלת חומרים; איור 3I). בדוק הזרקה מוצלחת כפי שצוין על ידי אין דליפות מהאתר המוזרק במהלך מתן AAV.
    הערה: העטלף באיור 3I נחשף לחלוטין לצורך הדגמת תמונה. נפח תמיסת AAV שתינתן לתוך אונת BAT נקבע על ידי גודל ה- BAT של העכבר המקבל. קבענו כי 20 מיקרוליטר של תמיסת AAV מתאימה לאונה אחת של BAT במשקל של כ-0.05 גרם בעכבר C57BL6/J רגיל במשקל 30 גרם. במידת הצורך, ייתכן שיהיה צורך מרוכז בתמיסה הוויראלית כדי להשיג את הנפח הרצוי.
  8. יש לוודא שאין דימום מה-BAT המוזרק או מהרקמות הסובבות אותו. לחץ על גזה ספוגה בתמיסת מי חמצן (ראה טבלת חומרים) לאתר דימום להמוסטאזיס.
  9. החזירו את רקמות השומן החשופות למקומן הרגיל. תפרו את קצה רקמות השומן והשריר באמצעות חוט מונופילמנט נספג 5-0 (איור 3J). תפרו את העור הפתוח בחוטים קלועים לא צבועים 5-0 מצופים ויקריל (איור 3K-L).
    הערה: איור 4 מתאר את השלבים לתפירת רקמות ושרירי השומן המקולפים.
  10. יש לשמור את בעלי החיים על כרית חימום לאחר הניתוח עד להחלמה מלאה. לספק לבעלי החיים גישה למזון, מים ומצעים בשפע לקינון. עקוב אחריהם באופן קבוע עבור כל סימני מצוקה או מחלה במשך 7 ימים של התאוששות לפני תחילת הניסוי.
  11. לאשר את היעילות של מחיקת הגן הממוקד על ידי ניתוח כתמים מערביים ב- BAT שנותח מעכברים, כמו ב- Sugimoto et al.16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאורך כל ההליכים לעיל, המסירה המדויקת של AAV-sgRNA ל- BAT היא קריטית להצלחת הפרוטוקול. כדי למקסם את ההשפעה של AAV-sgRNA ולמזער את הנזק לרקמות במהלך הניתוח, חיוני להבין את המיקום האנטומי התלת-ממדי (3D) של ה- BAT. כפי שניתן לראות באיור 3E, קשה לזהות את המיקום המדויק של ה-BAT מבלי לחשוף את הרקמה. אולם חשיפה עודפת ל-BAT עלולה לפגוע ברקמה (איור 3H, I); לכן, יש לבצע את ההליך להזרקת תמיסת AAV בתוך מרחב אנטומי מוגבל (איור 3G). 

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות הקיימות שפורסמו להעברת גנים בתיווך AAV ל- BAT interscapular אינן מכילות תמונות וסרטונים מפורטים המתארים את טכניקות הניתוח ואת הגישה להזרקת AAV ישירה ל- BAT. ברוב השיטות שפורסמו33,34, AAV מוזרק לתוך רקמות השומן סביב BAT interscapular במקום BAT עצמו. לפיכך, ישנם מספר שלבים מרכזיים בפרוטוקול זה הקובעים את הצלחת המחקר. אלה כוללים את העיצוב של sgRNA, אריזה AAV וריכוז, הדור של עכברי Cas9 ספציפיים BAT, ואת ההליכים הכירורגיים. מיומנויות כירורגיות זהירות ומצטיינות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות של ארה"ב (NIH) R01DK122808, R01DK102898 ו-R01DK132469 (ל-Y.-H.T.), כמו גם P30DK036836 (למרכז לחקר הסוכרת של מרכז ג'וסלין). T. T. נתמך על ידי מלגת המחקר SUNSTAR (מלגת Hiroo Kaneda, קרן Sunstar, יפן) ומענק איגוד הלב האמריקאי 903968. י.ז. נתמך על ידי מלגת קרן צ'ארלס א. קינג. אנו מודים לשון ד. קודאני על ההגהה האדיבה של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כימיקלים, פפטידים וחלבונים רקומביננטיים
OPTI-MEM מדיום נטול סרוםInvitrogen31985
זיהום פוליברן / מגיב טרנספקציהסיגמאTR-1003-G
TransIT-LT1 מגיב טרנספקציהMirusMIR 2300
DNA
lentiCRISPR v2 וקטור Addgene52961
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFPAddgene89060
pMD2.G מעטפת פלסמידAddgene12259
psPAX2 אריזת פלסמידAddgene12260
מודלים ניסיוניים: קווי תאים
תאי HEK-293 תאיATCC CRL-1573
WT-1פותח במעבדת TsengPMID: 14966273
מודלים ניסיוניים: אורגניזמים/זנים
Cas9 עכברי נוקיןמעבדות ג'קסון24857
עכברי Ucp1-CREמעבדות ג'קסון24670
אחרים
בנמיןפטרסון07-859-1323
המילטון מזרקהמילטוןדגם 710 RN מזרק
תמיסת מי חמצןפישר סיינטיפיקH325-500
מחטהמילטון32 מד, מחט RN רכזת קטנה, מחט נקודת מחט בסגנון 2
תפר 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 אינץ' מונופילמנט 12/Bxהנרי שיין1273504
תפר 5-0 Unify Silk P-3 שחור 18 אינץ' 12/Bxהנרי שיין
רקומביננטי1294522

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
  2. Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
  3. Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer's disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
  4. Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
  5. Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
  6. Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
  7. Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
  8. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
  9. Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
  10. da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
  11. Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
  12. Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
  13. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  14. Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
  15. Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
  16. Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
  17. Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
  18. Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421(2020).
  19. Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402(2021).
  20. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  21. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416(2018).
  22. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  23. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  24. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
  25. Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
  26. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).
  27. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).
  28. Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624(2017).
  29. Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41(2021).
  30. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960(2019).
  31. Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
  32. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  33. Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
  34. Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cre LoxPCRISPR Cas9AAV

מאמרים קשורים