הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

כימות עלויות כושר ביתושים מהונדסים, Aedes aegypti

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65136

⸱

15 בספטמבר 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Vector-borne Infectious Diseases, Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 2Laboratory of Malaria and Vector Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 4National Center for Microbiology, Instituto de Salud Carlos III

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד למדוד נתוני פרמטרי חיים נפוצים אצל יתושי Aedes aegypti , כולל פריון, גודל כנפיים, פוריות, יחס מין, כדאיות, זמני התפתחות, תרומת גברים ואריכות ימים של מבוגרים. מדידות אלה יכולות לשמש להערכת כשירותם של יתושים טרנסגניים.

תקציר

יתושים טרנסגניים מציגים לעתים קרובות עלויות כושר בהשוואה לעמיתיהם הפראיים. בהקשר זה, מחקרי עלות כושר כרוכים באיסוף נתוני פרמטרי חיים מיתושים מהונדסים גנטית והשוואתם ליתושים חסרי טרנסגנים מאותו רקע גנטי. כתב יד זה ממחיש כיצד למדוד תכונות נפוצות בתולדות החיים של היתוש Aedes aegypti, כולל פריון, גודל וצורת כנפיים, פוריות, יחס בין המינים, כדאיות, זמני התפתחות, תרומת גברים ואריכות ימים של מבוגרים. פרמטרים אלה נבחרו משום שהם משקפים הצלחה ברבייה, פשוטים למדידה, ומדווחים בדרך כלל בספרות. התוצאות המייצגות מכמתות את עלויות הכושר הקשורות לנוק-אאוט גנטי או להחדרה יחידה של רכיב דחף גנטי. סטנדרטיזציה של אופן איסוף נתוני פרמטרי החיים חשובה מכיוון שניתן להשתמש בנתונים כאלה כדי להשוות את בריאותם של יתושים טרנסגניים שנוצרו במחקרים או למדל את קצב קיבוע הטרנסגנים באוכלוסיית יתושים מסוג בר מדומה. למרות שפרוטוקול זה הוא ספציפי עבור Aedes aegypti מהונדס, הפרוטוקול עשוי לשמש גם עבור מיני יתושים אחרים או תנאי טיפול ניסיוניים אחרים, עם אזהרה כי הקשרים ביולוגיים מסוימים עשויים לדרוש התאמות מיוחדות.

מבוא

הישרדותם של החזקים ביותר היא הרעיון הדרוויניסטי שפרטים המכילים גנים המותאמים ביותר לסביבתם יעבירו גנים אלה לדורות הבאים1. משמעות הדבר היא שהכושר הוא שקובע אם הגנים שלהם ישרדו. תפיסה זו, בת יותר מ-150 שנה, היא אולי הגורם המשמעותי ביותר בהנדסת דחף גנטי מוצלח ביתושים טרנסגניים. דחפי גנים, או דפוס התורשה הסופר-מנדליאני של יסוד גנטי אנוכי המאפשר לו להתפשט באוכלוסיות2, נחקרים לצורך הדברה גנטית3. בהקשר של שליטה וקטורית, אסטרטגיה זו שואפת להחליף פרוקי רגליים מסוג בר (WT) באלה העמידים לפתוגנים (שינוי אוכלוסיה) או לחסל את כולם יחד (דיכוי אוכלוסיה)4. עם זאת, יתושים טרנסגניים מפגינים לעתים קרובות עלויות כושר (הנקראות גם עומס גנטי) בהשוואה לעמיתיהם WT, מה שאומר שהטרנסגן יאבד באוכלוסיות שיכולות להתחרות בהם. צימוד טרנסגנים עם מערכת דחיפת גנים נחוץ אפוא כדי לקזז את עלויות הכושר ולדחוף את הטרנסגן דרך האוכלוסייה ברמות גבוהות מהצפוי מתורשה מנדליאנית טיפוסית4.

מחקרי מעבדה על פני מיני וקטורים של יתושים הראו כי טרנסגנים מציגים לעתים קרובות עלויות כושר 5,6,7. לדוגמה, Irvin et al. מדדו פרמטרי חיים שונים ב-Aedes (Ae.) aegypti שהונדסו לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) או גנים טרנספוזאז תחת מקדמי Drosophila actin 5C או 3XP3 סינתטי, והשוו אותם לזן אורלנדו פראי (אותו רקע גנטי שממנו הם נגזרו)5. בעיקר, הם מצאו כי כל הזנים הטרנסגניים הפחיתו באופן משמעותי את כושר הרבייה5. בהתאם לטרנסגן, חלק מיתושי אנופלס (An.) המבטאים טרנסגנים המעכבים התפתחות טפיל פלסמודיום הציגו גם הם עלויות כושר6. באופן ספציפי, An. stephensi המבטא ארס דבורים פוספוליפאז (PLA2) תחת מקדמים מכוננים או מעוררי דם הטיל באופן משמעותי פחות ביצים בהשוואה לקבוצת ביקורת6. מחברים אלה מצאו גם כי אנופלס מהונדס המבטא טרנסגן אחר, טטרמר דודקפפטיד SM1 לא הציג עלויות כושר, מה שהוביל אותם למסקנה כי עלויות הכושר המוענקות על ידי טרנסגן תלויות, לפחות סביר בחלקן, בהשפעת החלבון המהונדס המיוצר6. אכן, ניתן לייחס את עלויות הכושר לתוצרי טרנסגנים, השפעות מיקום, השפעות מחוץ למטרה, מוטגנזה החדרתית, או השפעות רבייה בזנים שגודלו במעבדה7. לכן, כונני גנים חייבים להיות חזקים מספיק כדי לקזז את עלויות הכושר המושרות על ידי טרנסגנים, תוך הימנעות מהתפתחות של החדרות ומחיקות (indels) שחוסמות את הכונן עצמו.

עלויות כושר התפתחותי או רבייה ניתן למדוד במחקרי מעבדה או כלוב7, עם אזהרה כי גורמים לא ידועים בתחום עשויים גם להשפיע. עם זאת, מחקרי כושר מבוקרים הם צעד ראשון חשוב בעת תכנון או הערכה של שחרור יתושים מהונדסים גנטית, כגון תוכנית דחיפת גנים, כדי לקבוע אם הקו המהונדס יימשך בדורות הבאים. לדוגמה, האמונד ואחרים. נבדק כונני גנים מבוססי CRISPR/Cas9 שנועדו לשבש את הגנים הדרושים לפוריות האישה8. באמצעות מחקרי כלובים שנשמרו במשך 25 דורות לפחות, מצאו המחברים כי היתושים צברו אללים עמידים לדחף גנטי שחסמו את המחשוף ממוקד הקריספר והחזירו את פוריות האישה8. מאמצי המידול שלהם הציעו כי לפוריות אצל נקבות הטרוזיגוטיות לדחף הגנטי היו ההשפעות הדרמטיות ביותר על קיבוע כונן גנים בתנאים מדומים8. באותו קו, Ae. aegypti (זן העין הלבנה של היגס, HWE) שהונדס לבטא קלטות אוטונומיות של דחיפת גנים תחת מקדמים שונים או במוקדים אינטרגניים שונים הציג שיעורים שונים של קיבוע כונן גנים באוכלוסיות מדומות9. באמצעות מודלים של MGDrivE10, בשילוב עם שיעורים מדודים של היווצרות אינדל, השפעות אימהיות ונתוני פרמטרי חיים שנאספו במעבדה, המחברים מצאו כי כושר היתושים השפיע בצורה החזקה ביותר על התמדת דחף הגן בתנאים מדומים9. עלויות הכושר שסביר להניח שיפגעו ביעילות דחיפת הגנים מיוחסות לביטוי סומטי Cas9 (יתר) או מהגן הממוקד, במיוחד בהטרוזיגוטים, ולא מהדחף הפנימי עצמו 11,12,13,14,15,16,17.

בהתחשב בחשיבותו, כושר גופני הוא גורם חשוב ליכולתו של קו מהונדס להתמיד בדורות הבאים, והוא יכול לשמש אינדיקטור לכל ההשפעות הפיזיולוגיות הקשורות לטרנסגן. לדוגמה, השפעות מחוץ ליעד עשויות להיות קשורות לעלויות כושר. במקרה זה, מומלץ לחצות קו מהונדס במשך מספר דורות. יתר על כן, חציית הקו המהונדס עם קו המשקף אוכלוסיית שדה עשויה להיות נחוצה גם כדי לחקור עד כמה האוכלוסייה המהונדסת יכולה להתחרות בעולם האמיתי. כדי לכמת את עלויות הכושר כך שניתן יהיה להשוות ביניהן, כתב יד זה מספק פרוטוקולים פשוטים למדידת תכונות נפוצות בתולדות החיים ביתושי Ae. aegypti, עם דגש מיוחד על עלויות כושר הקשורות לטרנסגנים, כך שניתן יהיה לשחזר מחקרים כאלה ביתר קלות. הפרוטוקולים כוללים פוריות, פוריות, יחס בין המינים, כדאיות, זמני התפתחות, תרומת גברים ואריכות ימים של מבוגרים. מדידת אורך ושטח הכנף נבחרה גם כמדידת כושר מכיוון שהיא מתואמת עם אורך בית החזה18,19 ומדידות גודל הגוף, אשר קשורות ישירות לגודל ארוחת הדם, צואה וחסינות20,21. למרות שישנן דרכים רבות להעריך כושר, פרמטרים אלה נבחרו מכיוון שהם משקפים הצלחה ברבייה, פשוטים למדידה, ומדווחים בדרך כלל בספרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה נכתב עבור קווי Ae מהונדס ופראי מסוג Ae. aegypti שאומתו והוקמו בעבר. למידע נוסף על יצירת Ae. aegypti מהונדס, ראו Kistler et al.22 ו Coates et al.23. כל הניסויים המפורטים להלן בוצעו תחת נהלי גידול Ae. aegypti סטנדרטיים. יתושים נשמרו ב 28 ° C עם לחות יחסית 75%-80% ומחזור אור / 12 שעות חושך. מינימום של 100 ניירות ביצים בודדים לכל כתם יתוש מומלץ מאוד למטרות סטטיסטיות. מחקרי כושר מקיפים נמשכים כ-3 חודשים (איור 1).

1. מדידת צואה אצל נקבות יתושים

  1. בוקעים יתושים טרנסגניים ויתושי WT (בעלי אותו רקע גנטי אך חסרי טרנסגן) על ידי הכנסת ניירות ביצים למים סטריליים למשך הלילה בחרק, בהתאם לתנאי גידול סטנדרטיים. אפשרו לזחלים להאכיל אד ליביטום , על ידי מתן מספר טיפות (כל אחת כ-50 מיקרוליטר) של מזון דגים טחונים (טטרמין) (בערך 30% w/v). הזחלים הראשונים ניתנים לזיהוי יום אחד לאחר הבקיעה. מניחים את הזחלים במיכלים גדולים יותר כדי שלא תהיה צפיפות, בדרך כלל ניתן לגדל 100-150 זחלים בנפח 1 ליטר מים עם שטח פנים של כ 250 ס"מ2. המשיכו לספק תרחיף טטרמין כמקור מזון, המאפשר לזחלים להאכיל אד ליביטום. מוסיפים את תרחיף המזון בטיפות נפרדות, כך שתמיד יהיה מספיק מזון זמין לזחלים, וכדי שהמים לא ייראו מעוננים. הזחלים יגדלו עם כל כוכב ובסופו של דבר ייכנסו לגור במחבתות הזחל.
  2. ברגע שהגלמים מתחילים להופיע, ~5-6 ימים לאחר הבקיעה, הפרידו אותם לפי מין כדי להבטיח שהבוגרים יהיו בתולים ברגע שהם יוצאים (להזדווגות לאחר מכן), כמתואר להלן.
    1. כדי למיין את הגלמים לפי מין, התחילו בקטיף הגלמים באמצעות פיפטורים מפלסטיק של 3 מ"ל לתוך כוסות פלסטיק קטנות המכילות מי ברז נקיים. הגלמים הזכרים נוטים להיות קטנים יותר ונוטים לצאת ראשונים בהשוואה לנקבות. ראשית, מיין את הגלמים לפי גודל, ולאחר מכן אשר את המסך הראשוני לפי מורפולוגיה.
    2. העבירו את הגלמים למגלשת מיקרוסקופ זכוכית והוציאו עודפי מים בעזרת רקמה. זה משתק את הגולם. תחת סטריאוסקופ בהגדלה של פי 2-4, מקמו את הצד הגחוני של הגלמים כלפי מעלה באמצעות מברשת צבע בעלת קצוות עדינים.
    3. לנתח חזותית את הזנב עבור הבדלים בצורת האונה איברי המין (בקצה קטעי הבטן גולם מאחורי המשוטים; איור 2). לנקבות יש סנפירים מחודדים המשתרעים מעבר לאונות איברי המין, הדומים בערך לכתר או לשיני ערפד, בעוד שאונות איברי המין הזכריות מעוגלות ואין להן מבנים מחודדים אלה. ראו Carvalho et al.24 לנתונים נוספים.
  3. הניחו גלמים זכרים ונקבות בכוסות מים נפרדות והניחו אותם בהכלה נכונה, לדוגמה, קרטונים בנפח 1.9 ליטר (1/2 גלון או 64 אונקיות) עם 0.2 מ' x 0.2 מ' (8 אינץ' x 8 אינץ') בד אורגנדי לבן, שכל אחד מהם מכיל ~150 גלמים.
  4. לספק מקור סוכר ומים על גבי הכלובים (למשל, צימוקים וכוס מלאה במים מכוסה בגזה, מאובטחת בשתי גומיות). חתכו חור בגודל עט לתוך הקרטונים וכסו אותו בפקק גומי כדי שניתן יהיה להוסיף גלמים נוספים לכלובים כשהם יוצאים.
  5. ב 3-5 ימים לאחר הופעת הבוגר, להרדים את היתושים על ידי הנחת הקרטונים ב 4 ° C במשך ~ 2-5 דקות. למרות שהם עדיין עשויים להתעוות, היתושים מורדמים מספיק ברגע שרובם נופלים לתחתית הקרטון. מניחים את היתושים על צלחת פטרי זכוכית על קרח במשך ~ 30 דקות - 1 שעות.
    הערה: השארת היתושים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך זמן רב מדי עלולה להשפיע באופן משמעותי על בריאותם, אם כי לא מצאנו השפעות אם הם נשארים על קרח עד שעה אחת.
  6. לחצות WT או GD1 מהונדס או GD29 (כונן גנים מבוסס CRISPR/Cas-9) בהמוניהם עם נקבות WT בתוליות (בקרה) על ידי הוספת יתושים מורדמים ביחס של חמישה זכרים WT או טרנסגניים לנקבת WT אחת לקרטוני יתושים, שכל אחד מהם מכיל ~ 150 יתושים. הקפידו לתייג את הכלובים לפי סוג זכר.
    הערה: סכמת מעבר זו נועדה לקבוע את הכשירות של GD1 או GD29 המיזיגוטים (כלומר, יתושים המכילים עותק אחד של הטרנסגן). כדי לקבוע את הכשירות לקווים טרנסגניים הומוזיגוטיים, ניתן להתאים את סכימת המעבר כך שזכרים ונקבות טרנסגניים יורשו להזדווג בהשוואה לצלבים של זכרים ונקבות WT.
  7. לאחר 2-3 ימים, הדם מאכיל את הנקבות בהתאם לשיטות גידול סטנדרטיות25 על ידי מתן מקור דם על גבי הכלוב. הסר את מקור הסוכר 24 שעות לפני האכלת הדם ואת מקור המים ~ 2-3 שעות לפני האכלת הדם כדי להגביר את יעילות ההאכלה.
  8. לאחר האכלת הדם, להרדים את היתושים על ידי הצבתם ב 4 ° C, כמו בשלב 1.5.
  9. מיין את הנקבות המוזנות בדם (מעורב לחלוטין) מנקבות שלא ניזונו על ידי סינון חזותי של הבטן שלהן לגודש. השליכו את הלא-מוזנים, הניזונים חלקית והזכרים.
  10. החזירו את הנקבות החרוטות לכלובים שלהן וספקו מקור סוכר ומים על גבי הכלובים.
  11. לאחר 2-3 ימים, הניחו נקבות בודדות בתוך צינורות חרוטיים בנפח 50 מ"ל המרופדים בנייר סינון שסומן מראש בעיפרון (איור 3). מכסים את הצינורות החרוטיים ברשת ואוטמים בשתי גומיות.
  12. ברגע שהנקבות ערות, מלא את כל הצינורות עם ~ 5 מ"ל של מי ברז. מניחים חתיכה קטנה של צימוקים או כדור צמר גפן ספוג סוכר על גבי כל צינור חרוט. השאירו את הנקבות במשך 1-2 ימים בחרק ולאפשר להם oviposit.
  13. לאחר 1-2 ימים, לנקז כל צינור חרוטי להרדים את היתושים על ידי הצבתם ב 4 ° C. לעיבוד מהיר, השתמש בקצה של פיפטור פלסטיק 3 מ"ל שנלחץ על הרשת כדי לנקז את המים מכל צינור חרוט. סובבו את הצינורות הפוך והניחו אותם על גבי מגבת נייר לניקוז. הניחו את הצינורות החרוטיים בנפח 50 מ"ל במחזיק צינור והניחו את המדף בטמפרטורה של 4°C.
  14. אספו את נייר הביצים וספרו את מספר הביצים על כל נייר. ספרו את הנקבות שאינן מטילות ביצים כ-0 וכללו אותן בניתוח. חשב את הפריון הממוצע כמספר הכולל של ביצים שנספרו בכל נייר חלקי המספר הכולל של נקבות שנבדקו.
    הערה: תמונות דיגיטליות של ניירות ביצים בודדים עשויות לשמש כתיעוד חזותי לאישור ספירה (איור 4).
  15. יבשו את ניירות הביצים והחזירו אותם לחרק. מומלץ שניירות הביצים יתייבשו לפחות 3-5 ימים לבקיעה אופטימלית25.

2. מדידת אורך כנף, שטח וגודל צנטרואיד

  1. יש להקפיא לפחות 25 WT או נקבות המוזנות בדם מהונדס תואם גיל ממחקר הצואה שהושלם על ידי הצבת כלובי היתושים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך כ-15 דקות.
    הערה: אין להקפיא לפרק זמן ארוך יותר ואין לנער או להפיל את המיכל, מכיוון שהדבר עלול לגרום לכנפיים ליפול מהיתושים.
  2. יש לנתח את הכנף השמאלית של כל יתוש, לכרות את מפרק הכנף ובית החזה, ולהסיר את כל הכנף, בהתאם לפרוטוקול שלהלן.
    1. ביד אחת, להחזיק את היתוש עם מלקחיים, לתפוס את אזור בית החזה מתחת לכנפיים.
    2. בעזרת זוג מלקחיים נוסף ביד השנייה, מנתחים את הכנף השמאלית של כל יתוש, תוך כריתה של מפרק הכנף ובית החזה באמצעות לחץ עדין כדי למשוך את הכנף, תוך הסרת כל הכנף מבלי לקרוע את ורידי הכנף.
  3. בעזרת מלקחיים, מניחים את הכנף על מגלשת זכוכית, שוכבת שטוחה. בעזרת פיפטת העברה, הוסיפו טיפה אחת מתמיסת ציר של 15 מ"ל, המורכבת מ-70% אתנול, וטיפה אחת של סבון כלים לכנף במגלשה.
  4. הוסיפו טיפה אחת של 80% גליצרול למכסה והניחו על גבי הכנף בתמיסת סבון אתנול.
  5. צלם את הכנפיים המותקנות על המגלשות באמצעות מצלמה עם עדשת 65 מ"מ (7D-65 מ"מ-1x; זום = 1, 200, 6.3, ISO = 100). שים לב לקנה המידה של פיקסל/מ"מ וודא שהוא נשאר זהה עבור כל התמונות. אם מספר כנפיים מצולמות יחד, חתוך את התמונות לכנפיים בודדות והוסף פסי קנה מידה לכל תמונה. שמור את התמונות בפורמט TIFF עם דחיסת LZW, כאשר כל תמונה מסומנת בבירור עם כל המידע עבור האגף הבודד.
    הערה: ניתן לצלם את הכנפיים באמצעות מצלמה שונה והגדלה אחרת או באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ עבור מחקרים אחרים, אם ההגדרות נשארות זהות וקנה המידה של פיקסל/מ"מ נשאר זהה עבור כל כנף מצולמת במחקר. יחס הפיקסלים/מ"מ יילקח בחשבון בעת קביעת המדידות.
  6. הורד את tpsUtil ו- tpsDig, שהן תוכנות עיבוד תמונה מורפומטריות ללא תשלום. ראה Rohlf 26,27 לקבלת מידע מפורט יותר על התוכנה.
  7. דיגיטציה של הכנפיים באמצעות tpsUtil כדי ליצור קובץ TPS של תצלומי הכנף לשלב הבא של הדיגיטציה.
    1. לשם כך, פתח את tpsUtil ותחת פעולה, בחר בנה קובץ tps מתמונות. לחץ על קלט, בחר בקובץ הכולל את תמונות הכנף הבודדות, ולאחר מכן בחר תמונה כלשהי כדי לבחור בתיקייה זו. לחץ על פלט ותן שם לקובץ שייווצר בתבנית .tps. לחץ על שמור.
    2. לאחר מכן, תחת פעולות, לחץ על הגדרה. בחר כלול הכל, לחץ על צור וסגור את התיבה הנפתחת. תחת פעולה, כעת בחר דגימות סדר אקראי. לחץ על קלט ובחר את קובץ ה- .tps שזה עתה נוצר. לחץ על פלט, שנה את שם קובץ ה- .tps כדי לציין שזוהי גירסת הקובץ עם הדגימות אקראיות ולחץ על שמור. לאחר מכן, לחץ על צור. סגור את התוכנית tpsUtil.
      הערה: כדי להפחית את טעות המדידה, ניתן לשכפל את תמונות הכנף ולהשתמש בהן פעמיים לשכפול טכני.
  8. השתמש בתוכנת tpsDig כדי לזהות קואורדינטות קרטזיות דו-ממדיות עבור ציוני הדרך. תחת קלט, בחר את קובץ ה- .tps שנוצר בשלב 2.7. הגדר את קנה המידה לסולם שנקבע בשלב 2.5; תחת אפשרויות, בחר כלי תמונה ולאחר מכן לחץ על מדידה.
  9. הוסף ציוני דרך לתמונה על-ידי לחיצה על סמל הצלב הכחול המייצג ציוני דרך דיגיטליים, ולאחר מכן לחץ על מפרקי הכנפיים המצוינים באיור 5, לפי הסדר מלנדמרק 1 ללנדמרק 14.
    הערה: ציוני דרך אלה נבחרו מכיוון שהם שימשו בעבר בדיגיטציה וניתוח של ציוני דרך בכנף19, קל לאתר אותם במפרקי ורידי הכנף על פני דגימות רבות, ומספקים מספיק ציוני דרך בכנף כדי ללכוד את גודל וצורת הכנף.
  10. בעת סימון ציוני דרך, סמן ציוני דרך חסרים או מוסתרים (עקב קיפול כנף או נזק) כחסרים ב- tpsDig על ידי לחיצה על סמל M כדי לא לכלול אותם בניתוח ולשמור על הסדר הנכון של ציוני הדרך. לחץ על החץ האדום הפונה ימינה כדי לחזור על הדיגיטציה של ציון הדרך עבור התמונות הבאות עד להשלמת כל התמונות בקובץ. שמור וסגור את הקובץ.
    הערה: יש להוסיף את ציוני הדרך לתמונת הכנף בסדר הנכון עבור כל תמונה כדי שהחישובים של אורך הכנף, שטחה וגודלה יהיו נכונים.
  11. חשב את אורך הכנף ושטחה באמצעות סקריפט R שסופק בקובץ משלים 1, תוך שינוי עבור מיקום קובץ ה- .tps וקנה המידה של התמונה בהתאם לניסוי.
  12. חישוב גודל צנטרויד כנף, מדד לגודל שאינו תלוי סטטיסטית בצורה, המוגדר כשורש הריבועי של סכום המרחקים הריבועיים של כל אחד מציוני הדרך מנקודת המרכז של הכנף28,29.
  13. השתמש ביישור פרוקרוסטס כללי כדי להסיר וריאציות שאינן צורה וקואורדינטות ציון דרך של קווי התווייה, באמצעות כנפיים שכל ציוני הדרך שלהן שלמים. הן עבור גודל צנטרויד הכנף והן עבור קביעת ציון דרך ממוצע, השתמש בסקריפט R שסופק בקובץ משלים 2, ושנה עבור מיקום קובץ ה- .tps וקנה המידה של התמונה בהתאם לניסוי.

3. הערכת פוריות הביציות

  1. בוקעות ביצי F1 בודדות מהניירות שנאספו מנקבות בודדות (שנאספו בשלב 1) למיכלי מעדנייה שקופים מפוליפרופילן המכילים ~100 מ"ל של מים מעוקרים טריים. הוסיפו שתיים או שלוש טיפות של תרחיף מזון דגים טחונים להאכלת אד ליביטום . רפדו את החלק העליון של המיכלים ברשת או אורגנדי, והדקו באמצעות גומייה.
  2. 2-3 ימים לאחר הבקיעה, מוציאים את ניירות הביצים מהמים ומניחים להם להתייבש למשך הלילה על ידי הכנסתם למיכל חדש המכוסה במכסה או רשת ומשאירים אותם בחרק.
  3. בקעו מחדש את ניירות הביצים באותם מכלים שבהם בקעו לראשונה על ידי הכנסתם חזרה למיכל המים.
    הערה: ייבוש ובקיעה מחדש של ניירות הביצים משפרים מאוד את יעילות הבקיעה. ייתכן שזה לא יהיה נחוץ עבור מיני יתושים אחרים.
  4. 3-5 ימים לאחר הבקיעה הראשונית, בדקו ויזואלית את הזחלים (2nd עד 4th instar) עבור סמן מהונדס (אם רלוונטי; איור 6). בדקו מספר זחלים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בו זמנית על ידי הנחתם על פיסת נייר פילטר המונחת על גבי אורגנדי או רשת מרופדת במגבות נייר. מגבות הנייר סופגות עודפי מים, כך שניתן להשתמש בנייר הסינון כדי לסנן ולתפעל את הזחלים המשותקים.
  5. רשום את מספר הזחלים הטרנסגניים החיוביים או השליליים. השליכו את הזחלים השליליים.
  6. נקו את מי הזחל כדי להבטיח זמני התפתחות אופטימליים. כדי לעשות זאת, פיפטה את הזחלים לתוך קטנה, להשליך את המים המלוכלכים, ולהחליף אותו עם מי ברז טריים להוסיף את הזחלים החיוביים ולוודא מספיק מזון דגים הקרקע זמין.
  7. חישוב פוריות כמספר הזחלים הטרנסגניים או זחלי הבקרה חלקי המספר הכולל של הביציות.

4. קביעת יחס המינים בגלמים

  1. עד 14 יום לאחר הבקיעה, המשך לאסוף ולתעד את מספר הגלמים הזכרים והנקבות (כמתואר בשלב 1.2.3). נקבות או זכרים יכולים להיאגר, לפי מין, לכוסות קטנות השוכנות במיכלים של 1.9 ליטר.
  2. כדי לקבוע את יחס המינים, הוסף את מספר נקבות F1 או את מספר זכרי F1 שנאספו לאורך ציר הזמן של המחקר לכל יתוש בוגר בודד. חלק מספר זה במספר הכולל של הגלמים שנאספו עבור אותו קו יתושים שנוצר מנקבה אחת.

5. קביעת כדאיות הזחלים

  1. כדי לקבוע את כדאיות הזחלים, הוסף את המספר הכולל של הגלמים שנאספו לאורך ציר הזמן של המחקר לכל יתוש בוגר בודד.
  2. חלק מספר זה במספר הכולל של הזחלים שנספרו לכל נקבת יתוש בוגרת בודדת עבור אותה שורה שנספרת בשלב 3.

6. קביעת זמן התפתחות הזחלים לגלמים

  1. כדי לקבוע את התפתחות הזחלים לגלמים, עקבו אחר מספר הזחלים ומספר הגלמים בשורה מדי יום.
  2. חישוב התפתחות הזחלים לגלמים כזמן הממוצע להתפתחות הגלמים לאחר הבקיעה.

7. קביעת תרומת הגברים

  1. באמצעות זכרים תואמי גיל, מרדימים יתושים זכרים טרנסגניים בתולים בוגרים על קרח, כמו גם יתושים בוגרים זכרים ונקבות הדברה.
  2. חצו את הבוגרים הטרנסגניים או את זכרי הביקורת עם נקבות ביקורת בוגרות על ידי הוספת 50 זכרי ביקורת או 50 זכרי ביקורת (תואמי גיל) עם 100 נקבות ביקורת לקרטונים של 64 אונקיות, כך שיש בסך הכל 50 זכרים עם 100 נקבות (שתי נקבות ביקורת: זכר ביקורת אחד או זכר מהונדס). הקפידו לתייג איזה קרטון מכיל זכרים טרנסגניים ואיזה קרטון מכיל זכרי ביקורת.
  3. אפשרו להזדווגות להתרחש במשך 2-3 ימים. לאחר זמן זה, הציעו ליתושים ארוחת דם בהתאם לשיטות הגידול הסטנדרטיות.
  4. שלושה ימים לאחר הזנת הדם, יש להפריד נקבות בודדות חרוטות במלואן לתוך צינורות חרוטיים בנפח 50 מ"ל המרופדים בנייר סינון לבן מסומן מראש, כמתואר בשלב 1 (בדיקת צואה). השליכו את הנקבות שלא ניזונו או הציעו להן ארוחת דם נוספת למחרת. מלא את כל הצינורות עם ~ 5 מ"ל של מי ברז. מניחים חתיכה קטנה של צימוק על הרשת מונחת על גבי כל צינור חרוט.
  5. השאירו את הנקבות למשך 1-2 ימים בחרק ואפשרו להן לבצע אוביפוזיט. בדקו ויזואלית את ניירות הביצים במשך 4-5 ימים לאחר ארוחת הדם לביצים. תנו לנקבות יום נוסף כדי להגדיל את קצב הטלת הביצים.
  6. כדי לאסוף את ניירות הביצה, לנקז את המים להרדים את הנקבות על ידי הצבת צינורות חרוטי ב 4 ° C, כפי שתואר קודם לכן. השליכו נקבות יתושים על ידי הכנסת אתנול 70%.
  7. השאירו את הניירות בצינורות בחרק לפחות 5 ימים לייבוש. השתמש במלקחיים כדי להסיר את הניירות והניחו אותם במיכלי מעדנייה שקופים מפוליפרופילן המכילים ~ 100 מ"ל של מים מעוקרים טריים לבקיעה. יש להוסיף 2-3 טיפות של תרחיף מזון דגים טחונים להאכלת אד ליביטום . מרפדים את החלק העליון של המיכלים ברשת או אורגנדי, מאובטחים בגומייה.
  8. 2-3 ימים לאחר הבקיעה, מוציאים את ניירות הביצים מהמים ומניחים להם להתייבש למשך הלילה על ידי הכנסתם למיכל חדש המכוסה במכסה או רשת והכנסתם חזרה לחרק.
  9. בקעו מחדש את ניירות הביצים באותם מיכלים על ידי הכנסתם חזרה למיכל המים.
  10. 3-5 ימים לאחר הבקיעה הראשונית, בדקו ויזואלית את הזחלים (2nd עד 4th instar) עבור סמן מהונדס (אם רלוונטי). חשב את תרומת הזכר כמספר הזחלים הטרנסגניים F2 חלקי מספר הזחלים הכולל לכל קו יתושים.

8. קביעת אריכות ימים של יתושים

  1. העבירו 50 זכרים ו-50 נקבות WT או יתושים מהונדסים שאינם מוזנים בדם למתחם מתאים. השתמשו בקרטונים של 64 אונקיות, כשהפתח העליון מרופד בצינור גרבונים, מעוות וסגור, לגישה קלה ומניפולציה ליתושים ככל שהניסוי מתקדם (איור 7).
    הערה: מומלץ לעשות זאת בשלשה למטרות סטטיסטיות.
  2. לספק מקור סוכר ומים. כאן נעשה שימוש בצימוקים ובכוס מלאה במים מרופדת בגזה, מאובטחת בשתי גומיות.
  3. עקוב אחר מספר היתושים הזכרים והנקבות המתים בכל יום. חישוב תוחלת החיים כמספר הימים הממוצע שחלפו לפני שהיתושים מתים על פני הכלובים, השמטת יתושים שמתים מסיבות שאינן אינפורמטיביות (סיבות שאינן נובעות מתוחלת החיים של היתושים, כגון מעיכה או טביעה בסוכר) והשמטת יתושים שעדיין חיים בסוף המחקר.
    הערה: הישרדות מוגדרת כהסתברות לחיות עד זמן t, או הפונקציה S(t) = Pr(T>t). הישרדות חציונית היא הזמן שבו ההסתברות להישרדות היא 0.5, או T_0.5 = S-1 x 0.5.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול הנ"ל הוערכה כשירותם של שני קווי יתושים: (1) נוק בתיווך CRISPR/Cas9 מתוך Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424) חלבון רוק ו-(2) Ae. קווים מצריים המבטאים כונני גנים אוטונומיים בתיווך CRISPR/Cas99. במקרה של הראשון, נוצר קו נוק-אאוט הומוזיגוטי D7L1 על ידי ניצול מסלול הצטרפות הקצה הלא הומולוגי (NHEJ) כדי ליצור את השיבוש לאחר הזרקה מיקרו-הזרקה של עוברים עם sgRNA ספציפיים לגן D7L1 . יתושי D7L1-KO הטרוזיגוטיים הוצלבו לאחור במשך ארבעה דורות ל-WT לפני שיצרו קו הומוזיגוטי י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Ae. מחקרי כושר מצריים מבוצעים לעתים קרובות במעבדה כדי להעריך את עלויות הכושר הקשורות למטען מהונדס (למשל, אלמנטים מניעי גנים) או נוקאאוטים גנטיים, כפי שנדון בכתב יד זה; עם זאת, מחקרים אלה עשויים להתבצע למגוון מטרות - כל מטרה שמטרתה להעריך את בריאותו של Ae. קבוצה מצרית, כגון וולבכיה נגוע 30,31, עמיד קוטלי חרקים32,33, או נגוע arbovirus34. לכן, מכיוו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים רוצים להודות לד"ר ביל ריד וד"ר אלכסנדר פרנץ מאוניברסיטת מיזורי על תמיכתם בפרוטוקול זה. המחברים רוצים גם להודות לד"ר בנג'מין קראג'יץ' מה-NIH/NIAID על תמיכתו בניתוח R. מחקר זה מומן על ידי ה-NIH, מענק מספר R01 AI130085 (KEO), וחטיבת NIH/NIAID של תוכנית המחקר התוך-ציורית AI001246 (EC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 אונקיות כוסות סופלה מפלסטיק שקוףWebstaurantStore301100PC
2 אונקיות כוסות סופלה פוליסטירן שקוףWebstaurantStore760P200N
3 מ"ל פיפטורים מפלסטיק קורנין357524
50 מ"ל צינורות חרוטייםכל מותג
64 אונקיות לבן כפול מצופה נייר מזוןWebstaurantStore999SOUP64WBלסגירת יתושים
עדשת 65 מ"מ CanonMP-E 65 מ"מ f/2.8 1-5x צילום מאקרוCanon Macro Photo MP-E 65 מ"מ, 7D-65 מ"מ-1X; זום=1, 200, 6.3, ISO=100; לצילום כנפיים או ניירות ביצים, אם כי סביר להניח שמצלמות אחרות מספיקות
Aedes aegypti  יתושיםBEIזנים מרובים מכיוון שביצים זמינות
מזינים ממברנה מלאכותיתhttps://lillieglassblowers.com/מזין ממברנה Meduim, בהתאמה אישית, 33 מ"מChemglass מציע גם, אבל הגדלים לא נכונים עבורנו. שלנו בערך 3 ס"מ?
ATPMP ביו-רפואיICN15026605כל ATP באיכות טובה, מסנן 10 מ"מ סטרילי ב-20
חיטוילעיקור מים לבקיעת מצלמת
Canon EOS 7D Canon3814B004לצילום כנפיים או ניירות ביצים, אם כי מצלמות אחרות ככל הנראה מספיקות
לדפיברין דם כבשים קולורדו סרום ושות'60 מ"ל, כל שבועייםhttps://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
מאיר מיקרוסקופ צוואר אווז כפולדולן ג'נר Fiber-Lite 180181-1 מערכת
מלקחיים
גזהomnisorb ii4 "ספוגים לא ארוגים
פישר סיינטיפיק12-544-2
צלחות פטרי זכוכית, 100 ופעמים; 15 מ"מVWR75845-546להרדמה/מניפולציה של יתושים על
קרח מעיים של חזיריםכל מעדנייהשאנו קונים בכמויות גדולות, מפצלים, שוטפים ומאחסנים בכמויות קטנות של ~4X12 אינץ' ב-20 ב-50 מ"ל
דלי
קרח קרח
Kimwipeפישר סיינטיפיק06-666A
Leica GZ4 StereoZoom מיקרוסקופלסינון יתושים טרנסגניים (אם רלוונטי)
מברשת צבע סינטטית AIT מידה 10-0למניפולציה של זחלים/גלמים (אמזון)
צינור תחתוניםWalmartL'eggs Everyday  ניילון לנשים <חזק>פלוס גובה הברך בוהן שקופה, 16 זוגות (בתוספת מתאים לקרטון)
עפרונותכל מותג
מיכלי פלסטיק עבור 2° אחסון קרטוניםWalmartסטריליט 58 Qt קופסת אחסון בסיס שקוף מכסה לבן סט של 8
מיכלי פלסטיק לגידול זחליםWalmartSterilite 28 Qt. קופסת אחסון פלסטיק, לבן, סט של 10
מיכלי פלסטיק לבקיעת זחליםWalmartSterilite 6 Qt. קופסת אחסון פלסטיק,
לבן פוליפרופילן שקוף מיכלי מעדנייה WebstaurantStore  127DM12BULK12 אונקיות, או 16 אונקיות במידת הצורך לגדול יותר (127RD16BULK)
גומיותOffice Max #100736/#909606 /#377741512 אינץ', #64 ו-#10
פקק גומיVWR217-0515לסגירת יתושים
מקור סוכר, כגון קוביות סוכר או צימוקים
מזון פתיתי טטרמיןטטרמין16106
tpsDigStony Brook Morphometricsתוכנה חינמית לעיבוד תמונה מורפומטרית המופצת באופן מקוון זמינה בכתובת https://www.sbmorphometrics.org/
tpsUtilStony Brook Morphometricsתוכנה חינמית לעיבוד תמונה מורפומטרית המופצת באינטרנט זמינה בכתובת https://www.sbmorphometrics.org/
בד אורגנזה לבן 8 אינץ' ופעמים; 8 אינץ'FabricWholesale.com 4491676Joann Casa Collection בד אורגנזה מאת Casa Collection 
ויטמן דרגה 1 נייר סינון איכותני ויטמן1001-824לניירות ביצים. הצבע הלבן מקל על ראיית הביצים השחורות.
אתנול Dumont 5SF זכוכית מיקרוסקופ שקופית חרוטי

מקורות

  1. Dawkins, R. The Selfish Gene. New edition. , University Press. Oxford, New York. Oxford. (1989).
  2. Crow, J. F. Unmasking a Cheating Gene. Science. 283 (5408), 1651-1652 (1999).
  3. Gould, F. Broadening the application of evolutionarily based genetic pest management. Evolution. 62 (2), 500-510 (2008).
  4. Williams, A. E., Franz, A. W. E., Reid, W. R., Olson, K. E. Antiviral effectors and gene drive strategies for mosquito population suppression or replacement to mitigate arbovirus transmission by Aedes aegypti. Insects. 11 (1), (2020).
  5. Irvin, N., Hoddle, M. S., O'Brochta, D. A., Carey, B., Atkinson, P. W. Assessing fitness costs for transgenic Aedes aegypti expressing the GFP marker and transposase genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (3), 891-896 (2004).
  6. Moreira, L. A., Wang, J., Collins, F. H., Jacobs-Lorena, M. Fitness of anopheline mosquitoes expressing transgenes that inhibit Plasmodium development. Genetics. 166 (3), 1337-1341 (2004).
  7. Dilani, P. V. D., Dassanayake, R. S., Tyagi, B. K., Silva Gunawardene,, N, Y. I. The impact of transgenesis on mosquito fitness: A review. Frontiers in Insect Science. 38, (2022).
  8. Hammond, A. M., et al. The creation and selection of mutations resistant to a gene drive over multiple generations in the malaria mosquito. PLOS Genetics. 13 (10), (2017).
  9. Reid, W., et al. Assessing single-locus CRISPR/Cas9-based gene drive variants in the mosquito Aedes aegypti via single-generation crosses and modeling. 3 (12), (2022).
  10. Wu, S. L., et al. MGDrivE 2: A simulation framework for gene drive systems incorporating seasonality and epidemiological dynamics. PLOS Computational Biology. 17 (5), (2021).
  11. Oberhofer, G., Ivy, T., Hay, B. A. Gene drive and resilience through renewal with next generation Cleave and Rescue selfish genetic elements. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (16), 9013-9021 (2020).
  12. Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11 (1), 5553(2020).
  13. Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).
  14. Champer, J., et al. A CRISPR homing gene drive targeting a haplolethal gene removes resistance alleles and successfully spreads through a cage population. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24377-24383 (2020).
  15. Champer, S. E. 15, et al. Computational and experimental performance of CRISPR homing gene drive strategies with multiplexed gRNAs. Science Advances. 6 (10), (2020).
  16. Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9. 51701, (2020).
  17. Champer, S. E., Kim, I. K., Clark, A. G., Messer, P. W., Champer, J. Anopheles homing suppression drive candidates exhibit unexpected performance differences in simulations with spatial structure. eLife. 11, 79121(2022).
  18. Petersen, V., et al. Assessment of the correlation between wing size and body weight in captive Culex quinquefasciatus. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 49 (4), 508-511 (2016).
  19. Yeap, H. L., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M., Ritchie, S. A., Johnson, P. H. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 89 (1), 78-92 (2013).
  20. Fecundity Briegel, H. metabolism, and body size in Anopheles (Diptera: Culicidae), vectors of malaria. Journal of Medical Entomology. 27 (5), 839-850 (1990).
  21. Hurd, H., Hogg, J. C., Renshaw, M. Interactions between bloodfeeding, fecundity and infection in mosquitoes. Parasitology Today. 11 (11), 411-416 (1995).
  22. Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
  23. Coates, C. J., Jasinskiene, N., Miyashiro, L., James, A. A. Mariner transposition and transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (7), 3748-3751 (1998).
  24. Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments. 83 (83), (2014).
  25. Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harbor Protocols. (10), (2010).
  26. Rohlf, F. J. TpsDig (2.32) [Computer software. , (2018).
  27. Rohlf, F. J. TpsUtil (1.79) [Computer software. , (2018).
  28. Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. Geometric Morphometrics for Biologists. , Elsevier Academic Press. New York, NY. (2017).
  29. Size Klingenberg, C. P., shape, and form: concepts of allometry in geometric morphometrics. Development Genes and Evolution. 226 (3), 113-137 (2016).
  30. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: Parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (3), 507-516 (2016).
  31. Ross, P. A., Hoffmann, A. A. Fitness costs of Wolbachia shift in locally-adapted Aedes aegypti mosquitoes. Environmental Microbiology. 24 (12), 5749-5759 (2022).
  32. Rigby, L. M., Johnson, B. J., Peatey, C. L., Beebe, N. W., Devine, G. J. The impact of sublethal permethrin exposure on susceptible and resistant genotypes of the urban disease vector Aedes aegypti. Pest Management Science. 77 (7), 3450-3457 (2021).
  33. Smith, L. B., Silva, J. J., Chen, C., Harrington, L. C., Scott, J. G. Fitness costs of individual and combined pyrethroid resistance mechanisms, kdr and CYP-mediated detoxification, in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009271(2021).
  34. Chaves, B. A., et al. Vertical transmission of Zika virus (Flaviviridae, Flavivirus) in Amazonian Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) delays egg hatching and larval development of progeny. Journal of Medical Entomology. 56 (6), 1739-1744 (2019).
  35. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  36. David, M., Garcia, G., Valle, D., Maciel-de-Freitas, R. Insecticide resistance and fitness: the case of four Aedes aegypti populations from different Brazilian regions. BioMed Research International. , (2018).
  37. Wendell, M. D., Wilson, T. G., Higgs, S., Black, W. C. Chemical and gamma-ray mutagenesis of the white gene in Aedes aegypti. Insect Molecular Biology. 9 (2), 119-125 (2000).
  38. Koenraadt, C. J., Kormaksson, M., Harrington, L. C. Effects of inbreeding and genetic modification on Aedes aegypti larval competition and adult energy reserves. Parasites and Vectors. 3, (2010).
  39. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Developmental Biology. 8, (2008).
  40. Farnesi, L. C., Vargas, H. C. M., Valle, D., Rezende, G. L. Darker eggs of mosquitoes resist more to dry conditions: Melanin enhances serosal cuticle contribution in egg resistance to desiccation in Aedes, Anopheles and Culex vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), (2017).
  41. Carvalho, D. O., et al. Mosquito pornoscopy: Observation and interruption of Aedes aegypti copulation to determine female polyandric event and mixed progeny. PLoS ONE. 13 (3), (2018).
  42. Helinski, M. E., Harrington, L. C. Male mating history and body size influence female fecundity and longevity of the dengue vector Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 48 (2), 202-211 (2011).
  43. Felipe Ramarez-Sanchez,, Camargo, L., Avila, C., W, F. Male sexual history influences female fertility and re-mating incidence in the mosquito vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Insect Physiology. 121, 104019(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

יתושים טרנסגנייםתכונות היסטוריה של חייםהנעה גנטיתמורפומטריה של כנפייםמדידת פוריותחיוניות זחליםניתוח יחס מיניםתוחלת חיים של בוגרים
כימות עלויות כושר ביתושים מהונדסים, Aedes aegypti
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.