מאמר שיטה

בידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley

DOI:

10.3791/65172

⸱

7 באפריל 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Medical Research Unit in Biochemistry, Specialties Hospital, National Medical Center SXXI, Instituto Mexicano de Seguro Social, 3Department of Agricultural and Animal Production, Division of Biological and Health Science, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, 4Molecular Biology Research Laboratory, Center for Congenital Malformations, Children Hospital of Mexico Federico Gomez (HIMFG)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה לבידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים (MSC) שמקורם ברקמת שומן מחולדות Sprague Dawley.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים מזנכימליים בוגרים חוללו מהפכה בביולוגיה המולקולרית ובביולוגיה התאית בעשורים האחרונים. הם יכולים להתמיין לסוגי תאים מיוחדים שונים, בנוסף ליכולתם הגדולה להתחדשות עצמית, הגירה והתפשטות. רקמת השומן היא אחד המקורות הפחות פולשניים והנגישים ביותר של תאים מזנכימליים. כמו כן, דווח כי יש לו תשואות גבוהות יותר בהשוואה למקורות אחרים, כמו גם תכונות אימונומודולטוריות מעולות. לאחרונה פורסמו נהלים שונים להשגת תאים מזנכימליים בוגרים ממקורות רקמה שונים וממיני בעלי חיים. לאחר הערכת הקריטריונים של מחברים מסוימים, תיקננו מתודולוגיה ישימה למטרות שונות וניתנת לשחזור בקלות. מאגר של מקטע כלי דם סטרומה (SVF) מרקמת שומן פרירנלית ואפידידימלית איפשר לנו לפתח תרביות ראשוניות עם מורפולוגיה ופונקציונליות אופטימליות. התאים נצפו דבוקים למשטח הפלסטיק במשך 24 שעות, והציגו מורפולוגיה דמוית פיברובלסט, עם הארכות ונטייה ליצור מושבות. טכניקות ציטומטריית זרימה (FC) ואימונופלואורסנציה (IF) שימשו להערכת הביטוי של סמני הממברנה CD105, CD9, CD63, CD31 ו- CD34. יכולתם של תאי גזע שמקורם בשומן (ASC) להתמיין לשושלת האדיפוגנית הוערכה גם באמצעות קוקטייל של גורמים (4 מיקרומטר אינסולין, 0.5 מילימטר 3-מתיל-איזו-בוטיל-קסנטין ו-1 מיקרומטר דקסמתזון). לאחר 48 שעות, אובדן הדרגתי של מורפולוגיה פיברובלסטואיד נצפתה, ובגיל 12 ימים, נוכחות של טיפות שומנים חיובי שמן כתמים אדום אושר. לסיכום, מוצע הליך להשגת תרביות ASC אופטימליות ותפקודיות ליישום ברפואה רגנרטיבית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) השפיעו מאוד על הרפואה הרגנרטיבית בשל יכולתם הגבוהה להתחדשות עצמית, התפשטות, הגירה והתמיינות לשושלות תאים שונות 1,2. כיום, מחקרים רבים מתמקדים בפוטנציאל שלהם לטיפול ואבחון של מחלות שונות.

ישנם מקורות שונים של תאים מזנכימליים: מח עצם, שרירי שלד, מי שפיר, זקיקי שיער, שליה ורקמת שומן, בין היתר. הם מתקבלים ממינים שונים, כולל בני אדם, עכברים, חולדות, כלבים וסוסים3. MSCs שמקורם במח עצם (BMSCs) שימשו במשך שנים רבות כמקור עיקרי לתאי גזע ברפואה רגנרטיבית וכחלופה לשימוש בתאי גזע עובריים4. עם זאת, MSCs נגזר שומן, או תאי גזע נגזר שומן (ASC), הם חלופה חשובה עם יתרונות גדולים בשל קלות האיסוף והבידוד שלהם, כמו גם את התשואה של תאים המתקבלים לכל גרם של רקמת שומן 5,6. דווח כי קצב הקציר של ASCs הוא בדרך כלל גבוה יותר מזה של BMSCs7. בתחילה הוצע כי יכולת התיקון/התחדשות של ASCs נובעת מיכולתם להתמיין לשושלות תאים אחרות8. עם זאת, מחקרים בשנים האחרונות חיזקו את התפקיד העיקרי של גורמים פרקריניים ששוחררו על ידי ASCs בפוטנציאל התיקון שלהם 9,10.

רקמת השומן (AT), בנוסף להיותה עתודת אנרגיה, מקיימת אינטראקציה עם המערכת האנדוקרינית, העצבים והלב וכלי הדם. הוא מעורב גם בצמיחה והתפתחות לאחר הלידה, תחזוקה של הומאוסטזיס רקמות, תיקון רקמות, והתחדשות. ה- AT מורכב מאדיפוציטים, תאי שריר חלק של כלי הדם, תאי אנדותל, פיברובלסטים, מונוציטים, מקרופאגים, לימפוציטים, פרדיפויטים ו- ASC. אלה האחרונים בעלי תפקיד חשוב ברפואה רגנרטיבית בשל האימונוגניות הנמוכה שלהם11,12. ASCs ניתן להשיג על ידי עיכול אנזימטי ועיבוד מכני או על ידי חצילים רקמת שומן. תרבויות ראשוניות של ASCs קלות לתחזוקה, צמיחה והרחבה. אפיון פנוטיפי של ASCs חיוני כדי לאמת את זהות התאים על ידי הערכת הביטוי של סמנים ספציפיים בממברנה באמצעות שיטות כגון immunofluorescence ו cytometry זרימה13. הפדרציה הבינלאומית לטיפולי שומן ומדע (IFATS) והאגודה הבינלאומית לטיפול תאי (ISCT) הגדירו כי ASCs מבטאים CD73, CD90 ו- CD105, בעוד שחסרים את הביטוי של CD11b, CD14, CD19, CD45 ו- HLA-DR14. סמנים אלה, הן חיוביים והן שליליים, נחשבים לפיכך אמינים לאפיון ASC.

פרויקט זה התמקד בתיאור הליך לבידוד וזיהוי של תאים מזנכימליים בוגרים שהופקו מתאי AT, שכן מקור תאים זה אינו מציב אתגרים אתיים, בניגוד לתאי גזע עובריים. זה ממצק את ההליך כאפשרות מעשית בגלל קלות הגישה והשיטה הזעיר פולשנית בהשוואה לתאי גזע שמקורם במח עצם.

לתאים מזנכימליים ממקור רקמה זה יש תפקיד חשוב ברפואה רגנרטיבית בגלל יכולותיהם האימונומודולטוריות ודחייה חיסונית נמוכה. לכן, המחקר הנוכחי הוא חלק מהותי במחקר עתידי על הפרשתם ויישומם כטיפול רגנרטיבי במחלות שונות, כולל מחלות מטבוליות כגון סוכרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם להנחיות המקסיקניות לטיפול בבעלי חיים, בהתבסס על המלצות האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה בינלאומיות (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, מקסיקו). הפרוטוקול נבדק, אושר ונרשם על ידי ועדת האתיקה לחקר הבריאות של המכון המקסיקני דל סגורו חברתי (R-2021-785-092).

1. הסרת רקמת שומן מחולדות על ידי כריתה כירורגית

  1. הכינו שני צינורות חרוטיים עם 20 מ"ל של תמיסת מלח אנטי-מיקרוטית סטרילית 1x פוספט חוצץ (PBS-AA) (1x PBS, גנטמיצין [20 מיקרוגרם/מ"ל], ואמפוטריצין [0.5 מיקרוגרם/מ"ל]) ושמרו על קרח.
  2. בחר שני זכרים בוגרים של חולדות Sprague Dawley (R. norvegicus) במצב בריאותי טוב. ודאו שהחולדות בנות 3-4 חודשים ומשקלן הקופורלי הוא 350-450 גרם.
  3. המשך להרגעה עם 20 מ"ג / ק"ג קסילזין הידרוכלוריד, וכעבור 5 דקות, מתן הרדמה עם מינון של 120 מ"ג / ק"ג קטמין הידרוכלוריד תוך צפקי. יש לשמן את שתי העיניים במשחה אופתלמית למניעת התייבשות. לאחר מכן, יש לוודא את עומק ההרדמה באמצעות חוסר רפלקס דוושה.
  4. לגלח ולחטא את אזור הבטן והמפשעה עם תמיסת יוד. החל וילונות כירורגיים כדי לשמור על סטריליות. לאחר מכן, בצע חתך אורכי חציוני מעצם החזה לאזור האשכים.
  5. הסר את רקמת השומן המקיפה הן את האפידידימיס והן את הכליות באמצעות מלקחיים סטריליים ומקם בתמיסת PBS-AA 1x. שמור את הדגימות על קרח.
  6. יש לתפור את החתך סגור במידת הצורך בהתאם להנחיות המוסדיות ולהרדים את בעלי החיים במינון תוך לבבי של 40 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל. לאחר אישור המוות, יש להשליך את הפגר בהתאם להליכים מוסדיים.
    הערה: המוות מעורר מנגנוני איתות המשפיעים על אימונופנוטיפ, יכולת התמיינות והשפעה פרקרינית של תאים מזנכימליים. לפיכך, איסוף רקמות מבוצע לפני המתת חסד. 

2. בידוד תאים מזנכימליים מרקמת השומן

  1. הסר את רקמת השומן עם מלקחיים סטריליים בתוך ארון בטיחות ביולוגית והנח אותה על נייר סינון סטרילי בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ כדי לספוג PBS עודף.
  2. מעבירים את רקמת השומן לצלחת פטרי אחרת ומבצעים שלוש שטיפות במשך 5 דקות כל אחת עם 10 מ"ל של תמיסת PBS-AA אחת באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.
  3. מכנית לפרק את הרקמה לשברים של כ 1 ס"מ2 באמצעות מספריים ואזמל.
  4. הכינו collagenase סוג IV (0.075%) ב 20 מ"ל של מדיום הנשר של Dulbecco ללא תוספת (DMEM). יש לסנן דרך מסנן מזרקים בגודל 0.22 מיקרומטר ולשמור על טמפרטורה של 37°C.
  5. הוסף את תמיסת הקולגנאז (20 מ"ל) שהוכנה בשלב 2.4 לתוך קריסטל עם הרקמה המקוטעת ופס מגנטי. יש לאטום את המיכל ולדגור תחת תסיסה איטית ומתמשכת בטמפרטורה של 37°C.
    הערה: העיכול האנזימטי אורך כ-90 דקות (יש לשמור על ערבוב איטי כדי לשמור על שלמות קרומי התא).
  6. סנן את ההומוגנט דרך נירוסטה, 40 רשת, מסנן צמצם 0.38 מ"מ על צלחת פטרי 100 מ"מ ולאסוף את מתלה התא בצינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל.
  7. הוסף 20 מ"ל של DMEM מחומם בתוספת (10% סרום בקר עוברי [FBS], 2 מ"מ גלוטמין, 2 מ"מ נתרן פירובט, 100x תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות, ותמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית 100x [AA]). בזהירות להשעות את מקטע כלי הדם סטרומה (SVE).
  8. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 290 x גרם במשך 10 דקות, להשליך את supernatant עם פיפטה 25 מ"ל, ולשטוף בעדינות את התאים עם 40 מ"ל של מדיום DMEM ללא תוספת.
  9. חזור על שלב זה. השתמש בצינור חרוטי סטרילי חדש בין השלבים כדי לגרור את הכמות הקטנה ביותר של פסולת תאית ושומן.
  10. להשעות את הגלולה ב 5 מ"ל של DMEM בתוספת עם פיפטה 5 מ"ל ולהעביר T-25 ס"מ2 בקבוק. יש לדגור במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
  11. למחרת, בצע שלוש שטיפות עם 5 מ"ל של PBS-AA מחומם 1x ושתי שטיפות עם DMEM ללא תוספת כדי להסיר פסולת תאים ותאים שאינם דבקים. הוסף 5 מ"ל של DMEM טרי, מחומם, בתוספת פיפטה 5 מ"ל ולשנות את המדיום כל 3-4 ימים.

3. שימור והרחבה של התרבויות הראשוניות של ASC

  1. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 90%-100% (8 ± יומיים), יש לשטוף פעמיים עם 5 מ"ל DMEM ללא תוסף. הוסף 1 מ"ל של 0.025% מחומם טריפסין-2 mM חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) ודגור במשך 5-7 דקות ב 37 ° C.
  2. כאשר monolayer התא מנותק, להוסיף 4 מ"ל של DMEM בתוספת בעדינות לפרק את השעיית התא.
  3. מעבירים את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל, מוסיפים 5 מ"ל של DMEM מחומם, בתוספת ומשהה בעדינות להומוגניזה.
  4. צנטריפוגה ב 290 x גרם במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט ולערבב בעדינות את הגלולה ב-1 מ"ל של תוסף DMEM. ספרו את התאים בתא נויבאואר לאחר צביעה בכחול טריפאן.
  5. לבסוף, זרע 2.5 x 103 תאים/ס"מ2 ביחס פיצול של 1:4 בצלוחיות T-75. צעד זה מבטיח היווצרות מושבות וקצב ריבוי גבוה.

4. אפיון מורפולוגיה של תרבויות ראשוניות ASC

  1. שימו לב למורפולוגיה של ASCs תחת מיקרוסקופ הפוך.
    הערה: לפני ההרכבה לצורך זיהוי היסטולוגיה ואוטיזם, יש לטפל בכיסויים בתמיסת ג'לטין 1%. הקרינו עם UV במשך 15 דקות.
    1. הסירו את הכיסויים מתמיסת אתנול 70% והניחו להם להתייבש במשך 5 דקות.
    2. יש לטבול את החלקות בתמיסת ג'לטין סטרילית 1%, לנקז ולייבש בטמפרטורת החדר (RT).
    3. הכניסו כל מכסה לכל באר של צלחת בעלת 6 בארות והקרינו את הצלחות באור UV למשך 15 דקות.
    4. זרעו טיפה המכילה 25X103 תאים במרכז הבאר, המתינו דקה והוסיפו 1 מ"ל של מדיום DMEM מוסף. יש לדגור במשך 96 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
    5. מוציאים את המדיום ומבצעים שלוש שטיפות עם 1x PBS-AA באמצעות פיפטת העברה.
    6. הוסף 1 מ"ל של פורמלין נייטרלי 3.5% לכל באר ודגר במשך שעה אחת ב- RT. בזהירות להסיר את הפורמלין ולהוסיף 1 מ"ל של אתנול קר 70% לכל באר.
    7. אטמו את הצלחת בפרפילם עד לשימוש, כדי למנוע התייבשות.
      הערה: המורפולוגיה התאית של ASCs מוערכת גם על ידי צביעת hematoxylin-eosin במהלך מעברים שונים.
    8. הסר את 70% אתנול מכל באר ולחות את התאים במשך 5 דקות עם מים מזוקקים. בינתיים, סננו את פתרונות הצביעה.
    9. מוציאים את המים ומכתימים את התאים בתסיסה איטית למשך 15 דקות עם תמיסת המטוקסילין של האריס.
    10. הסירו את תמיסת הכתמים ובצעו שתי שטיפות עם PBS אחד.
    11. מכתימים את התאים בתמיסת אאוזין תחת תסיסה איטית למשך דקה אחת. לאחר מכן, הסר את התמיסה ובצע שתי שטיפות עם PBS 1x.
    12. הסר בזהירות את הכיסויים מכל באר והרכיב את המגלשות על טיפה של תמיסת הרכבה PBS-גליצרול (1:1 v/v).
    13. הניחו קו של לכה סביב הכיסוי והתבוננו בשקופיות ההיסטולוגיות מתחת למיקרוסקופ האור.

5. סמני ביטוי של ASCs על ידי immunofluorescence

  1. הכינו את מאגר הכביסה המכיל 1x PBS-0.05% Tween 20. בצעו את השטיפות ב-RT ובטלטול איטי. לשטוף את הצלחות שלוש פעמים עם 2 מ"ל של חיץ / באר (לדגור במשך 3 דקות עבור כל כביסה).
  2. מניחים 1 מ"ל של מגיב חוסם (1:10) ודגורים עם תסיסה איטית במשך 20 דקות.
  3. הוסף 200 μL (דילול 1:50) של הנוגדנים העיקריים הבאים לכל באר: CD9 (עכבר חד שבטי), CD34 (ארנב רב-שבטי) ואנטי-CD63 (עז רב-שבטית). לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
  4. שטפו את הצלחות שלוש פעמים שוב ודגרו עם 200 μL (דילול 1:50) של הנוגדנים המשניים הבאים: עז מצומדת נגד עכבר IgG FITC, חמור נגד עז IgG DyeLight 550, ועז נגד ארנב IgG Cy3.
  5. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS-0.05% Tween 20 ולהכתים את גרעיני התא ב-100 μL של DRAQ-7 (דילול: 17 μL ב-1 מ"ל מים מזוקקים כפול) למשך 20 דקות.
  6. שטפו שלוש פעמים נוספות והרכיבו את המגלשות לפי שלבים 4.1.12-4.1.13. יש לאחסן את הדגימות מוגנות מפני אור ומוקפאות עד לשימוש.
  7. דמיינו את הדגימות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי אפיפלואורסצנטי באמצעות ההגדרות והתוכנה המתאימות המומלצות לציוד זה.

6. סמני ביטוי של ASCs לפי ציטומטריית זרימה

  1. התאם תרחיף תא בודד מתאים שעברו טריפסינזציה או הפשרה (תת-מעברים 3 או 4) בריכוז של 1 x 106 תאים/מ"ל של 1x PBS-5% FBS. Aliquot 100 μL עם 100,000 תאים בצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל. השתמש ב- aliquot אחד ללא תיוג עבור בקרת הפלואורסצנטיות האוטומטית.
  2. הוסף למנוחה את כל הכמויות המתאימות של Anti-CD105 AF-594 ו- Anti-CD31 AF-680, בהתאם להוראות היצרן. לדגור בחושך במשך 20 דקות ב 4 ° C.
  3. יש לשטוף את הכתם העודף עם 1 מ"ל של 1x PBS-5% FBS על ידי צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ולהשהות ב 300 μL של 1% פורמלין.
  4. בצע רכישת דגימה על ציטומטר זרימה. אסטרטגיית ה-gating של התאים מבוססת על גידור FSC-A לעומת SSC-A, תאים בודדים מגודרים באמצעות SSC-H לעומת SSC-A ואחריו FSC-A לעומת FSC-H.
  5. השתמש בגלאי Y610-mCherry-A עבור CD105 AF-594 וגלאי R660-APC-A עבור CD31 AF-680.

7. בידול ASCs לשושלת האדיפוגנית

  1. בצלחת 6 בארות, זרע 1 x 10 4 תאים (P-4) לכל ס"מ 2 ודגור ב 37 ° C, 5% CO2, עד 60-80% מפגש (~ 72-96 שעות). השראת התמיינות ישירות על מדיום התרבית: 4 מיקרומטר אינסולין, 1 מיקרומטר דקסמתזון 21-אצטט (Dxa), ו-0.5 מילימטר של 3-איזובוטיל-1-מתיל-קסנטין (MIX). שנה את מדיום הבידול כל 2-3 ימים.
  2. הכינו תמיסת מלאי של 800 מיקרומטר אינסולין ב-2 מ"ל מים סטריליים אולטרה-טהורים (הוסיפו 20 מיקרוליטר של 1 N HCl כדי להבטיח פירוק מלא) ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. הוסף 10 μL של מלאי אינסולין, בעבר מדולל 1:100, ולהחיל 10 μL בנפח הסופי של 2 מ"ל לכל באר.
  3. הכינו תמיסת מלאי של 1 mM Dxa ב 5 מ"ל של מים סטריליים טהורים במיוחד (שים לב כי המסה מלאה אינה מתרחשת). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. הוסף 40 μL/well של דילול 1:4 של מלאי Dxa.
  4. הכינו מלאי של 100 מילימטר של MIX ב-2.5 מ"ל של 0.1 N NaOH, מערבולת, והוסיפו 40 מיקרוליטר של 1 N NaOH לפירוק מלא. יש לאחסן בטמפרטורה של -70°C. הוסף 10 μL / באר של מלאי MIX.
  5. סנן את תמיסות המלאי דרך מסנן מזרק סטרילי בגודל 0.22 מיקרומטר לפני האחסון.
  6. ביום ה-12, יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS 1x ולדגור עם 500 μL של 4% פורמלין במשך שעה אחת ב-RT. לשטוף כל באר פעמיים עם מים מזוקקים ולאחר מכן, על ידי 60% איזופרופנול במשך 5 דקות ולתת להתייבש.
  7. הוסיפו 0.5% שמן אדום O מדולל ב-60% איזופרופנול (500 מיקרוליטר/באר) ודגרו במשך 20 דקות ב-RT. שטפו עם 1 מ"ל מים מזוקקים שלוש פעמים והתבוננו תחת מיקרוסקופ הפוך.
    הערה: לקבלת ריאגנטים, ציוד וחומרים נדרשים, עיין בטבלת החומרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמת השומן התקבלה מחולדות בוגרות של Sprague Dawley בגילאי 3-4 חודשים ומשקל גוף של 401 ± 41 גרם (ממוצע גיאומטרי ± SD). ערך ממוצע של 3.8 גרם של רקמת שומן אפידידימלית ופרירנלית התאים לניתוח של 15 מיצויים ניסיוניים. לאחר 24 שעות של תרבית, אוכלוסיות התאים נותרו דבוקות למשטח הפלסטיק והציגו מורפולוגיה הטרוגנית. המעבר הראשון מומש לאחר 8 ± יומיים, עם תפוקה של 1.4 ± 0.6 x 106 תאים בסך הכל שמונה ניסויים. תצפית ישירה בשדה בהיר (איור 1) וצביעת המטוקסילין-אאוסין (איור 2

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בארבעת העשורים האחרונים מאז גילוי MSCs, כמה קבוצות של חוקרים תיארו הליכים להשגת MSCs מרקמות ומינים שונים. אחד היתרונות של שימוש בחולדות כמודל של בעלי חיים הוא התחזוקה הקלה וההתפתחות המהירה שלהן, כמו גם הקלות של קבלת MSCs מרקמת השומן. מקורות רקמה שונים תוארו לקבלת ASCs, כגון ויסצרלי, פריrenal, epididymal, ושומן תת עורי 12,13,14,15,16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אסירי תודה למכון המקסיקני לביטוח לאומי (IMSS) ולבית החולים לילדים של מקסיקו, פדריקו גומז (HIMFG) ולצוות Bioterio של תיאום המחקר של IMSS, על התמיכה שניתנה לביצוע פרויקט זה. אנו מודים למועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה על מלגת AOC (815290) ולאנטוניו דוארטה רייס על התמיכה הטכנית בחומר האודיו-ויזואלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אמפוטריצין BHyCloneSV30078.01
איזון אנליטיSartoriusAX224
נוגדן נגד CD9 (C-4)סנטה קרוזSC-13118
נוגדן נגד CD34 (C-18)סנטה קרוזSc-7045
נוגדן נגד C63סנטה קרוזSC-5275
נוגדן נגד אנדוגלין/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa CruzSc-18838A594
נוגדן נגד CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680Santa CruzSc-18916AF680
נוגדן עז נגד rabitt IgG (H+L) Cy3 NovusNB 120-6939
נוגדן חמור נגד עזים IgG (H+L) DyLight 550 InvitrogenSA5-10087
נוגדן נגד עכבר IgG FITC מצומד עז F (ab´)מערכות RD.מס' F103B
מסנן עליון בקבוק סטריליCORNING10718003
צלוחיות תרבית תאים ורקמותBIOFIL170718-312B
מונה תאים Bright-Line Hemacytometer עם שקופיות תא ספירת תאיםSIGMA Aldrich Z359629
בארות תאים: 6 בארות עם מכסהCORNING25810
צינורות חרוטיים צנטריפוגהHeTTICHROTANA460R
צנטריפוגה צינורות אפנדורףפישר סיינטיפיקM0018242_44797
קולגן IV וורת'ינגטוןLS004186
CryovialSPL מדעי החיים43112
צינורות תרבותגריינר ביו-וואן 191180
CytExpert 2.0בקמן קולטרגרסה
ציטומטר CytoFlex LXבקמן קולטרFLOW-2463VID03.17
DMEMGIBCO31600-034
DMSOSIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 צבעתרמו Sc. D15106
EDTASIGMA Aldrich60-00-4
Eosin Hycelצהבהב300
אתנול 96%Baker64-17-5
צינורות פלקון 15 מ"לגריינר ביו-וואן 188271
שפופרות פלקון 50 מ"לגריינר ביו-וואן 227261
סרום בקר עוברי קורנינג35-010-CV
ג'לטיןSIGMA Aldrich128111163
ג'נטמיציןGIBCO15750045
גליצרין-טוהר גבוהHerschi Trading 56-81-5
HematoxylinAMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Sc.
קטמין לחיות מחמד (קטמין קלורוהידרט)ArandaSV057430
L-גלוטמין GIBCO / תרמו Sc. 25030-081
LSM תוכנה זן 2009 V5.5גרסה
ביולוגי בטיחות ארון Class IINuAire12082100801
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי Zeiss Axiovert 100M21.0028.001
מיקרוסקופ הפוך אולימפוס CK40CK40-G100
חומצות אמינו לא חיוניות 100XGIBCO11140050
צינורות מיקרו 2 מ"ל Sarstedt 72695400
צינורות מיקרו 1,5 מ"לSarstedt 72706400
Micropipettes 0.2-2 μ LFinnpipetteE97743
מיקרופיפטות 2-20 μ LFinnpipetteF54167
מיקרופיפטות 20-200 μ LFinnpipetteG32419
מיקרופיפטות 100-1000 μ LFinnpipetteFJ39895
נוזל מיכל חנקןטיילור-וורטון681-021-06
ParaformaldehydeSIGMA AldrichSLBC3029V
פניצילין / סטרפטומיצין GIBCO / Thermo Sc.
צלחת פטרי תרבית תאיםCORNING Inc480167
טיפים לפיפטAxygen Scientific301-03-201
פיסבנטל (נתרן פנטוברביטל)PISA AgropecuariaQ-7833-215
אשלגן כלורי J.T.Baker7447-40-7
אשלגן פוספט דו-בסיסיJ.T Baker2139900
S1 מילוי פיפטהThermo Sc9531
פיפטה סרולוגית 5 מ"לPYREXL010005
פיפטה סרולוגית 10 מ"לPYREXL010010
נתרן ביקרבונטJ.T Baker144-55-8
נתרן כלורי J.T.Baker15368426
נתרן פוספט דו-בסיסינטול מים J.T Baker7558-79-4
נתרן פירובטGIBCO BRL11840-048
מסנן מזרק סטריליCORNING431222
ספקטרופוטומטרPerkinElmer Lambda 25L6020060
טיטר שייקר צלחותLAB-LINE1250
פיפט העברהSamco/Thermo Sc728NL
Trypan Blue כתםGIBCO1198566
טריפסין מלבלב חזירSIGMA Aldrich102H0234
Tween 20SIGMA Aldrich9005-64-5
מגיב חוסם אוניברסלי 10xBioGenexHK085-GP
Xilapet 2% (קסילזין הידרוכלוריד)Pet' s פארמהQ-7972-025
חינמית50116047חופשית15140122

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
  2. Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
  3. González, M. Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , Universidad de León. PhD thesis, http://hdl.handle.net/10612/3600 (2014).
  4. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  5. Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419(2019).
  6. Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
  7. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68(2019).
  8. Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221(2013).
  9. Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
  10. Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
  11. Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
  12. Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
  13. Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
  14. Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765(2019).
  15. Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126(2021).
  16. Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
  17. Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
  18. Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615(2011).
  19. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  20. Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
  21. Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
  22. Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
  23. Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
  24. Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
  25. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897(2018).
  26. Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
  27. Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
  28. Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
  29. He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים