מיקרו-הזרקה ממוקדת ואלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים פרימטים לשינוי גנטי

חקירת ההתפתחות והאבולוציה הפיזיולוגית (הפתולוגית) של קליפת המוח היא משימה אימתנית שמתעכבת על ידי היעדר מערכות מודל מתאימות. בעבר, מחקרים כאלה היו מוגבלים למודלים דו-ממדיים של תרביות תאים (כגון אב עצבי ראשוני או תרביות תאים עצביים) ולמודלים אבולוציוניים רחוקים של בעלי חיים (כגון מכרסמים)^1,2. בעוד מודלים אלה שימושיים להתמודדות עם שאלות מסוימות, הם מוגבלים במידול המורכבות, הרכב סוג התא, הארכיטקטורה התאית ודפוסי ביטוי הגנים של הניאוקורטקס האנושי המתפתח במצבים בריאים וחולים. מגבלות אלה מובילות, למשל, ליכולת תרגום ירודה של מודלים עכבריים של מחלות אנושיות למצב האנושי, כפי שמתואר במקרים מסוימים של מיקרוצפליה (למשל, Zhang et ^al.3). לאחרונה, פרימטים טרנסגניים שאינם אנושיים, שהם מודל קרוב יותר מבחינה אבולוציונית, תפקודית ומורפולוגית של התפתחות הניאו-קורטקס האנושי, נכנסו למוקד 4,5,6,7,8 כשהם מתגברים על מגבלות רבות של מודלים מבוססי תרביות תאים ומכרסמים. עם זאת, השימוש בפרימטים לא אנושיים במחקר הוא לא רק יקר מאוד וגוזל זמן רב, אלא גם מעלה חששות אתיים. לאחרונה, הפיתוח של טכנולוגיית אורגנואיד המוח 9,10 התגלה כחלופה מבטיחה שפותרת רבות מהמגבלות של מודלים קודמים 11,12,13,14,15,16.

אורגנואידים במוח הם מבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים), רב-תאיים המחקים את המאפיינים העיקריים של הציטוארכיטקטורה והרכב התא של אזור מוח אחד או יותר עבור חלון זמן התפתחותי מוגדר 11,12,13,14,17. מבנים תלת-ממדיים אלה נוצרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) או, אם הם זמינים עבור המינים המעניינים, מתאי גזע עובריים (ESC). באופן כללי, ניתן להבחין בין שני סוגים של אורגנואידים במוח בהתבסס על המתודולוגיה בה נעשה שימוש: אורגנואידים במוח לא מונחים ואזוריים (מונחים)¹⁸. ביצירת הסוג השני של אורגנואידים, מולקולות קטנות או גורמים מסופקים המנחים את ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לאורגנואידים של אזור מוח מסוים (למשל, אורגנואידים במוח הקדמי)¹⁸. לעומת זאת, באורגנואידים לא מונחים, ההתמיינות אינה מונחית על ידי תוספת של מולקולות קטנות אלא מסתמכת אך ורק על התמיינות ספונטנית של iPSCs/ESCs. האורגנואידים במוח המתקבלים מורכבים מסוגי תאים המייצגים אזורי מוח שונים (למשל, אורגנואידים מוחיים)¹⁸. אורגנואידים במוח משלבים תכונות מפתח רבות של התפתחות המוח עם ייצור חסכוני יחסית וחסכוני בזמן מכל מין של עניין שעבורו iPSCs או תאי גזע עובריים מושרים זמינים^11,12,13,14. זה הופך אורגנואידים במוח למודל מצוין עבור סוגים רבים של מחקרים נוירוביולוגיים, החל משאלות אבולוציוניות והתפתחותיות ועד מודלים של מחלות ובדיקות סמים^15,16. עם זאת, מענה לשאלות כאלה באמצעות אורגנואידים במוח תלוי מאוד בזמינות של שיטות שונות לשינוי גנטי.

היבט מרכזי אחד של חקר ההתפתחות הפיזיולוגית של ניאו-קורטקס (פתו) והאבולוציה שלה הוא ניתוח פונקציונלי של גנים וגרסאות גנים. זה מושג בדרך כלל על ידי ביטוי (חוץ רחמי) ו / או על ידי דפיקה (KD) או נוק-אאוט (KO) של גנים אלה. שינויים גנטיים כאלה יכולים להיות מסווגים לשינוי גנטי יציב וחולף, כמו גם לשינויים להיות מוגבל זמנית ומרחבית או לא מוגבל. שינוי גנטי יציב מוגדר על ידי הכנסת שינוי גנטי לגנום המארח המועבר לכל דורות התא הבאים. בהתאם לנקודת הזמן של שינוי גנטי, זה יכול להשפיע על כל התאים של אורגנואיד או יכול להיות מוגבל לאוכלוסיות תאים מסוימות. לרוב, שינוי גנטי יציב מושג באורגנואידים במוח ברמת iPSC/ESC על ידי יישום לנטי-וירוסים, מערכות דמויות טרנספוזון וטכנולוגיית CRISPR/Cas9 (נבדקו על-ידי, למשל, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 ו-Teriyapirom et ^al.20). יש לכך יתרון בכך שכל תאי האורגנואיד במוח נושאים את השינוי הגנטי וכי הוא אינו מוגבל זמנית או מרחבית. עם זאת, הייצור והאפיון של קווי iPSC/ESC יציבים אלה גוזלים זמן רב, ולעתים קרובות לוקח מספר חודשים עד שניתן לנתח את אורגנואידי המוח הראשונים ששונו (נבדקו על ידי למשל, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19, or Teriyapirom et ^al.20).

לעומת זאת, שינוי גנטי חולף מוגדר על ידי העברת מטען גנטי (למשל, פלסמיד ביטוי גנים) שאינו משתלב בגנום המאכסן. בעוד ששינוי זה יכול, באופן עקרוני, להיות מועבר לדורות התא הבאים, המטען הגנטי המועבר ידולל בהדרגה עם כל חלוקת תא. לכן, סוג זה של שינוי גנטי מוגבל בדרך כלל באופן זמני ומרחבי. שינוי גנטי חולף יכול להתבצע באורגנואידים במוח על ידי וירוסים הקשורים באדנו או על ידי אלקטרופורציה (נבדק על ידי, למשל, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19, ו Teriyapirom et ^al.20), כאשר האחרון מתואר בפירוט במאמר זה. בניגוד לשינוי גנטי יציב, גישה זו היא מהירה מאוד וחסכונית. אכן, אלקטרופורציה יכולה להתבצע בתוך דקות, ובהתאם לאוכלוסיית תאי היעד, אורגנואידים מחושמלים מוכנים לניתוח תוך ימים (נבדקו על ידי, למשל, Fischer et al.17 ו- Kyrousi et ^al.19). עם זאת, שינויים מורפולוגיים גסים של אורגנואיד המוח, כגון הבדלים בגודל, לא ניתן לזהות באמצעות שיטה זו, כמו סוג זה של שינוי גנטי מוגבל באופן זמני ומרחבי. הגבלה זו יכולה להיות גם יתרון, למשל, במקרה של חקר אוכלוסיות תאים בודדות בתוך האורגנואיד או ההשפעות על אורגנואידים במוח בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות (שנסקרו על ידי, למשל, Fischer et al.17 ו- Kyrousi et ^al.19).

גישה קלאסית לחקר תפקוד גנים במהלך התפתחות המוח והאבולוציה היא אלקטרופורציה ברחם. ברחם אלקטרופורציה היא טכניקה ידועה ושימושית להעברת מבני ביטוי גנים למוחות מכרסמים 21,22,23 וחמוס^24,25. ראשית, תמיסה המכילה את מבני הביטוי המעניינים מוזרקת במיקרו דרך דופן הרחם לחדר מסוים במוח העוברי, בהתאם לאזור שיש להתמקד בו. בשלב השני, פולסים חשמליים מוחלים כדי להדביק את התאים ישירות רירית החדר הממוקד. גישה זו אינה מוגבלת רק לביטוי חוץ רחמי או ביטוי יתר של גנים, כפי שהיא יכולה להיות מיושמת גם במחקרי KD או KO על ידי הזרקה זעירה של סיכת שיער קצרה (shRNA) או CRISPR/Cas9 (בצורה של פלסמידים ביטוי או ריבונוקלאו פרוטאינים [RNPs]), בהתאמה^26,27. עם זאת, לאלקטרופורציה ברחם של עוברי עכבר, חולדה וחמוס יש את אותן מגבלות שתוארו לעיל עבור מודלים אלה של בעלי חיים.

באופן אידיאלי, אחד רוצה לבצע אלקטרופורציה הרחם ישירות פרימטים. בעוד שבאופן עקרוני זה אפשרי מבחינה טכנית, ברחם אלקטרופורציה אינה מתבצעת בפרימטים בשל חששות אתיים, עלויות תחזוקה גבוהות של בעלי חיים וגודל המלטה קטן. עבור פרימטים מסוימים, כגון קופים גדולים (כולל בני אדם), זה לא אפשרי בכלל. עם זאת, לפרימטים אלה יש את הפוטנציאל הגדול ביותר לחקר התפתחות הניאו-קורטקס הפיזיולוגי (הפתולוגי) האנושי והאבולוציה שלו. פתרון אחד לדילמה זו הוא ליישם את טכניקת האלקטרופורציה על אורגנואידים במוח פרימטים²⁸.

מאמר זה מציג פרוטוקול לאלקטרופורציה של תת-סוג של אורגנואידים במוח פרימטים, אורגנואידים מוחיים של פרימטים. גישה זו מאפשרת שינוי גנטי מהיר וחסכוני של אוכלוסיות תאים בתוך המבנים דמויי החדרים של האורגנואידים. באופן ספציפי, אנו מתארים פרוטוקול מאוחד ליצירת אורגנואידים מוחיים פרימטים מבני אדם (הומו ספיינס), שימפנזה (Pan troglodytes), מקוק רזוס (Macaca mulatta) ומרמוסט מצוי (Callithrix jacchus) iPSCs. יתר על כן, אנו מתארים בפירוט את טכניקת המיקרו-הזרקה והאלקטרופורציה ומספקים קריטריונים של "ללכת" ו"לא-ללכת" לביצוע אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים של פרימטים. גישה זו היא כלי יעיל לחקר התפתחות הניאו-קורטקס הפיזיולוגי (הפתולוגי) והתפתחותו במודל קרוב במיוחד למצב האנושי.

1. תרבית של פרימטים מושרים

הערה: בשל החוסן שלה, השיטה המוצגת כאן יכולה להיות מיושמת על כל קו iPSC פרימטים. במאמר זה אנו מתארים ייצור אורגנואידים מוחיים מקווי iPSC אנושיים (iLonza2.2)29, שימפנזים (Sandra A)³⁰, מקוק רזוס (iRh33.1)²⁹ ומרמוסט מצוי (cj_160419_5)³¹ קווי iPSC. תנאי התרבות מסוכמים בטבלה 1. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.

1. לטיפוח תאי גזע פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים (iPSC) המתאימים, עקבו אחר תנאי התרבות המתוארים במקור. באופן כללי, ליצירה מוצלחת ואלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים, השתמש בקווי iPSC שלא תורבתו במשך יותר מ -90 מעברים. בנוסף, בתחילת ייצור אורגנואידים מוחיים, יש לוודא כי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מציגים תכונות של פלוריפוטנציה ללא סימני הבחנה.

2. יצירת אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים של פרימטים

הערה: הפרוטוקול ליצירת אורגנואידים מוחיים מבוסס על גרסה שונה 28,30,32,33 של פרוטוקול אורגנואיד מוחי מקורי ^10,34 עם כמה שינויים ספציפיים למין (מפורט להלן).

1. זריעה של iPSCs ליצירת גופים עובריים (EBs)
   1. לאחר שתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הגיעו למפגש של 80%-90%, שטפו אותם במי מלח חוצצי פוספט (DPBS) של Dulbecco, והוסיפו 500 מיקרוליטר של תחליף טריפסין רקומביננטי או 1 מ"ל של תערובת פרוטאוליטית וקולגנוליטית.
      הערה: בדרך כלל, iPSCs מתורבתים בצלחת תרבית תאים 60 מ"מ כדי לקבל כ 900,000 תאים, וזה מספיק כדי לייצר 96 אורגנואידים מוחיים. ניתן להתאים את מספרי התאים בהתאם למספר האורגנואידים הדרושים. שימו לב שלא כל האורגנואידים המוחיים שנוצרו עשויים להתאים להתחשמלות.
   2. לדגור על צלחת ב 37 ° C במשך 2 דקות כדי לנתק את התאים.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך בעד 2 דקות נוספות של דגירה ב-37°C, בהתאם לקו iPSC או לאנזים שבו נעשה שימוש. מומלץ לבחון את התבשיל תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים החלו להתנתק.
   3. הוסף 1.5 מ"ל של מדיום תרבית iPSC שחומם מראש (37 ° C) כדי לעצור את התגובה, ופיפטה למעלה ולמטה 7x-10x (לא יותר מ 10x) כדי לנתק את התאים מצלחת תרבית התא ולקבל תרחיף תא יחיד.
   4. מעבירים את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל, וצנטריפוגות את התאים ב 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. שאפו את הסופר-נטנט, והשעו מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של מדיום תרבית iPSC בתוספת תרכובת תומכת הישרדות של 50 מיקרומטר Y27632 או 50 מיקרומטר.
   6. השתמש ב- 10 μL של תרחיף התא כדי לספור את התאים באמצעות תא נויבאואר.
   7. התאימו את תרחיף התאים לריכוז של 9,000 תאים לכל 150 מיקרוליטר (60,000 תאים/מ"ל) באמצעות תרבית iPSC בתוספת 50 מיקרומטר Y27632 או 50 מיקרומטר תרכובת פרו-הישרדותית.
   8. כדי ליצור גופים עובריים (EBs), זרעו 150 μL של תרחיף התא לתוך כל באר של צלחת חיבור 96 באר נמוכה במיוחד. תוך כדי פיפטינג, נערו בעדינות את הצינור המכיל את תרחיף התא כדי למנוע מהתאים לשקוע.
   9. תרבית את ה- EBs באטמוספירה הוחה של 5% CO₂ ו- 95% אוויר ב- 37 ° C (0 ימים לאחר הזריעה [dps]). אין להפריע ל-EBs במהלך 24 השעות הראשונות לאחר הזריעה.
      הערה: EBs המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במרמוסט צריכים להיות מתורבתים באטמוספירה הוחה בתנאים היפוקסיים (5% CO 2, 5% O 2 ו-90% N ₂) בטמפרטורה של 37°C.
   10. לאחר ~48 שעות (2 dps), שנה את המדיום למדיום תרבית iPSC ללא תרכובת Y27632/pro-survival. מוציאים 100 μL בינוני לכל באר, ומוסיפים 150 μL של מדיום טרי שחומם מראש (37°C) ללא Y27632. עבור שורה אחר שורה.
   11. לבצע שינויים בינוניים נוספים כל יומיים; הסירו 150 מיקרוליטר מדיום מכל באר, והוסיפו 150 מיקרוליטר של מדיום טרי שחומם מראש (37°C) ללא תרכובת Y27632/פרו-הישרדות לכל באר.
       הערה: לאחר 4-5 dps, הפריפריה של EBs צריכה להיות שקופה.
2. אינדוקציה של neuroectoderm
   הערה: באופן כללי, EBs באיכות טובה צריכים להיות בעלי קווי מתאר חלקים וגבולות שקופים בשלב זה. נקודות הזמן של אינדוקציה עצבית שונות מעט בין מיני פרימטים לבין קווי iPSC. במקרה של קווי התאים המשמשים כאן (ראו סעיף 1 וטבלת החומרים), אינדוקציה עצבית עבור EBs מרמוסט בדרך כלל צריכה להתחיל ב-4 dps, עבור rhesus macaque ב-5 dps, ועבור EBs אנושיים ושימפנזים ב-4-5 dps (איור 1A), בהתאם למצב EBs (ראו לעיל).
   1. הסר 150 μL של מדיום מכל באר בשורה הראשונה של לוח 96 הקידוחים, והוסף 150 μL של תווך אינדוקציה עצבית שחומם מראש (37 ° C) (ראה טבלה 2) לכל באר באותה שורה.
   2. המשך לשנות את המדיום כמתואר לעיל שורה אחר שורה עבור כל הלוח בן 96 הקידוחים. בצע שינויים נוספים בתווך אינדוקציה עצבית (NIM) כל יומיים על ידי הסרת 150 μL של NIM מכל באר והוספת 150 μL של NIM טרי שחומם מראש (37 ° C).
      הערה: מנקודה זו ואילך, יש לתרבית את המרמוסטים EBs באותם תנאים כמו הפרימטים EBs האחרים (אטמוספירה הוחה של 5% CO₂ ו-95% אוויר ב-37°C).
3. הטבעה במטריצת קרום מרתף
   הערה: לאחר שה- EBs פיתחו נוירואפיתל בולט, שקוף ומאורגן רדיאלית על פני השטח, יש לספק תמיכה מבנית לפיתוח מבנים דמויי חדרים. זה מושג על ידי הטבעה EBs לתוך מטריצה קרום מרתף. בשל הבדלים בקצב הפיתוח, EBs של מקוק מרמוסט ורזוס מוכנים להטמעה כבר ב- 7 dps, בעוד EBs אנושיים ושימפנזים מוטמעים בדרך כלל ב- 8-9 dps. לשם הפשטות, מטריצת קרום מרתף מתייחסת רק למטריג'ל בפרוטוקול זה. עם זאת, Geltrex יכול לשמש כתחליף.
   1. כהכנה להטמעה, מספריים מעקרים UV, מלקחיים, מתלה קטן עבור צינורות 0.2 מ"ל, ושלושה עד שישה ריבועים של פרפילם מטופלים עם אתנול 70% (vol/vol) מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית במשך 15 דקות. תנו למטריצת קרום המרתף להפשיר על קרח במשך מספר שעות (~ 1.5 מ"ל של מטריצת קרום מרתף מספיקה בדרך כלל ל 96 EBs).
      הערה: שמור תמיד את מטריצת קרום המרתף על קרח.
   2. צור רשת של 4 x 4 גומות על הפרפילם. הניחו את רשת הפרפילם על מדף הצינור בנפח 0.2 מ"ל כך שהצד העטוף בנייר פונה כלפי מעלה, ולחצו בעדינות אצבע בכפפה על כל חור בארון התקשורת.
   3. הסר את הנייר, וחתך את רשת הגומה מתוך ריבוע הפרפילם באמצעות מספריים כדי להתאים את גודלו כך שיתאים לצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ. החזירו את הפרפילם השמוט למדף הצינור בנפח 0.2 מ"ל כדי לספק בסיס ליצירת טיפות מטריצת קרום המרתף.
   4. בעזרת פיפטה עם קצה פיפטה חתוך של 200 מיקרוליטר, מעבירים בזהירות את ה-EBs בזה אחר זה מהבאר של צלחת התרבית לגומות הפרפילם.
   5. לאחר העברת 16 EBs לרשת, קח קצה פיפטה חדש של 200 μL, והסר את התווך שנותר מהגומות.
   6. פיפטה טיפה אחת (~ 15 μL) של מטריצת קרום מרתף על כל גומה המכילה EB אחד.
   7. קח קצה פיפטה של 10 μL והזז במהירות את ה- EBs למרכז כל טיפה מבלי להפריע לגבולות הטיפה.
   8. מניחים את הפרפילם הפצוע עם טיפות מטריצת קרום המרתף בצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ, ודגרים במשך 15-30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר למטריצה להתפלמר.
   9. כדי לנתק את ה-EBs המשובצים במטריצה מהפרפילם, הוסיפו 5 מ"ל של מדיום התמיינות (DM) ללא ויטמין A לצלחת, והפכו את ריבוע הפרפילם הפוך באמצעות מלקחיים, כך שהצד עם ה-EBs פונה לתחתית המנה.
   10. נערו בזהירות את הכלי כדי לגרום לטיפות מטריצת קרום המרתף המכילות את ה- EBs להתנתק מהפרפילם. אם חלקם עדיין מחוברים, קחו קצה של ריבוע הפרפילם באמצעות מלקחיים, וגלגלו אותו במהירות כלפי מעלה לכיוון מרכז המנה מספר פעמים.
   11. תרבית את האורגנואידים המוחיים על שייקר מסלול ב 55 סל"ד באטמוספירה לח של 5% CO₂ ו 95% אוויר ב 37 ° C. שמור אותם DM ללא ויטמין A עם שינויים בינוניים כל יומיים. כדי לגרום לייצור תאי עצב, עברו ל-DM עם ויטמין A (חומצה רטינואית, RA) לאחר 13 dps עבור אורגנואידים מוחיים של מרמוסט ורזוס מקוק, או 14-15 dps עבור אורגנואידים מוחיים אנושיים ושימפנזים (איור 1A). מנקודה זו ואילך, לשנות את המדיום כל 3-4 ימים.
       הערה: כדי לתמוך בהישרדות עצבית, ניתן להוסיף DM עם ויטמין A עם 20 מיקרוגרם/מ"ל נוירוטרופין אנושי 3 (NT3), 20 מיקרוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF), ומטריצת קרום מרתף 1 μL/מ"ל מ-40 dps ואילך.

3. אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים פרימטים

הערה: מנקודת מבט טכנית, אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים יכולה להתבצע ברגע שהמבנים דמויי החדר בולטים מספיק כדי להיות ממוקדים על ידי מיקרו-הזרקה. חלון הזמן האופטימלי להתחשמלות תלוי בשאלה הביולוגית ובאוכלוסיות התאים המעניינות. לדוגמה, אם אבות אפיים (APs) הם המטרה העיקרית, אז אורגנואידים מוחיים בסביבות 30 dps כבר מתאימים. אם אבות בסיסיים (BPs) או נוירונים הם המטרות העיקריות, יש להשתמש באורגנואידים מוחיים ישנים יותר של יותר מ -50 dps (ראה, למשל, Fischer et ^al.28).

1. הכנת מערך האלקטרופורציה
   הערה: יעילות האלקטרופורציה מושפעת מאוד מהגודל והריכוז של הפלסמיד(ים) המחושמלים (ראה פירוט בסעיף הדיון).
   1. הכינו כמות מספקת של תערובת אלקטרופורציה עבור הבקרה וגן העניין (GOI), לדוגמה, 10 מיקרוליטר של תערובת אלקטרופורציה עבור כל בקרה, ו- GOI כדי לחשמל כ -30 אורגנואידים מוחיים לכל מצב.
      הערה: להרכב תערובות האלקטרופורציה, ראה טבלה 3.
   2. Prewarm (לא סטרילי) תערובת Dulbecco מדיום/מזין של Dulbecco F-12 (DMEM/F12) ו-DM עם ויטמין A עד 37°C. הכינו מרית קטנה ומספריים עדינים ורגילים, ורססו את המכשירים באתנול 70% (vol/vol).
      הערה: ניתן לבצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים או לא סטריליים מכיוון שה- DM מכיל אנטיביוטיקה (ראה טבלה 2). מניסיוננו, היעדר סטריליות מעולם לא גרם לזיהום כלשהו.
   3. הכינו צלחות תרבית תאים בקוטר 35 מ"מ, וחברו את תא אלקטרודות צלחת הפטרי לאלקטרופורטור.
      הערה: תאי אלקטרודות צלחת פטרי זמינים באופן מסחרי. עם זאת, ניתן לייצר אותם בקלות בצורה חסכונית (ראה קובץ משלים 1).
   4. באמצעות קצוות microloader, למלא מחטי microinjection עם 8 μL של כל תערובת electroporation. חותכים את קצות המחטים באמצעות מספריים עדינים לפני השימוש הראשון כדי להשיג זרימה יציבה. עם זאת, הסירו רק חלק קטן מהקצה, שכן קצה קהה ורחב עלול לפגוע קשות באורגנואידים.
      הערה: מחטי מיקרו-הזרקה זמינות מסחרית כמחטי מיקרו-הזרקה שנמשכו מראש או שניתן למשוך אותן במעבדה אם מושך מחטים זמין. עקוב אחר הוראות יצרן מושך המחטים כדי ליצור מחטי מיקרו-הזרקה עם טייפר ארוך וקוטר קצה של 10 מיקרומטר.
2. מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה
   1. תחת מיקרוסקופ, בחר חמישה אורגנואידים מוחיים עם גבולות חלקים ומבנים דמויי חדרים נראים בבירור. העבירו אותם לצלחת תרבית תאים בקוטר 35 מ"מ המכילה DMEM/F12 שחומם מראש (37°C) באמצעות קצה פיפטה חתוך של 1,000 מיקרוליטר.
      הערה: בחרו אורגנואידים מוחיים עם מבנים בולטים ונגישים דמויי חדרים (ראו איור 1B).
   2. כדי להזריק מבנה דמוי חדר, הכנס בזהירות את המחט דרך הדופן שלו, ולהחדיר אותו עם תערובת אלקטרופורציה עד למילוי גלוי. אין להפעיל לחץ מוגזם על מבנים דמויי חדרים כדי למנוע מהם להתפוצץ. המשך עם שישה עד שמונה מבנים דמויי חדרים של כל אורגנואיד מוחי באופן זה.
      הערה: אם המחט נסתמת במהלך תהליך המיקרו-הזרקה, יש לחתוך מעט את הקצה.
   3. העבר אורגנואיד מוחי אחד מוזרק מיקרו לתא אלקטרודת צלחת פטרי עם כמות קטנה של DMEM/F12. סדרו את האורגנואיד כך שהמשטחים של המבנים דמויי החדרים המוזרקים פונים לכיוון האלקטרודה המחוברת לקוטב החיובי של האלקטרופורטור.
      הערה: כיוון המבנים בדרך זו מבטיח שהתאים יהיו נגועים בצד המבנה דמוי החדר שאינו מושפע ממבנה סמוך.
   4. אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים אחד אחד באמצעות ההגדרות הבאות: 5 פולסים של 80 V, משך פעימה של 50 ms, ומרווח של 1 s. העבירו את האורגנואידים המחושלים לצלחת תרבית תאים חדשה בקוטר 35 מ"מ מלאה ב-DMEM/F12 שחומם מראש (37°C).
      הערה: הגדרות האלקטרופורציה עשויות להיות תלויות באלקטרופורטור הגל הריבועי הזמין. הגדרות אלה ממוטבות עבור מערכת האלקטרופורציה המוזכרת. הגדלת המתח יכולה להוביל לעקירה של התאים.
   5. המשך באותו אופן עם חמשת האורגנואידים המוחיים הבאים באמצעות תערובת האלקטרופורציה השנייה (לדוגמה, GOI).
      הערה: חזור על שלבים 3.2.1-3.2.5 עד שתגיע למספר הרצוי של אורגנואידים מוחיים מחושמלים.
   6. אם המיקרו-הזרקה והאלקטרופורציה בוצעו בתנאים לא סטריליים, העבירו את האורגנואידים המחושמלים לצלחת תרבית תאים סטרילית בקוטר 35 מ"מ מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית תוך העברת כמה שפחות DMEM/F12 לצלחת תרבית התאים החדשה.
3. תרבות נוספת וקיבוע של אורגנואידים מוחיים
   1. תרבית את האורגנואידים המחושמלים ב-DM עם ויטמין A על שייקר אורביטלי ב-55 סל"ד באטמוספירה הוחה של 5% CO₂ ו-95% אוויר ב-37°C.
   2. למחרת לאחר ההתחשמלות, בדוק את האורגנואידים המוחיים לאלקטרופורציה מוצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך קונבנציונלי.
      הערה: בהתאם לאורך התרבית הנוספת לאחר אלקטרופורציה, אוכלוסיות תאים שונות בתוך אורגנואיד המוח מושפעות (ראה גם את סעיף התוצאות המייצגות).
   3. המשך עם יישומים במורד הזרם לאחר גידול אורגנואידים מוחיים electroporated למשך פרק זמן המתאים לשאלה הביולוגית של עניין.
      הערה: אורגנואידים מוחיים אלקטרופורציה יכולים להיות מעובדים עבור יישומים שונים במורד הזרם (למשל, קיבוע עבור צביעה immunofluorescence או הקפאה snap-frozen עבור בידוד RNA ו qRT-PCR). כאן, אנו מתארים את הקיבוע של אורגנואידים מוחיים electroporated .
   4. מעבירים את האורגנואידים המחושלים לצינור צנטריפוגה חרוטי בנפח 15 מ"ל באמצעות קצה פיפטה חתוך של 1,000 מיקרוליטר, ומסירים עודפי תווך.
   5. הוסיפו כמות מספקת של 4% פרפורמאלדהיד (PFA) ב-DPBS (pH 7.5), ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
      אזהרה: PFA מסווג כמסרטן בבני אדם ועלול לגרום לנזק בריאותי בלתי הפיך. אמצעי זהירות נוספים, כולל כפפות ניטריל ומשקפי מגן, מומלצים בחום.
   6. לשאוף את PFA, להוסיף 5 מ"ל של DPBS, לנער קצת, ולשאוף את DPBS. חזור על פעולה זו 2x. אחסנו את האורגנואידים ב-DPBS בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, מכיוון שניתן לאחסן אורגנואידים מוחיים קבועים ב- 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. ניתן לנתח אורגנואידים אלקטרופורטים קבועים בתקן PFA על ידי הקפאה וצביעה אימונופלואורסצנטית^10,28 או על ידי צביעה וניקוי^35,36 בהרכבה שלמה. לדוגמה תמונות, עיין בסעיף תוצאות מייצגות (ראה טבלה 4 לפירוט נוגדנים).

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר יצירה יעילה של אורגנואידים מוחיים מקווי iPSC אנושיים, שימפנזים, רזוס מקוק ומרמוסט מצוי עם שינויי תזמון מינימליים הנדרשים בין מינים שונים (איור 1A). אורגנואידים אלה יכולים להתחשמל בטווח של 20 dps עד 50 dps, בהתאם לנגישות של מבנים דמויי חדרים ואת שפע של אוכלוסיות התא (ים) של עניין. עם זאת, לפני אלקטרופורציה, חשוב לקבוע אם אורגנואידים מוחיים הם באיכות מספקת כדי להיות electroporated.

אורגנואיד מוחי אידיאלי לאלקטרופורציה צריך להציג מבנים בולטים דמויי חדרים בהירים בפריפריה, ללא סימני ניוון (למשל, ניתוק תאים, ליבה אפופטוטית מוגדלת), ומורפולוגיה בריאה קומפקטית בדרך כלל (למשל, ללא צמיחה מוגזמת) (איור 1B, "Go"). עדיף לבחור אורגנואידים מוחיים עם מבנים גדולים, מאורגנים היטב, דמויי חדרים כדי להתמקד במספר גבוה יותר של תאים. אם האזור ההיקפי של אורגנואיד חשוך ואינו מראה מבנים בולטים, מומלץ לא להשתמש בו להתחשמלות, מאחר שהמיקרו-הזרקות המדויקות עלולות להיפגע על-ידי היעדר רמזים חזותיים (איור 1B, "No-go"). כדי להשיג מורפולוגיה אופטימלית של אורגנואיד מוחי, חיוני להבטיח כי צעדים קריטיים כגון השראת נוירואקטודרם והטבעה מטריצה מתוזמנים היטב. בעיות הנוגעות למורפולוגיה של אורגנואידים מוחיים נובעות בדרך כלל מהיווצרות נוירואקטודרם כושל ו / או היווצרות ניצנים נוירואפיתליאליים. זה נגרם בדרך כלל על ידי תזמון לא אופטימלי של האינדוקציה העצבית ו / או הטבעה של מטריצת קרום המרתף וניתן לפתור על ידי התאמת העיתוי של שלבים אלה (טיפים נוספים לפתרון בעיות עבור היווצרות אורגנואידים מוחיים ניתן למצוא בלנקסטר ו Knoblich34).

לאחר אלקטרופורציה, הערכה ראשונה של הצלחתה ויעילותה יכולה להתבצע לאחר 12 שעות, כאשר ביטוי GFP של התאים הנגועים הופך לגילוי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך קונבנציונאלי. באופן אידיאלי, בשלב זה, מבנים דמויי חדרים מרובים פולטים פלואורסצנטיות ירוקה בהירה הממוקמת באחד הצדדים שלהם (איור 2A). זה מצביע על דיוק גבוה ויעילות של ההליך. אורגנואידים מוחיים שהתחשמלו בהצלחה של ארבעת מיני הפרימטים השונים (כלומר, אדם, שימפנזים, מקוק רזוס ומרמוסט מצוי) מראים דפוסים חיוביים דומים של GFP בתוך מבנים דמויי חדרים ממוקדים (איור 2A). יתר על כן, לאחר הקיבוע וההקפאה של אורגנואידים מוחיים של פרימטים מחושמלים, מבנים דמויי חדרים מחושמלים בהצלחה של כל ארבעת המינים מציגים עמודות של תאים חיוביים ל-GFP בתוך אזור החדרים המאורגן רדיאלית והצפוף (VZ) (איור 2B). הכימות של התאים החיוביים ל-DAPI שהיו חיוביים ל-GFP גם באזורים כאלה של אורגנואידים מוחיים של שימפנזה ומרמוסט יומיים לאחר האלקטרופורציה (17 חדרים מ-12 אורגנואידים כומתים) הראה כי בממוצע, כשליש מהתאים (33%, SD ±-12%) התחשמלו בהצלחה.

אלקטרופורציות תת-אופטימליות מסומנות על-ידי מספר קטן של תאים חיוביים ל-GFP בתוך המבנה דמוי החדר (איור 3A) או על-ידי כמה תאים חיוביים ל-GFP הרחוקים מכל מבנה דמוי חדר (איור 3B). מספר נמוך של תאים חיוביים ל-GFP נגרם על ידי ספיגת פלסמיד ירודה. זה יכול להיות בגלל ריכוז פלסמיד נמוך שנגרם על ידי כמות לא מספקת של תערובת אלקטרופורציה מיקרו-מוזרקת או בגלל פולסים חשמליים שאינם מכוונים היטב, אשר עשויים להיגרם על ידי מיקום לא אופטימלי של אורגנואידים מוחיים בתא אלקטרודות צלחת פטרי. מספר נמוך של תאים חיוביים ל-GFP המרוחקים מכל מבנה דמוי חדר נגרם על ידי אלקטרופורציה של תאים פוסט-מיטוטיים בתוך אורגנואיד המוח (למשל, נוירונים) עקב מיקרו-הזרקה לא מדויקת. אלקטרופורציות תת-אופטימליות אלה צריכות להיכלל בכל ניתוח נוסף.

הזיהוי האמין של סוגי התאים הקיימים באורגנואידים מוחיים מתבסס, בין היתר, על מיקום התא בתוך מבנה דמוי חדר, הדורש הגדרת גבול בין VZ לאזור מועשר בנוירונים. ניתן לזהות גבול זה על ידי הארגון הרדיאלי ומאפייני צפיפות גרעיני התא הגבוהה של VZ (ראו צביעת DAPI באיור משלים S1). אישור גבול VZ/SVZ יכול להתבצע על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית עבור סמני אב עצביים כגון PAX6 או SOX2, אשר מבוטאים כמעט על ידי כל תאי VZ (APs) וכמה תאי SVZ (BPs). נוכחות של אזור מועשר בתאי עצב יכולה להיות מאומתת על-ידי צביעה אימונופלואורסצנטית עבור סמנים עצביים כגון סוג III β-טובולין (TUJ1) או NeuN (איור משלים S1).

משך תרבית אורגנואידים מוחית לאחר אלקטרופורציה תלוי בשאלה הביולוגית ובאוכלוסיות התאים המעניינות. במחקר שנערך לאחרונה הוכח כי אורכים שונים של תרבית נוספת לאחר אלקטרופורציה משפיעים על אוכלוסיות תאים שונות באורגנואידים מוחיים של שימפנזים, החל מ-APs ועד נוירונים בשכבה העליונה24. כאן, אנו מראים תוצאות דומות עבור אורגנואידים מרמוסט מחושמלים. באופן ספציפי, יומיים לאחר ההתחשמלות, תאים חיוביים ל-GFP ממוקמים כמעט אך ורק ב-VZ, והם חיוביים גם עבור PAX6 – סמן עבור תאי אב עצביים – מה שמצביע על כך שהתאים האלה הם APs או BPs של יילודים (איור 4A). אם תקופת התרבית לאחר אלקטרופורציה מוארכת ל-10 ימים, אז תאים חיוביים ל-GFP ממוקמים באזורים הבסיסיים (כלומר, SVZ ואזור מועשר בנוירונים) (איור 4B,C). התאים האלה יכולים (בנוסף לאות GFP) להיות חיוביים גם עבור PAX6 (איור 4B), שמעיד על BPs, או NeuN (איור 4C), שמעיד על תאי עצב. תוצאות דומות ניתן להשיג עבור אורגנואידים מוחיים מקוק מקוק אנושי ורזוס. לסיכום, סוגים שונים של אבות, כמו גם נוירונים, יכולים להיות ממוקדים בהצלחה על ידי טכניקה זו.

כמעט כל הנתונים שהוצגו בעבר נגזרו מ-immunostaining של קטעים היסטולוגיים שנוצרו מאורגנואידים מוחיים מחושמלים. עם זאת, דרך אלגנטית נוספת לנתח אורגנואידים אלה היא לבצע immunostaining כל mount ואחריו ניקוי אופטי35,36. זה יאפשר שחזור תלת-ממדי של אורגנואידים מוחיים מחושמלים כדי לקבל התרשמות מההתפלגות התלת-ממדית של התאים החיוביים ל-GFP. איור 5 ווידאו 1 מראים דוגמה מייצגת של אות GFP באורגנואיד מוחי מחושמל שעבר ניקוי אופטי.

לסיכום, פרוטוקול האלקטרופורציה המתואר כאן מספק דרך מדויקת ויעילה להחדיר שינויים גנטיים חולפים לסוגי אבות שונים ולנוירונים של אורגנואידים מוחיים שמקורם בקווי iPSC שונים של פרימטים.

איור 1: סקירה סכמטית של יצירת אורגנואידים מוחיים של פרימטים וקריטריונים מורפולוגיים של "ללכת" ו"לא ללכת" עבור אלקטרופורציה. (A) ציר הזמן של יצירת אורגנואידים מוחיים של פרימטים ואלקטרופורציה המדגיש את התזמונים השונים של שלבי הפרוטוקול עבור בני אדם ושימפנזים (כחול), מקוק רזוס (סגול) ומרמוסט (מגנטה). שים לב שהכרונולוגיה של ציר הזמן אינה בקנה מידה. (B) תמונות Brightfield של אורגנואיד מוחי אנושי מתאים (תמונה שמאלית, Go) ולא מתאים (תמונה ימנית, No-go) 32 dps. ראשי החץ מצביעים על דוגמאות למבנים דמויי חדרים מתאימים למיקרו-הזרקה. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך Zeiss Axio Observer.Z1 עם מטרה של פי 2.5. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר. קיצורים: BDNF = גורם נוירוטרופי שמקורו במוח; DPS = ימים לאחר הזריעה; NT3 = נוירוטרופין 3; RA = חומצה רטינואית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דוגמאות לאורגנואידים מוחיים של פרימטים שהתחשמלו בהצלחה . (A) ברייטפילד (עמודה שמאלית), פלואורסצנטיות (עמודה אמצעית) ומיזוג תמונות (עמודה ימנית) של 22 DPS אנושיים, 32 DPS שימפנזה, 32 DPS Rhesus macaque ו-31 DPS Marmoset אורגנואידים מוחיים (מלמעלה למטה) 15-48 שעות לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP. ראשי החץ השחורים מצביעים על דוגמאות למבנים בודדים דמויי חדרים מחושמלים. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך Zeiss Axio Observer.Z1 עם מטרה של פי 2.5. מוטות קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) אימונופלואורסנציה עבור GFP (ירוק) בשילוב עם צביעת DAPI (ציאן) של 32 dps אדם, 34 dps שימפנזה, 32 dps rhesus macaque, ו 32 dps marmoset אורגנואידים מוחיים (מלמעלה למטה) 2-4 ימים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP. ראשי החץ האפורים בהירים מציינים את גבולות האזורים המתחשמלים בתוך המבנים דמויי החדרים. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 800 עם מטרה של פי 10. מוטות קנה מידה = 150 מיקרומטר. קיצורים: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; DPS = ימים לאחר הזריעה; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: דוגמאות לאורגנואידים מוחיים של פרימטים שהתחשמלו ללא הצלחה. (A,B) Immunofluorescence for GFP (ירוק) בשילוב עם צביעת DAPI (ציאן) של אורגנואיד מוחי (A) rhesus macaque cerebral organoid 4 ימים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP ושל (B) אורגנואיד מוחי rhesus macaque 32 dps יומיים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP. ראשי החץ האפורים בהירים מצביעים על תאים מחושמלים. קו המתאר המקווקו בצבע אפור בהיר מציין את הגבול בין אזור VZ לאזור SVZ/מועשר בנוירונים של מבנה דמוי חדר הסמוך לתאים המתחשמלים. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 800 עם מטרה של פי 10. מוטות קנה מידה = 150 מיקרומטר. קיצורים: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; DPS = ימים לאחר הזריעה; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; SVZ = אזור תת-חדרי; VZ = אזור החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הדמיה של אוכלוסיות תאים שונות הקיימות באורגנואידים מוחיים של פרימטים לאחר התחשמלות. (א-ג) אימונופלואורסנציה כפולה עבור GFP (ירוק) ו- PAX6 (A,B; מגנטה) או NeuN (C; מגנטה), בכל המקרים בשילוב עם צביעת DAPI (ציאן), של אורגנואיד מוחי מרמוסט (A) 32 dps marmoset 2 ימים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP, ו- (B,C) של אורגנואיד מוחי מרמוסט 40 dps 10 ימים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP. ראשי החץ בצבע אפור בהיר מציינים (A,B) תאים חיוביים כפולים מסוג GFP+ ו-PAX6+ או (C) NeuN+ . הקווים המקווקווים האפורים-בהירים מציינים את הגבול בין VZ לאזור מועשר ב-SVZ/נוירונים. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 800 עם מטרה של פי 20. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; DPS = ימים לאחר הזריעה; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; NeuN = חלבון גרעינים עצבי; PAX6 = קופסה 6 חלבון; SVZ = אזור תת-חדרי; VZ = אזור החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: שחזור תלת-ממדי של תמונות מחושמלות באמצעות הדמיה קונפוקלית תלת-ממדית של אורגנואידים מוחיים של פרימטים מפוצלים לאחר ניקוי אופטי. מבט חזיתי (תמונה שמאלית), 45° מסובב (תמונה אמצעית) ו-90° מסובב (תמונה ימנית) של אורגנואיד מוחי אנושי משוחזר תלת-ממדי 32 dps יומיים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP. לפני ההדמיה, האורגנואיד נוקה אופטית על בסיס שיטת 2Eci35. שחזור תלת-ממדי של אורגנואיד מחושמל שלם נוצר מ-269 מקטעים אופטיים (עובי של 1 מיקרומטר כל אחד) הנמצאים במרחק של 3.73 מיקרומטר זה מזה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 800 עם מטרה של פי 10. התמונות עובדו לשחזור תלת ממדי באמצעות פיג'י. שים לב שהתמונות נלקחו מאותו אורגנואיד משוחזר בתלת-ממד המוצג בסרטון 1. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. קיצור: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: אורגנואיד מוחי אנושי משוחזר בתלת-ממד לאחר ניקוי אופטי. וידאו של אורגנואיד מוחי אנושי 32 dps משוחזר בתלת-ממד יומיים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP. לפני ההדמיה, האורגנואיד נוקה אופטית על בסיס שיטת 2Eci35. שחזור תלת-ממדי של אורגנואיד מחושמל שלם נוצר מ-269 מקטעים אופטיים (עובי של 1 מיקרומטר כל אחד) הנמצאים במרחק של 3.73 מיקרומטר זה מזה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 800 עם מטרה של פי 10. התמונות עובדו לשחזור תלת ממדי באמצעות פיג'י. שימו לב שהסרטון נלקח מאותו אורגנואיד משוחזר בתלת-ממד שמוצג באיור 5. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

טבלה 1: תנאי התרבות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים המשמשים בפרסום זה. קיצור: iPSCs = תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים.

טבלה 2: הרכב המדיה המשמשת ליצירת אורגנואידים מוחיים של פרימטים ולתרבית.

טבלה 3: הרכב תערובת האלקטרופורציה (גישת פלסמידים נפרדת) לבקרה ולגן המעניין. קיצור: GOI = גן של עניין.

טבלה 4: נוגדנים המשמשים לצביעת אימונופלואורסצנטיות.

איור משלים S1: קביעת גבול VZ/SVZ באורגנואידים מוחיים של פרימטים מחושמלים. אימונופלואורסנציה כפולה עבור PAX6 (מגנטה) ו-TUJ1 (צהוב) בשילוב עם צביעת DAPI (ציאן) של אורגנואיד מוחי מרמוסט 32 dps יומיים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP. האימונופלואורסנציה עבור GFP אינה מוצגת. הקווים המקווקווים האפורים-בהירים מציינים את הגבול בין VZ לאזור מועשר ב-SVZ/נוירונים. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 800 עם מטרה של פי 20. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; DPS = ימים לאחר הזריעה; PAX6 = קופסה 6 חלבון; SVZ = אזור תת-חדרי; TUJ1 = מחלקה III β-טובולין; VZ = אזור החדר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: הוראות הרכבת תא אלקטרופורציה של צלחת פטרי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.