Method Article

בדיקת כדאיות של Trichoderma stromaticum conidia בתוך מקרופאגים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי

DOI:

10.3791/65231

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכניקה המערבת פאגוציטוזה של קונידיה פטרייתית על ידי מקרופאגים נמצאת בשימוש נרחב למחקרים המעריכים את אפנון התגובה החיסונית נגד פטריות. מטרת כתב היד היא להציג שיטה להערכת יכולות הפאגוציטוזה והפינוי של מקרופאגים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי המגורות באמצעות Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקרופאגים מהווים קו הגנה חיוני ואחראים למניעת גדילה והתיישבות של פתוגנים ברקמות שונות. פגוציטוזה קונידיאלית היא תהליך מפתח המאפשר לחקור את האירועים הציטופלזמיים והמולקולריים המעורבים באינטראקציות מקרופאגים-פתוגנים, כמו גם לקביעת זמן המוות של קונידיה מופנמת. הטכניקה המערבת פאגוציטוזה של קונידיה פטרייתית על ידי מקרופאגים נמצאת בשימוש נרחב למחקרים המעריכים את אפנון התגובה החיסונית נגד פטריות. התחמקות מפאגוציטוזה ובריחה של פגוזומים הם מנגנונים של אלימות פטרייתית. כאן, אנו מדווחים על השיטות שניתן להשתמש בהן לניתוח של phagocytosis, סליקה, ואת הכדאיות של T. stromaticum conidia, פטרייה אשר משמש biocontrol ו biofertilizer סוכן והוא מסוגל לגרום זיהומים אנושיים. הפרוטוקול מורכב מ-1) תרבית טריכודרמה (Trichoderma ), 2) שטיפה להשגת קונידיה (conidia), 3) בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) בשיטת תמיסת רב-סוכרוז והתמיינות ה-PBMCs למקרופאגים, 4) שיטת פאגוציטוזה חוץ-גופית באמצעות כיסויי זכוכית עגולים וצבע, ו-5) בדיקת פינוי להערכת הכדאיות של הקונידיה לאחר פגוציטוזה של קונידיה. לסיכום, ניתן להשתמש בטכניקות אלה כדי למדוד את יעילות פינוי הפטריות של מקרופאגים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סוג טריכודרמה (סדר: Hypocreales, משפחה: Hypocreaceae) מורכב מפטריות ספרופיטיות הנמצאות בכל מקום, שהן טפילים של מיני פטריות אחרים ומסוגלות לייצר מגוון אנזימים שימושיים מסחרית1. מיני פטריות אלה משמשים לייצור חלבונים הטרולוגיים2, לייצור תאית3, אתנול, בירה, יין ונייר4, בתעשיית הטקסטיל5, בתעשיית המזון6, ובחקלאות כסוכני הדברה ביולוגית 7,8. בנוסף להתעניינות התעשייתית במינים פטרייתיים אלה, המספר ההולך וגדל של זיהומים בבני אדם העניק לחלק ממיני הטריכודרמה מעמד של פתוגנים אופורטוניסטיים9.

Trichoderma spp. גדלים במהירות בתרבות, עם מושבות לבנות וכותנות בתחילה שהופכות צהוב ירקרק לירוק כהה10. הם מותאמים לחיות במגוון רחב של תנאי pH וטמפרטורה, והמינים האופורטוניסטיים מסוגלים לשרוד ב- pH פיזיולוגי ובטמפרטורות ובכך ליישב רקמות אנושיות שונות 11,12,13. חשוב לציין, העלייה בשיעור הזיהום של Trichoderma spp. עשויה להיות קשורה לגורמי אלימות, ואלה אינם נחקרים היטב. בנוסף, מחקרים המתמקדים בהבנת התגובה החיסונית נגד מיני טריכודרמה אופורטוניסטיים הם עדיין נדירים.

במהלך זיהום, יחד עם נויטרופילים, מקרופאגים מייצגים את קו ההגנה האחראי לפאגוציטוזה, ובכך מונעים צמיחה והתיישבות של פתוגנים ברקמות שונות. באמצעות שימוש בקולטנים לזיהוי דפוסים, כגון קולטנים דמויי טול וקולטני לקטין מסוג C, פטריות פאגוציטוזה של מקרופאגים ועיבודן לפגוליזוזומים, ובכך קידום התפרצות נשימתית, שחרור ציטוקינים מעודדי דלקת והרס מיקרואורגניזמים פגוציטוזים14. מנגנון הפאגוציטוזה, לעומת זאת, יכול להיות מושפע ולהתחמק על ידי אסטרטגיות מיקרוביאליות שונות, כגון גודל וצורה של תאים פטרייתיים; נוכחות של כמוסות המעכבות phagocytosis; הפחתת מספר הקולטנים הגורמים לפאגוציטוזה; שיפוץ המבנה של סיבי אקטין בציטופלסמה; מעכב את היווצרות pseudopodia; ופאגוזום או פאגוליזוזום בורחים לאחר תהליך הפאגוציטוזה14.

פתוגנים רבים, כולל Cryptococcus neoformans, משתמשים במקרופאגים כנישה לשרוד בפונדקאי, להפיץ ולגרום לזיהום15. בדיקת הפאגוציטוזה והפינוי משמשת להערכת התגובה החיסונית נגד פתוגנים ולזיהוי האסטרטגיות המיקרוביאליות המשמשות להתחמקות ממערכת החיסון המולדת 15,16,17. סוג זה של טכניקה יכול לשמש גם כדי לבחון את הקינטיקה הדיפרנציאלית של phagocytosis, החמצה מאוחרת phagosome, פרץ חמצוני שתוצאתם הרג פטרייתי מופחת18.

ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי להעריך פגוציטוזה, הישרדות פטרייתית והתחמקות מתהליך ההבשלה של הפאגוזומים. אלה כוללים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המשמשת לצפייה בפאגוציטוזה, במיקום התא ובמולקולות המיוצרות במהלך פגוציטוזה19; ציטומטריית זרימה, המספקת נתונים כמותיים על פגוציטוזה ומשמשת להערכת הסמנים השונים המעורבים בתהליך20,21; מיקרוסקופיה תוך חיונית, המשמשת להערכת לכידת חיידקים והבשלת פגוזום22; פגוציטוזה בתיווך נוגדנים, המשמשת להערכת הספציפיות של תהליך הפאגוציטוזה עבור פתוגן23; ואחרים 24,25,26,27.

הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בשיטה נפוצה, זולה וישירה באמצעות מיקרוסקופ אופטי ובדיקת צמיחת לוחות כדי להעריך את הפאגוציטוזה וההרג של קונידיה פטרייתית. פרוטוקול זה יספק לקוראים הוראות שלב אחר שלב לביצוע בדיקת פאגוציטוזה וסילוק באמצעות מקרופאגים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי שנחשפו ל- T. stromaticum. PBMCs שימשו מכיוון ש - Trichoderma conidia מיושמים כהדברה ביולוגית נגד פיטופתוגנים ודשן ביולוגי לגידולי צמחים ברחבי העולם וגרמו למספר זיהומים בבני אדם, הנקראים Trichodermosis. מלבד זאת, יש רק שתי עבודות קודמות המתמקדות באינטראקציה בין Trichoderma conidia לבין מערכת החיסון האנושית, שבהן בחנו נויטרופילים28 ואוטופגיה במקרופאגים29. מאמר זה מראה תחילה כיצד ניתן לחקור את הפאגוציטוזה של הקונידיה של T. stromaticum על ידי מקרופאגים שמקורם ב-PBMC, ולאחר מכן כיצד ניתן להעריך את הכדאיות של הקונידיה הנבלעת באמצעות טכניקות פשוטות המבוססות על מיקרוסקופיה. פרוטוקול זה עשוי להקל עוד יותר על חקירות של תגובה חיסונית הקשורה למקרופאגים או מנגנונים הקשורים לאפנון מערכת החיסון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיקולים אתיים ונושאים אנושיים
כל הניסויים בבני אדם המתוארים במחקר זה נערכו על פי הצהרת הלסינקי והחוקים הפדרליים של ברזיל ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת המדינה של סנטה קרוז (קוד זיהוי הפרויקט: 550.382/ 2014).

דם היקפי אנושי נאסף ממתנדבים בריאים מהעיר איליאוס בבאהיה, ברזיל, שלא נחשפו לפעילות תעסוקתית הקשורה לפטרייה הנחקרת. אנשים עם מצב בריאותי רפואי מדווח או שימוש בתרופות לא נכללו. כל הנבדקים הסכימו מרצונם להשתתף וחתמו על טופס הסכמה מדעת לפני הכללתם במחקר זה.

1. הכנת ריאגנטים ופתרונות

הערה: הכן את הריאגנטים והפתרונות הבאים לפני שתמשיך. עיין בטבלת החומרים (TOM) לקבלת מידע על מגיב וספק חומרים.

  1. הכינו תמיסת מלח סטרילית מאוזן חוצצת פוספט 1x (PBS).
    הערה: בפרוטוקול זה, PBS ללא אנדוטוקסין לא היה בשימוש.
  2. הכינו אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA) בינוני, ומזגו 20 מ"ל לכל צלחת פטרי לתרבית T. stromaticum . הכינו שש צלחות עם מחשב כף יד לכל תורם, והשתמשו בצלחת אחת לכל מצב: 3 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות ו-120 שעות. בנוסף, השתמש בשלושה לוחות עבור כל בקרה: שלושה עבור בקרת Trichoderma ושלושה עבור הבקרה הבינונית R10. השתמש בצלחות פטרי של 60 מ"מ x 15 מ"מ או 100 מ"מ x 15 מ"מ להתאוששות קונידיה אופטימלית.
  3. לעקר 100% גליצרול.
  4. הכינו מדיום R10 לתרבית התא: מדיום RPMI בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% אנטיביוטיקה (פניצילין/סטרפטומיצין).
  5. לעקר מים מזוקקים עבור ליזה התא.
  6. הכינו מים ב-pH 7.0 לתהליך הצביעה.
    הערה: במידת הצורך, כוונן את ה- pH באמצעות מד pH ותמיסות של 0.1 M/L NaOH ו- 0.1 M/L HCl.
  7. יש לעקר כיסויי זכוכית עגולים (13 מ"מ) ופינצטה.

2. תרבית ועיבוד Trichoderma stromaticum

  1. הכנת ציר אם (M1) של T. stromaticum:
    הערה: מלאי אם (M1) נדרש כדי להבטיח שכל הניסויים נעשים מהתרבות של אותו דור טרי (F1).
    1. גידלו T . stromaticum inoculum בצלחות פטרי עם מחשב כף יד בטמפרטורה של 28°C בחושך במשך 7-10 ימים עד שהקונידיה נצפית והתרבית הופכת לירוקה.
    2. לשטוף את התרבות של T. stromaticum. הוסף 3-5 מ"ל של PBS למשטח התרבית באמצעות פיפטה. אספו את PBS מהצלחת, ושוב הניחו אותו על התרבית כדי להסיר בהדרגה את הקונידיה באמצעות הפיפטה. חזור על תהליך זה ככל שיידרש עד שהמתלה הופך לירוק כהה.
      הערה: לחלופין, מומלץ לשטוף בעדינות את התרבית על ידי הוספת 3-5 מ"ל PBS לצלחת ולאחר מכן לבצע תנועה מעגלית עד שהמתלה הופך לירוק כדי לשחזר את הקונידיה. עם פיפטינג חוזר, ניתן לאסוף יותר קונידיה.
    3. מעבירים את המתלה המשוחזר מהצלחת לצינור סטרילי של 15 מ"ל עם פיפטה. חזור על שלבים 2.1.2-2.1.3 כמה פעמים שצריך כדי להשיג יותר conidia.
    4. צנטריפוגו את המתלים ב 1,160 x גרם למשך 5 דקות ב 12 ° C, והשהה מחדש את הגלולה ב 5 מ"ל של PBS. חזור על שלב זה (2.1.4) שלוש פעמים כדי לקבל השעיה ללא קורים.
      הערה: כדי להשהות מחדש את הגלולה כראוי, לאחר צנטריפוגה, מומלץ מערבולות קצרות.
    5. יש להשהות מחדש את הגלולה האחרונה ב-2-3 מ"ל של PBS, ולספור את הקונידיה בתא נויבאואר באמצעות דילול של 1:100 או 1:1,000.
      הערה: בתנאים אופטימליים, ניתן לשחזר ריכוז סופי של 2 x 108 conidia/mL מהתרבית. הערכת הכדאיות של הקונידיה באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן היא אופציונלית.
    6. Aliquot את המתלה לתוך צינורות סטריליים 1.5 מ"ל על ידי הוספת 0.5 מ"ל של מתלה conidia (משלב 2.1.5) לכל צינור. לאחר מכן, הוסף 0.5 מ"ל של גליצרול סטרילי 100% כדי להשיג מניות M1. מערבולות קצרות, לזהות את הצינורות, ולאחסן ב -20 ° C או -80 ° C.
  2. תרבית של T. stromaticum והשגת conidia עבור הניסוי
    1. צלחת 10 μL של מתלה M1 (מוכן בשלב 2.1) ב- PDA ב 28 ° C בחושך במשך 7-10 ימים עד שהקונידיה נצפית והתרבות הופכת לירוקה כדי לקבל את דור F1 הטרי.
      הערה: כדי להבטיח תרבית T . stromaticum טרייה לניסוי, הערך את הזמן הדרוש לצמיחת פטרייה ואת הזמן הדרוש להתמיינות מקרופאגים.
    2. אסוף את הקונידיה, חזור על שלבים 2.1.2-2.1.4.
    3. השהה מחדש את הגלולה הסופית ב 2-3 מ"ל של PBS. הערך את כדאיות הקונידיה באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן, או ספור את הקונידיה כפי שהוזכר בשלב 2.1.5.

3. בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMC)

הערה: PBMCs מתקבלים בשיטת מחסום צפיפות באמצעות תמיסה polysucrose של צפיפות 1.077 גרם / מ"ל30.

  1. Aliquot 15 מ"ל של תמיסת פוליסוקרוז לצינור אחד של 50 מ"ל עבור כל דגימת תורם שתיאסף.
  2. לאסוף 20 מ"ל של דם מכל תורם באמצעות שלושה עד ארבעה צינורות EDTA. גייסו לפחות ארבעה תורמים בכל ניסוי. אין לצרף את דמם של התורמים; במקום זאת, השתמשו בכל דגימה בנפרד כשכפול ביולוגי. עבור כל תורם, להעביר את הדם לצינור אחד 50 מ"ל, ולהוסיף PBS כדי לקבל נפח סופי של 35 מ"ל.
  3. העבירו את תרחיף הדם (שלב 3.2) באיטיות לאורך דופן הצינור המכיל את תמיסת הרב-סוכרוז (שלב 3.1) ליצירת תרחיף דו-פאזי.
    הערה: כדי למנוע ערבוב של הדם עם תמיסת רב-סוכרוז, הוסף את הדם לאט. מומלץ להשתמש במינימום של 7 מ"ל דם מכל תורם לבידוד PBMC.
  4. מיד צנטריפוגה את הצינור המכיל את המתלה biphasic ב 1,600 x גרם במשך 30 דקות ב 24 ° C. תכנת את הצנטריפוגה של PBMCs: השתמש בתאוצה 1 והאטה 0 כדי למנוע עצירה פתאומית של הצנטריפוגה.
  5. שימו לב להיווצרות טבעת לבנה המכילה את PBMCs לאחר צנטריפוגה. תאי הדם האדומים והגרנולוציטים שוכנים בשכבה התחתונה, השכבה הבאה מכילה את תמיסת הרב-סוכרוז, וה-PBMCs שוכנים בטבעת הלבנה שבין תמיסת הרב-סוכרוז לפלזמה (השכבה העליונה). אספו את הטבעת הלבנה על ידי שאיפה עדינה באמצעות פיפטה או פיפטה סטרילית של פסטר כדי לא לתפוס תאי דם אדומים, פלזמה או תמיסת רב-סוכרוז, והעבירו לצינורית אחת של 15 מ"ל.
  6. הוסף PBS לצינור 15 מ"ל המכיל את PBMCs כדי לקבל נפח סופי של 10 מ"ל. הומוגניזציה של המתלים, וצנטריפוגה את הצינור ב 1,600 x גרם למשך 30 דקות ב 24 ° C.
  7. שטפו את התאים שלוש פעמים במהירות של 1,600 x גרם במשך 5 דקות ב-24°C עם 10 מ"ל PBS. לאחר מכן, להשעות מחדש את הגלולה הסופית ב 2 מ"ל של R10 בינוני.
  8. להעריך את כדאיות התא באמצעות שיטת ההרחקה הכחולה טריפאן, ולספור את התאים בתא נויבאואר.

4. קינטיקה פגוציטוזה

הערה: המקרופאגים החד-גרעיניים בדם היקפי אנושיים מטופלים ב-T. stromaticum conidia בריבוי זיהומים (MOI) של 1:10 או רק R10 בינוני כבקרה. ריבוי ההדבקה (MOI) מייצג את היחס בין גורמי ההדבקה המתווספים ליעדי ההדבקה ומוצג כמספרים מוחלטים: MOI = סוכנים:יעדים31. כאן, אנו משתמשים 1 T. stromaticum conidia (סוכן) עבור 10 מקרופאגים (מטרות). לאחר מכן, התאים מודגרים ב 37 ° C ו 5% CO2 לפרקי זמן שונים (3 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות, ו 120 שעות). לאחר מכן, כיסוי זכוכית עגול משמש כדי לדמיין את המקרופאגים הדבקים המעורבים בתהליך phagocytosis תחת מיקרוסקופ. מוצגת דמות של תכנון ניסויי (איור 1).

הערה: מומלץ להשתמש בצלחות 24 בארות.

  1. טיפול במקרופאגים שמקורם בבני אדם עם T. stromaticum conidia
    1. הוסיפו לכל באר כיסוי זכוכית עגול סטרילי (13 מ"מ) באמצעות פינצטה סטרילית.
    2. התאם את נפח תרחיף התא המתקבל בשלבים 3.7-3.8 לצלחת 8 x 105 תאים לכל באר לנפח סופי של 1 מ"ל עם מדיום R10. השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי להעריך את המורפולוגיה של התא.
      הערה: התאים חייבים להיות תלויים בתווך ולהיות בעלי מורפולוגיה מעוגלת.
    3. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C תחת אטמוספירה של 5% CO2 למשך 7 ימים, ולהחליף את התווך בתווך R10 טרי כל יומיים לצורך התמיינות המונוציטים למקרופאגים32. התבוננו במורפולוגיית התא באמצעות מיקרוסקופ הפוך. המקרופאגים יציגו מורפולוגיה צירית, עם צורות שטוחות ומורחבות; ניתן לראות גם יחס ציטופלסמטי מוגבר ונוכחות של פסאודופודיה. חפשו מקרופאגים חד-גרעיניים דבקים.
      הערה: חלק קטן מאוד של מונוציטים לא מובחנים עשוי להישאר תלוי בתווך.
    4. הסר את המדיום של כל באר באמצעות פיפטה, ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS כדי להסיר פסולת ותאים שאינם דבקים.
    5. השתמש בתרחיף שהוכן בשלב 2.2 כדי להכין תרחיף חדש של T. stromaticum conidia בריכוז סופי של 8 x 104 conidia/mL בתווך R10.
    6. הוסף 1 מ"ל של מתלה הקונידיה שהוכן בשלב 4.1.5 לכל באר טיפול (3 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות ו-120 שעות) לקבלת MOI של 1:10. לבקרות, הוסף רק 1 מ"ל של מדיום R10 לבאר.
    7. אתגרו את המקרופאגים במשך 3 שעות עם T. stromaticum conidia בטמפרטורה של 37°C תחת אטמוספירה של 5% CO2 . לאחר 3 שעות, להסיר את המדיום, ולשטוף את התאים כדי להסיר את conidia non-phagocytosed.
    8. הוסיפו 1 מ"ל של מדיום R10 לכל באר, ודגרו על הצלחת לזמנים שונים (3 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות ו-120 שעות) בטמפרטורה של 37°C תחת אטמוספירה של 5% CO2 .
  2. צביעה וניתוח
    1. הסר את המדיום מכל באר לאחר השלמת הדגירה המתאימה (שלב 4.1.8), והוסף 1 מ"ל PBS לבאר זו.
    2. הסירו את כיסויי הזכוכית העגולים מהבארות באמצעות פינצטה סטרילית ומחט לצביעה בעזרת ערכת צביעה.
      הערה: לחילופין, ניתן לבצע צביעה באמצעות כתם מאי גרינוולד-גימסה33.
    3. לכל אחת מכיסויי הזכוכית העגולים יש להוסיף מקבע כתמים (5 שניות), צבע 1 (5 שניות), צבע 2 (2 שניות) ומים חוצצים pH 7.0 (5 שניות), שהם רכיבי ערכת הצביעה. המתינו עד שהם יבשים, וקבעו את הכיסויים על מגלשת זכוכית באמצעות חומר הרכבה.
    4. כמת את התוצאה: ספירה כוללת של 100 מקרופאגים (Mø) עבור כל תנאי זמן. באמצעות מיקרוסקופ אופטי, ספרו את מספר המקרופאגים עם קונידיה פגוציטוזית באמצעות שמן מטרה וטבילה פי 100 (משוואה [1]).
      figure-protocol-1 (1)
    5. קבל את מספר הקונידיה פאגוציטוזה לכל מקרופאג: קשר את הקונידיה הקיימת ב-100 מקרופאגים חלקי מספר המקרופאגים עם לפחות קונידיום פאגוציטוזי אחד (משוואה [2])34.
      figure-protocol-2 (2)
      הערה: כדי להעריך ולספור את הקונידיה, ניתן להשתמש בתוכנת ImageJ35.
    6. צלם את הפאגוציטוזה מכל דגימה ומצב זמן באמצעות מטרות 40x ו- 100x כדי להציג את התוצאות.

figure-protocol-3
איור 1: ייצוג סכמטי של בדיקת פאגוציטוזה ובדיקת כדאיות קונידיאלית באמצעות מקרופאגים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי. (1-10) בדיקת פגוציטוזיס: יש לגדל את T. stromaticum ב- PDA, ואת conidia הם התאוששו על ידי שטיפת הצלחת עם PBS. יש לבודד את ה-PBMCs בשיטת מחסום הצפיפות באמצעות הפרוטוקול המתואר, לגדל בתרבית בלוחות 24 בארות עם כיסויי זכוכית עגולים סטריליים למשך 7 ימים לצורך התמיינות למקרופאגים, ולאחר מכן לטפל ב-MOI של 1:10 עם מרווחי זמן שונים. כיסויי הזכוכית העגולים מוסרים ומוכתמים באמצעות ערכת הצביעה, והתוצאות מנותחות באמצעות מיקרוסקופ אור. (1-8,11-13) בדיקת כדאיות קונידיה: לאחר בידוד, ה-PBMCs מתורבתים בצלחות של 24 בארות ללא כיסויי זכוכית עגולים למשך 7 ימים לצורך התמיינות למקרופאגים ולאחר מכן מטופלים ב-MOI של 1:10 לפרקי זמן שונים. התאים חייבים להיות lysed על ידי דגירה עם מים מזוקקים; לאחר מכן מתלה הוא צנטריפוגה, ולאחר מכן גלולה resuspended מצופה PDA כדי לנתח את קינטיקה הצמיחה של Trichoderma. דמות זו עוצבה באמצעות מסד נתונים של תמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

5. בדיקת כדאיות קונידיאלית לאחר פגוציטוזה

הערה: מוצגת דמות של תכנון ניסויי (איור 1).

הערה: יש להשתמש בצלחות של 24 בארות.

  1. אתגר את המקרופאגים שמקורם בבני אדם עם T. stromaticum conidia.
    1. חזור על שלבים 4.1.2-4.1.8 כדי להבדיל בין המונוציטים, ולטפל במקרופאגים עם T. stromaticum conidia.
      הערה: אין להשתמש בכיסויי זכוכית עגולים בבארות. השתמש באותם מרווחי זמן המשמשים להערכת קינטיקה phagocytosis כך phagocytosis יכול להיות בקורלציה עם הכדאיות conidial.
    2. להעריך את ההשפעה של תווך R10 על צמיחת T. stromaticum באמצעות בארות עם המתלה מוכן בשלב 4.1.5 (R10 בינוני + conidia) כבקרה.
  2. בדיקת כדאיות קונידיאלית
    1. הסר את המדיום לאחר כל תקופת דגירה (3 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות ו -120 שעות), ושטוף את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר את הקונידיה שלא עברה פגוציטוזה.
      הערה: אין לשטוף את הפקד המכיל R10 medium + conidia.
    2. הוסיפו 0.5 מ"ל מים מזוקקים סטריליים לכל באר, ודגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 למשך 30 דקות. לאחר זמן זה, התבונן במורפולוגיית התא תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שהתאים עברו ליזה.
    3. לאסוף את ההשעיה, ולהעביר אותו 1.5 מ"ל צינורות. צנטריפוגה את המתלה באמצעות מיני צנטריפוגה ב 6,000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. יש להשליך את הסופרנאטנט בזהירות, להשהות מחדש את הגלולה ב-10 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים, ולחסן 10 מיקרוליטר של התרחיף לתוך הצלחת המכילה מחשב כף יד ב-28°C בחושך.
    5. הכן בקרה חיובית לצמיחת T. stromaticum : השתמש בתרחיף של T. stromaticum conidia (שלב 2.2) כדי להכין תרחיף חדש עם ריכוז סופי של 8 x 106 conidia / mL. צלחת 10 μL של מתלה זה ב- PDA ב- 28 ° C בחושך.
      הערה: 10 μL של תרחיף זה יכיל את אותו מספר של קונידיה (8 x 104) ששימש להדבקת המקרופאגים שמקורם בדם מונו-גרעיני. ההבדל בין בקרה חיובית זו לבין זו שהוזכרה בשלב 5.1.2 הוא שהבקרה שהוזכרה לעיל בשלב 5.1.2 משמשת להערכת ההשפעה האפשרית של מדיום R10 על צמיחת טריכודרמה בזמן פגוציטוזה. בקרה חיובית זו בשלב 5.2.5 באמצעות ההשעיה של T. stromaticum conidia שנאסף ב- PBS מייצגת בקרה לצמיחת טריכודרמה ללא השפעה של מדיום R10 כדי לשקף כיצד הפטרייה גדלה באופן טבעי. באמצעות בקרה זו, ניתן להעריך אם מדיום R10 משפיע על צמיחת Trichoderma .
    6. צפו בקינטיקה הגדילה של T. stromaticum במחשבי כף יד מדי יום, וצלמו את התרבית.
    7. ניתוח: ניתן להשתמש בשתי נקודות כדי להעריך את התוצאות: 1) הזמן (בימים) הדרוש לתרבות לתפוס את כל צלחת התרבית, 2) הזמן (בימים) עד הופעת הפיגמנטציה הירוקה האופיינית של T. stromaticum conidia בתרבית.

6. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש בבדיקת קרוסקל-וואליס כדי לקבוע הבדלים מובהקים סטטיסטית בין 8 הקבוצות/טיפולים. ניקח בחשבון את p < 0.05 כמובהק סטטיסטית. כל הנתונים מוצגים כאמצעי ± סטיית תקן (SD). באיורים, # מציין מובהקות סטטיסטית ב p < 0.05.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכניקה המערבת פאגוציטוזה של קונידיה פטרייתית על ידי מקרופאגים נמצאת בשימוש נרחב למחקרים המעריכים את אפנון התגובה החיסונית נגד פטריות. השתמשנו בפאגוציטוזה של T. stromaticum conidia כדי להעריך את הכדאיות של הקונידיה לאחר פגוציטוזה, שכן התחמקות מפאגוציטוזה ובריחת פגוזומים הם מנגנונים של אלימות פטרייתית. חוקרים צריכים לבצע טכניקות אלה כאחד הבדיקות הראשונות בעת חקירת מין של עניין קליני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבור מספר פתוגנים פטרייתיים, כולל Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans, ואחרים, phagocytosis conidial או שמרים הוא תהליך מפתח המאפשר לחקור את האירועים cytoplasmic ומולקולרי באינטראקציות מקרופאג פתוגן, כמו גם לקביעת זמן המוות של conidiaמופנם 14,39,40. פגוציטוזה היא תהליך המפתח באינטראקציה טריכודרמה מארח. סוג טריכודרמה מווסת מספר מסלולי פאגוציטוזה, כולל Dectin-1 ו-Decti...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מוסדות המימון הברזילאים הבאים: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) עם מענקים RED0011/2012 ו- RED008/2014. U.R.S., J.O.C. ו- M.E.S.M. מכירים במלגה המוענקת על ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ו- FAPESB, בהתאמה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל צינורות צנטריפוגהקורנינגCLS43147015 מ"ל, פוליפרופילן, תחתית חרוטית עם מכסה, צלחת תרבית תאים תחתונה שטוחה 24 בארות בנפרד
KasviK12-024עשויה מפוליסטירן עם זיהוי אלפאנומרי; לוחית תרבית התאים היא נטולת DNase, RNase ופירוקן וללא חומרים ציטוטוקסיים; מעוקר על ידי קרינת גמא;
חממת CO2 תרבית תאיםSanyo303082חממת CO2 משמשת ליצירה ובקרה של תנאים הדומים לגוף האדם, ובכך מאפשרת צמיחה והתפשטות במבחנה של סוגי תאים שונים.
צנטריפוגה מיקרו-שפופרת (סוג אפנדורף) 1.5 מ"לCapp5101500עשוי מפוליפרופילן, עם מכסה המחובר לצינור לפתיחה וסגירה ביד אחת בלבד. יש לו פנים מלוטש כנגד הידבקות חלבון ולנראות דגימה, בהיותו נקי מ-DNase, RNase ו-Pyrogens
כיסוי עגול 15 מ"מOlenK5-0015כיסויים עגולים משמשים לטכניקות מיקרוסקופיה בתרבית תאים. עשוי זכוכית שקופה סופר שקופה; בעובי של 0.13 מ"מ
Class II Type B2 (Total Exhaust) ארונות בטיחות ביולוגיתמקבוצת Esco Lifesciences2010274Airstream Class II Type B2 (AB2) מספקים הגנת מוצר, מפעיל וסביבה ומתאימים לעבודה עם כמויות עקבות של כימיקלים רעילים וחומרים שהוקצו לרמות בטיחות ביולוגיות I, II או III. בארון Class II Type B2, כל האוויר הנכנס והזרימה למטה מוציא לאחר סינון HEPA/ULPA לסביבה החיצונית ללא מחזור על פני משטח העבודה.
תפוחי אדמה דקסטרוז בינוניMerck145תפוח אדמה אגר דקסטרוז משמש לגידול וספירה של שמרים ופטריות
צינור איסוף דם ואקום EDTAFirstLabFL5-1109LEDTA הוא נוגד הקרישה המומלץ לשגרות המטולוגיה מכיוון שהוא נוגד הקרישה הטוב ביותר לשימור מורפולוגיה של תאים.
אנטלןמרק1.07961 חומר קיבוע; אנטלן הוא אמצעי הרכבה ללא מים להרכבה קבועה למיקרוסקופיה.
סרום בקר עובריGibcoA2720801סרום בקר עוברי (FBS) הוא a  תוסף צמיחה אוניברסלי של מדיה לתרבית תאים ורקמות. FBS הוא קוקטייל טבעי של רוב הגורמים הנדרשים לחיבור תאים, גדילה והתפשטות, יעיל לרוב סוגי התאים האנושיים ובעלי החיים (כולל חרקים).
פלאטיקון  מאגר תמונות
גליצרולMerck24900988חומר ההקפאה גליצרול משמש להקפאת תאים ונבגים
תמיסת פוליסוכרוזHistopaque-1077
תמונה J  תוכנת ניתוח תמונה
מיקרוסקופיה שקופיותדיוק7105שקופיות למיקרוסקופיה 26 x 76 מ"מ מט עובי 1.0 עד 1.2 מ"מ. עשוי מזכוכית אופטית מיוחדת וארוז עם מחלק נייר משי עם שקיפות באיכות גבוהה ללא פגמים
מיני צנטריפוגהפריזמהC1801הצנטריפוגה Prism Mini תוכננה להיות קומפקטית במיוחד עם טביעת רגל קטנה במיוחד. כולל 2 רוטורים לשחרור מהיר הניתנים להחלפה המסתובבים עד 6000 סל"ד. בלם אלקטרוני מספק האטה מהירה והמכסה הנפתח מעצמו מאפשר גישה נוחה לדגימה, ומפחית את זמן הטיפול.
תא נויבאוארKasviK5-0011תא הספירה של נויבאואר משמש לספירת תאים או חלקיקים תלויים אחרים.
מהיר פנואופטי Laborclin620529Laborclin's  Panoptic fast c היא ערכה לצביעה מהירה בהמטולוגיה
תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין - 10,000ULGC- ביוטכנולוגיה נעשה שימוש באנטיביוטיקה BR3011001 על מנת למנוע זיהום אפשרי על ידי מניפולציה חיצונית לזרימה הלמינרית.
צלחת פטרי 90 x 15 מ"מ SmoothCralplast18248צלחת פטרי חד פעמית; עשוי מפוליסטירן שקוף במיוחד (PS); תחתית שטוחה; חלק; גודל: 90 על 15 מ"מ.
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)thermo fisher Scientific10010001PBS היא תמיסת מלח על בסיס מים עם נוסחה פשוטה. הוא איזוטוני ולא רעיל לרוב התאים. הוא כולל נתרן כלורי וחוצץ פוספט ופותח למניעת זעזועים אוסמוטיים תוך שמירה על מאזן המים של תאים חיים.
פיפטה פסטר 3 מ"ל סטריליAccumaxAP-3-B-Sסטרילי ACCUMAX פסטר 3 מ"ל פיפטה עם קיבולת 3 מ"ל, עשויה מפוליאתילן שקוף בצפיפות נמוכה (LDPE) וצנטריפוגה מקוררת סטרילית בנפרד
Thermo Scientific Thermo ScientificTS-HM16Rהצנטריפוגה המקוררת Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R היא צנטריפוגה מקוררת עם לוח הבקרה הידידותי למשתמש מקל על הגדרת המהירות, ערך RCF, זמן ריצה,  טמפרטורה ופרופיל ריצה. ה-Megafuge 16R יכול להגיע למהירויות מקסימליות של  15,200 סל"ד ו-RCF מקסימלי של 25,830 x גרם.
RPMI-1640 MediumMerckMFCD00217820שינוי HEPES, עם L-גלוטמין ו-25 מ"מ HEPES, ללא נתרן ביקרבונט, אבקה, מתאימה לתרבית תאים
המיקרופיפטות החד-ערוציותEppendorfZ683809מיקרופיפטות חד-ערוציות משמשות להעברה ומדידה מדויקת של כמויות קטנות מאוד של נוזלים.
טיפ למיקרופיפטורקורנינג4894קיבולת של 10 ומיקרו; L ו-1,000 ומיקרו; L
מיקרוסקופ הפוך טריאוקולריLABOMEDVU-7125500זה מאפשר לך להתבונן בתאים בתוך צינורות ובקבוקים, מבלי שתצטרך לפתוח אותם, ובכך להימנע מבעיות זיהום.
אגר ניתן לחיטוי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R. Chapter 7 - Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V. Chapter 16 - Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G. Chapter 17 - Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J. Chapter 26 - Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A. Chapter 24 - Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. , Wallingford, UK. (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , Chapter 14, Unit 14 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406(2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681(2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008(2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145(2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E. Multiplicity of infection. Brenner's Encyclopedia of Genetics. Second Edition. Maloy, S., Hughes, K. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health - Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223(2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082(2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252(2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day - Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722(2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Trichoderma StromaticumConidial ViabilityMacrophage PhagocytosisPeripheral Blood MononuclearFungal ClearanceIn Vitro PhagocytosisConidia IsolationHuman MacrophagesPhagocytosis AssayFungal Pathogenesis

Related Articles