שיטה מדויקת וניתנת לכימות לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים

Summary

אנו מתארים שיטה לאיסוף המולימפה הניתנת לכימות ביעילות מפרוקי רגליים קטנים לצורך ניתוח לאחר מכן.

Abstract

פרוקי רגליים ידועים כמעבירים מגוון וירוסים בעלי חשיבות רפואית וחקלאית דרך ההמולימפה שלהם, החיונית להעברת הנגיף. אוסף Hemolymph הוא הטכנולוגיה הבסיסית לחקר אינטראקציות וירוס-וקטור. כאן, אנו מתארים שיטה חדשנית ופשוטה לאיסוף כמותי של המולימפה מפרוקי רגליים קטנים באמצעות Laodelphax striatellus (הפלנטהופר החום הקטן, SBPH) כמודל מחקר, שכן פרוק רגליים זה הוא הווקטור העיקרי של וירוס פס האורז (RSV). בפרוטוקול זה, התהליך מתחיל בצביטה עדינה של רגל אחת של פרוק הרגליים הקפוא בפינצטה עדינה ולחיצה על ההמולימפה מתוך הפצע. לאחר מכן, micropipette פשוט המורכב נימים נורה פיפטה משמש לאסוף את hemolymph transudative מן הפצע על פי העיקרון של כוחות נימים. לבסוף, ניתן להמיס את ההמולימפה שנאספה לתוך חיץ ספציפי למחקר נוסף. שיטה חדשה זו לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים היא כלי שימושי ויעיל למחקר נוסף על ארבו-וירוסים ואינטראקציות וקטור-וירוס.

Introduction

וירוסים הן של בעלי חיים והן של צמחים יכולים להיות מועברים על ידי פרוקי רגליים, ונגיפים אלה מהווים איום חמור על בריאות האדם וגורמים להפסדים כלכליים עצומים בחקלאות ^1,2,3. חשוב לציין כי המולימפה של פרוקי הרגליים, המשמשת כמערכת הדם וכמרכיב חיוני של מערכת החיסון בפרוקי רגליים, ממלאת תפקיד חשוב בוויסות ההעברה הארבו-ויראלית. וירוסים הנרכשים דרך מעי פרוקי הרגליים מועברים לרקמות אחרות רק לאחר בריחה מוצלחת מסביבת המולימפה השלילית 4,5,6,7. מחזור החיים של וירוסים בהמולימפה פרוק הרגליים כרוך בהישרדות הנגיף בפלזמה הנוזלית, כניסה להמוציטים והעברה לרקמות אחרות, ומנגנוני אינטראקציה שונים בין וירוסים לווקטורים מתרחשים בהמולימפה 8,9,10,11,12. לדוגמה, העברה אנכית של RSV על ידי SBPH תלויה באינטראקציה מולקולרית בין חלבון SBPH vitellogenin לבין חלבון RSV (וירוס פס אורז) capsid^{protein 13,14}. וירוסים מסוימים עשויים לברוח מהתגובה החיסונית של ההמולימפה על ידי קשירת גורמים וקטוריים ספציפיים^15,16,17,18. לכן, חקירת אינטראקציות וקטור-וירוס בהמולימפה של פרוקי רגליים חשובה לפיתוח הבנה טובה יותר של העברת arbovirus.

המולימפה של כמה חרקים קטנים, כגון planthoppers, leafhoppers, וכמה יתושים, קשה לאסוף בשל גודלם. כדי להתמודד עם בעיה זו, פותחו מספר שיטות לאיסוף המולימפה, כולל החדרת מחט מזרק ישירות לגוף החרק כדי לחלץ מיקרו-נפח של ההמולימפה, איסוף הפרשה מאתר הפצע באמצעות פינצטה עדינה, וצנטריפוגה ישירה. שיטות אלה אפשרו מדידה של רמות ביטוי גנים יחסיות וטיטרים נגיפיים בתוך המולימפה 19,20,21. עם זאת, שיטה יעילה לכימות נפח המולימפה, הנחוצה לספירת המוציטים, כימות חלבונים וניתוח פעילות אנזימים, אינה זמינה כיום עבור חרקים קטנים אלה.

SBPH (פלנטהופר חום קטן) הוא סוג של וקטור חרקים קטן עם אורך גוף של כ 2-4 מ"מ. SBPH מסוגל להעביר מגוון רחב של וירוסים צמחיים, כולל RSV, תירס גס ננס וירוס, אורז שחור פסים ננס וירוס^22,23,24. האינטראקציה בין SBPH ו- RSV נחקרה לעומק בעשור האחרון. כדי להקל על העבודה עם SBPHs, פיתחנו שיטה חדשנית ופשוטה לאיסוף המולימפה. שיטה זו, המבוססת על עקרון הכוחות הנימיים, משתמשת בנימים בעלי סימן קנה מידה כדי לרכוש את ההמולימפה של החרק באופן מדויק וניתן לכימות. זה מאפשר לנו לאסוף נפח מסוים של המולימפה מחרקים קטנים ביעילות וללמוד את סביבת ההמולימפה של וקטורים קטנים בפירוט רב יותר.

Protocol

1. גידול חרקים

1. העלו את ה-SBPHs המשמשים בניסוי זה בשתילי אורז (Oryza sativa cv. Nipponbare). שתול 20 שתילי אורז באינקובטור (65 מ"מ x 200 מ"מ), וגדל ב 25 ° C תחת 16 שעות אור / 8 שעות כהה.

2. נתיחת SBPHs לאוסף המולימפה

1. הכניסו את SBPHs לתוך צינור צנטריפוגה, והניחו אותם באמבט קרח למשך 10-30 דקות.
   הערה: אין להניח את ה-SBPHs באמבט הקרח למשך פחות מ-10 דקות, אחרת החרקים עלולים להתעורר.
2. הניחו SBPH קפוא על מגלשת זכוכית (ראו טבלת חומרים) מתחת לסטריאומיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים) כשהבטן שלו פונה כלפי מעלה. התאימו את המיקוד לשש רגליו של החרק.
3. הכינו שתי פינצטות בדיוק גבוה (ראו טבלת חומרים) עם קצוות עדינים במיוחד. השתמש בפינצטה אחת כדי ללחוץ על גוף החרק כדי לשמור אותו במקומו, והשתמש בפינצטה השנייה כדי למשוך בזהירות את אחת הרגליים מהחרק.
   הערה: עבור חרקים עם קליפה קשה, אזמל עיניים יכול לשמש לחיתוך אחת הרגליים.
4. לחץ בעדינות על החזה של החרק עם פינצטה כדי לגרום להמולימפה לזרום החוצה דרך הפצע.
   הערה: ההמולימפה מוצגת כטיפות שקופות ללא כל פלוקול לבן נראה לעין. יש להשליך את השומנים אם יש פלוקול לבן, המייצג זיהום גוף שומן.

3. אוסף המולימפה באמצעות מיקרופיפטות

1. הכינו מיקרופיפטה. הניחו צינור נימי (ראו טבלת חומרים) בנפח של 1 μL לתוך נורת פיפטה (ראו טבלת חומרים). למדידות מדויקות, ודא שקו קנה המידה גלוי.
   הערה: יש צורך בחור קטן בחלק העליון של נורת הפיפטה.
2. בעת איסוף ההמולימפה, להחזיק את נורת פיפטה של micropipette, ומניחים את צינור נימי קרוב לפצע החרק. לאסוף את hemolymph exparing מן הפצע פשוט על ידי נגיעה בקצה הנימים כדי hemolymph.
3. חסום מעט את החור הקטן בחלק העליון של נורת פיפטה עם האצבע כדי לעצור את תהליך הספיגה כאשר הנוזל בתוך צינור הנימים מגיע לקו קנה המידה הרצוי.
   הערה: יש לאסוף דגימה אחת של 1 מיקרוליטר של המולימפה ללא הרף ובמהירות כדי למנוע זיהום שומנים וחיבור צינורות.
4. לחץ על נורת פיפטה כדי לפרוק את ההמולימפה שנאספה לתוך 100 μL של חיץ PBS (137 mmol / L NaCI, 2.7 mmol / L KCI, 4.3 mmol / L Na 2 HPO 4, 1.4 mmol / L KH 2 PO 4, pH 7.2-7.4).
   הערה: צינור הנימים מוכנס למאגר PBS.
5. שנה לצינור נימי חדש בעת איסוף דגימה נוספת של 1 μL של המולימפה.

4. צביעה כחולה קומאסי

1. אסוף 3 דגימות המולימפה באותו נפח (1 μL) מזחלי השלב השלישי בהתאם לפרוטוקולים המתוארים בשלב 3, ושחרר את ההמולימפה שנאספה לתוך מאגר PBS כדי ליצור נפח כולל של 100 μL.
2. הוסף 25 μL של מאגר העמסת חלבון 5x (250 mmol / L Tris-HCI [pH 6.8], 10% W/V SDS, 0.05% W/V ברומופנול כחול, 50% W/V גליצרול, 5% W/V β-מרקפטואתנול) לתוך 100 μL של דגימות המולימפה מדולל, וחממו כדי לנטרל את החלבונים.
3. טען 20 μL של הדגימות המבושלות על ג'ל חלבון 10% SDS-PAGE (ראה טבלת חומרים) כדי להפריד את החלבונים.
4. מכתימים את הג'ל בתמיסת Coomassie Blue (מערבבים 1 גרם של Coomassie Brilliant Blue R-250 עם 250 מ"ל איזופרופנול, 100 מ"ל חומצה אצטית קרחונית ו-650 מ"ל של ddH₂O, ומסננים את כל החלקיקים באמצעות נייר פילטר) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן מסירים את צבע הג'ל למשך שעה אחת עם תמיסת דה-צבעה (100 מ"ל חומצה אצטית, 400 מ"ל מתנול, 500 מ"ל של ddH₂O).

5. קביעת ריכוז החלבונים

1. יש לדלל אלבומין בסרום בקר (BSA) במינון 10 מ"ג/מ"ל ל-5 מ"ג/מ"ל, 2.5 מ"ג/מ"ל, 1.25 מ"ג/מ"ל, 0.625 מ"ג/מ"ל ו-0.3125 מ"ג/מ"ל באמצעות חיץ PBS בשיטת הדילול הכפול.
2. שאפו 5 מיקרוליטר של חיץ PBS וכל ריכוז של תמיסות BSA בשלב 5.1, הוסיפו 1 מ"ל של מגיב צבע ברדפורד 1x (ראו טבלת חומרים), ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש במאגר PBS בריאגנט צבע ברדפורד כבקרה, ואפס ב- OD = 595 ננומטר. למדוד את ערכי הספיגה של כל אחד מריכוזי החלבונים הנותרים, ולבצע עקומה סטנדרטית.
3. הוסף 1 μL של המולימפה מזחלים, נקבות או זכרים SBPHs לתוך 100 μL של חיץ PBS, ולאחר מכן צנטריפואט את הדגימות ב 1,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את המוציטים.
4. יש לשאוף 90 מיקרוליטר של סופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש, ולמדוד את ערכי הספיגה של הסופרנאטנט בהתאם להוראות בשלב 5.2.
5. חישוב ריכוזי החלבונים של דגימות ההמולימפה על פי משוואת הרגרסיה של העקומה הסטנדרטית. כלול שלושה משכפלים ביולוגיים עם שלושה שכפולים טכניים בניסויים.

6. גילויים מיקרוסקופיים

1. השתמש micropipettes לאסוף hemolymph מ 10-15 SBPHs בשלבים התפתחותיים שונים. הוסף את ההמולימפה שנאספה לתוך צינור המכיל 20 μL של תמיסת 4% paraformaldehyde (ראה טבלה של חומרים). דוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לתקן את ההמולימפה.
2. פיפטה 20 μL של המוציטים קבועים על מרכז שקופית מצופה סילאן (ראה טבלת חומרים).
3. יבשו את הטיפה במתלה לייבוש שקופיות.
   הערה: יש להימנע מייבוש יתר.
4. כסו את הדגימה בריאגנט אנטי-דהייה זהב 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (ראו טבלת חומרים), ובדקו את השקופית תחת מיקרוסקופ הפוך (ראו טבלת חומרים).

7. כימות התא

1. לאסוף 1 μL של hemolymph מן SBPHs עם micropipette, ולהמיס אותו לתוך 20 μL של מאגר PBS.
2. לדלל את דגימות ההמולימפה פי חמישה עם חיץ PBS.
3. פיפטה 20 μL של תמיסת המולימפה למרכז תא ספירת התאים (ראה טבלת חומרים). כסו את הטיפה בפתק כיסוי (ראו טבלת חומרים).
4. ספרו את התאים בחמשת הריבועים בתא ספירת התאים (איור משלים 1), תחת מיקרוסקופ הפוך (ראו טבלת חומרים). כלול שלושה משכפלים ביולוגיים עם שלושה שכפולים טכניים בכל אחד מהניסויים.
   תאים/μL = ספירה כוללת של חמישה ריבועים אמצעיים × 5 × גורם דילול × 10⁴

8. ניתוחים סטטיסטיים

1. בצע ניתוחים סטטיסטיים עם התוכנה המתאימה (ראה טבלת חומרים). צור קובץ חדש, בחר בעמודה, ייבא את הנתונים וצור התוויית פיזור עם סרגל.
2. חשב את הממוצע וה- SD עבור כל קבוצת נתונים באמצעות סטטיסטיקת עמודות, והשתמש בכלי ANOVA חד-כיווני כדי להעריך את משמעות ההבדלים בין הקבוצות. לקבוע את הממוצע ואת SD מתוך שלושה עותקים ביולוגיים עם שלושה ניסויים עצמאיים.

Results

דגם מיקרופיפטה וקולקציית המולימפה
פיתחנו מיקרופיפטה פשוטה שפעולתה מבוססת על הכוחות הקפילריים של צינור הנימים. המיקרופיפטה מורכבת מצינור נימי ומנורת פיפטה (איור 1A). צינורות נימים זמינים בגדלי נפח שונים הנעים בין 1 μL ל 20 μL, ונפחי הצינור הנימי נבחרים בהתאם לדרישות. צינורות נימים עם נפחים קטנים יותר אינם מוצעים מכיוון שהפתחים העדינים במיוחד של צינורות בעלי נפח קטן יותר יכולים להקשות על ספיגת נוזלים כגון המולימפה. נורת הפיפט מכילה חור בחלק העליון שלא ניתן לסתום במהלך איסוף...

Discussion

המולימפה הוא המדיום של מערכת הדם בפרוקי רגליים, וארבו-וירוסים יכולים לפלוש לרקמות פרוקי רגליים אחרות רק אם הם מסוגלים לשרוד את סביבת ההמולימפה העוינת. איסוף מדגם איכותי של המולימפה הוא הצעד הראשון בחקר אינטראקציות וקטור-וירוס המתרחשות בהמולימפה. דווח כי ניתן להשיג המולימפה של חרקים ממספר אתרים בגוף החרק, כולל פצע ברגל הקדמית, חתך קל באזור הראש, או פצע קרע בבטן^26,27,28,29. שיטות איסוף שונות עשוי...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% ג'ל חלבון SDS-PAGE	Bio-rad	4561035	הפרדה וזיהוי חלבונים
4% פרפורמלדהיד	Solarbio	P1110	לקיבוע התאים או הרקמות
מגיב צבע ברדפורד	Bio-rad	5000205	זיהוי ריכוז חלבון
נימי	הירשמן	9000101	לאיסוף
תא ספירת תאים	ACMEC	AYA0810	ספירת המוציטים שקופית
זכוכית	Gitoglas	10127105A	להחזקת
חרקים שקופית זכוכית מצופה סילאן	סיגמא	S4651-72EA	להחזקת דגימות מיקרוסקופ
מגיב זהב אנטי-דהייה עם DAPI	Invitrogen	P36935	מכתים גרעין
	Gitoglas	10212424C	לתצפית מיקרוסקופית
נורת פיפטה	הירשמן	9000101	לאיסוף המולימפה
פריזמה 8.0 תוכנת	GraphPad		ניתוחים סטטיסטיים
סטריאומיקרוסקופ	Motic	SMZ-168	לדיסקציה של חרקים
פינצטה	Tianld	P5622	לדיסקציה של
חרקים Zeiss מיקרוסקופ הפוך	Zeiss	Observer Z1	תצפית המוציטים