דיסקציה של Stria vascularis עכבר בוגר עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining

Summary

הסטריה וסקולריס חיונית ליצירת הפוטנציאל האנדוקוכליארי. כאן, אנו מציגים את הדיסקציה של העכבר הבוגר stria vascularis עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining.

Abstract

הפוטנציאל האנדוקוכליארי, אשר נוצר על ידי כלי הדם stria, הוא חיוני כדי לשמור על סביבה תורמת mechanotransduction תאי שיער מתאים ובסופו של דבר שמיעה. פתולוגיות של כלי הדם stria יכול לגרום לירידה בשמיעה. דיסקציה של הסטריה וסקולריס הבוגרת מאפשרת לכידה ממוקדת של גרעין יחיד ולאחר מכן ריצוף גרעין יחיד וצביעת חיסון. טכניקות אלה משמשות לחקר פתופיזיולוגיה של סטריה וסקולריס ברמת התא היחיד.

ריצוף גרעין יחיד יכול לשמש בהגדרה של ניתוח שעתוק של כלי הדם stria. בינתיים, צביעת מערכת החיסון ממשיכה להיות שימושית בזיהוי אוכלוסיות ספציפיות של תאים. שתי השיטות דורשות דיסקציה נכונה של stria vascularis כתנאי מוקדם, אשר יכול להוכיח להיות מאתגר מבחינה טכנית.

Introduction

השבלול מורכב משלושה תאים מלאים בנוזל, סקאלה וסטיבולי, סקאלה מדיה וסקלה טימפני. סקאלה וסטיבולי וסקלה טימפאני מכילים כל אחד פרילימפה, אשר יש ריכוז גבוה של נתרן (138 mM) וריכוז נמוך של אשלגן (6.8 mM)¹. מדיה סקאלה מכיל endolymph, אשר יש ריכוז גבוה של אשלגן (154 mM) וריכוז נמוך של נתרן (0.91 mM)^1,2,3. הבדל זה בריכוז היונים יכול להיקרא פוטנציאל אנדוקוכליארי (EP), והוא נוצר בעיקר על ידי תנועה של יוני אשלגן דרך תעלות יונים שונות וצמתים מרווחים בסטריה וסקולריס (SV) לאורך הדופן הצידית של השבלול 4,5,6,7,8,9,10,11

Protocol

כל הניסויים וההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי והמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכונים הלאומיים לבריאות. כל הפרוטוקולים הניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי והמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכונים הלאומיים לבריאות. כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות של הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי והמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכונים הלאומיים לבריאות.

1. המתת חסד של בעלי חיים

Results

אנו מציגים שיטה לבודד את SV לשימוש עבור sNuc-Seq או immunostaining. האנטומיה הרלוונטית (איור 1) של השבלול ביחס ל-SV יכולה לעזור למשתמשים להבין טוב יותר את הארגון של SV ואת השלבים של פרוטוקול הדיסקציה.

כל שלב של מיקרו-דיסקציה זו של SV מעכבר P30 מפורט בווידיאו המשויך, ותצלומי בזק של שלבי המפתח של הדיסקציה והבידוד של SV מוצגים באיור 2.

sNuc-Seq שימושי בחקירת פרופיל השעתוק של התאים השונים ב-SV ההטרוגני. דרך אחת.......

Discussion

לפני הופעתו של ריצוף תא יחיד, חוקרים רבים השתמשו בניתוח רקמות בתפזורת, אשר איפשר רק לנתח תעתיקים ממוצעים על פני תאים. בפרט, תא בודד ו- sNuc-Seq אפשרו לבודד את התעתיק של תא בודד או גרעין יחיד, בהתאמה³². במקרה זה, ניתן לזהות תעתיקי גרעין יחיד עבור תאים שוליים, בינוניים ובזאליים, כמו גם תאי ציר³⁰. זה מאפשר לחקור הטרוגניות שעתוק בין סוגי תאים SV וניתן להשתמש בו בעתיד כדי לחקור את התרומה של סוגי תאים אלה לתפקוד SV, כולל יצירה ותחזוקה של EP. מערכי נתונים שנוצרו באמצעות sNuc-Seq י.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ומיקרו; מסנן m (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	רקמת סינון במהלך sNuc-Seq
18 x 18 מ"מ כיסוי זכוכית	פישר סיינטיפיק	12-541A	החלקת כיסוי להרכבה SV
30-µ מסנן m (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	סינון רקמות במהלך sNuc-Seq
75 x 25 מ"מ Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger		EF15978Z-Microslide להרכבת SV על
עכברי C57BL/6J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	זן עכבר לשימוש כללי שיש לו פיגמנט שנראה ביתר קלות בתאי הביניים של ה-SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	משמש לספירת תאים
Chalizon curette 5 '', גודל 3 2.5 מ"מ	מכשירי מחקר ביו-רפואיים	15-1020	משמש להעברת SV
כרום הבא GEM תא יחיד 3' ערכת GEM v3.1	כרום	PN-1000141	מייצר ספריות ביטוי גנים של תא יחיד 3'
לק שקוף	פישר סיינטיפיק	NC1849418	משמש לאיטום SV mount
Corning Falcon כלי תרבית רקמות סטנדרטיים, 24 באר	צלחת תרבית קורנינג	08-772B	המשמשת להחזקת דגימה במהלך דיסקציה
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	כתם המשמש לתיוג גרעין
הומוגנייזר	Dounce Sigma-Aldrich	D8938	משמש להומוגניזציה של רקמות עבור sNuc-seq
Dumont #5 מלקחיים	Fine Science Tools	11252-30	מלקחיים כלליים לדיסקציה
Dumont #55 מלקחיים	Fine Science	Tools 11255-20	מלקחיים עם קצה עדין המקל על מניפולציה של SV
סרום בקר עוברי	ThermoFisher	16000044	משמש לשלבים של מקל דבק sNuc-Seq
	Fisher Scientific	NC0691392	משמש להרכבת
נוגדן SV GS-IB4 מולקולרי	בדיקות	I21411, RRID: AB-2314662	נוגדן המשמש לתיוג נימי
KCNJ10-ZsGreen עכברים	n/a	n/a עכבר	טרנסגני המבטא KCNJ10-ZsGreen, באופן חלקי בתאי הביניים של ה-SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	משמש לשלבים של sNuc-Seq
מגיב הרכבה	ThermoFisher	#S36940	מגיב הרכבה לצלחת SV
Multiwell 24 באר	Corning	#353047	צלחת המשמשת לצביעה חיסונית
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	משמש לשלבים של sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	משמש לשלבים של sNuc-Seq
מים ללא נוקלאז	ThermoFisher	4387936	משמש לשלבים של שייקר אורביטלי sNuc-Seq
	Silent Shake	SYC-2102A	משמש לשלבים של צביעה חיסונית
PBS	ThermoFisher	J61196. AP	משמש לשלבים של צביעה חיסונית ודיסקציה
RNA מאוחר יותר	Invitrogen	AM7021	משמש לשימור SV עבור sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	משמש לפיצול גולגולת עכבר
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	משמש לשלבים של sNuc-Seq
Trypan כתם כחול	Gibco	15250061	משמש לספירת תאים
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	משמש לשלבים של sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo סטריאומיקרוסקופ	Zeiss	n/a	מיקרוסקופ המשמש לנתיחות