הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דיסקציה של Stria vascularis עכבר בוגר עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining

4.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65254

⸱

21 באפריל 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Auditory Development and Restoration Program, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

הסטריה וסקולריס חיונית ליצירת הפוטנציאל האנדוקוכליארי. כאן, אנו מציגים את הדיסקציה של העכבר הבוגר stria vascularis עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining.

תקציר

הפוטנציאל האנדוקוכליארי, אשר נוצר על ידי כלי הדם stria, הוא חיוני כדי לשמור על סביבה תורמת mechanotransduction תאי שיער מתאים ובסופו של דבר שמיעה. פתולוגיות של כלי הדם stria יכול לגרום לירידה בשמיעה. דיסקציה של הסטריה וסקולריס הבוגרת מאפשרת לכידה ממוקדת של גרעין יחיד ולאחר מכן ריצוף גרעין יחיד וצביעת חיסון. טכניקות אלה משמשות לחקר פתופיזיולוגיה של סטריה וסקולריס ברמת התא היחיד.

ריצוף גרעין יחיד יכול לשמש בהגדרה של ניתוח שעתוק של כלי הדם stria. בינתיים, צביעת מערכת החיסון ממשיכה להיות שימושית בזיהוי אוכלוסיות ספציפיות של תאים. שתי השיטות דורשות דיסקציה נכונה של stria vascularis כתנאי מוקדם, אשר יכול להוכיח להיות מאתגר מבחינה טכנית.

מבוא

השבלול מורכב משלושה תאים מלאים בנוזל, סקאלה וסטיבולי, סקאלה מדיה וסקלה טימפני. סקאלה וסטיבולי וסקלה טימפאני מכילים כל אחד פרילימפה, אשר יש ריכוז גבוה של נתרן (138 mM) וריכוז נמוך של אשלגן (6.8 mM)1. מדיה סקאלה מכיל endolymph, אשר יש ריכוז גבוה של אשלגן (154 mM) וריכוז נמוך של נתרן (0.91 mM)1,2,3. הבדל זה בריכוז היונים יכול להיקרא פוטנציאל אנדוקוכליארי (EP), והוא נוצר בעיקר על ידי תנועה של יוני אשלגן דרך תעלות יונים שונות וצמתים מרווחים בסטריה וסקולריס (SV) לאורך הדופן הצידית של השבלול 4,5,6,7,8,9,10,11 . SV היא רקמה הטרוגנית, מאוד וסקולרית, שמרפדת את האספקט המדיאלי של הדופן הצידית של השבלול ומכילה שלושה סוגי תאים עיקריים: תאים שוליים, תאי ביניים ותאי בסיס12 (איור 1).

תאי שוליים מחוברים על ידי צמתים הדוקים כדי ליצור את המשטח המדיאלי ביותר של SV. הממברנה האפיקלית פונה לאנדולימפה של מדיה סקאלה ותורמת להעברת יוני אשלגן לתוך האנדולימפה באמצעות ערוצים שונים, כולל KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 ו-Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. תאי ביניים הם תאים פיגמנטיים השוכנים בין תאים שוליים לתאי בסיס ומאפשרים העברת אשלגן דרך SV באמצעות KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. תאי הבסיס נמצאים בסמיכות לדופן הצידית של השבלול וקשורים קשר הדוק עם פיברוציט של הרצועה הספירלית כדי לקדם מחזור אשלגן מהפרילימפה12. פתולוגיה של SV הייתה מעורבת בהפרעות אוטולוגיות רבות17,18. מוטציות בגנים המתבטאים בסוגי תאי SV העיקריים, כגון Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 ו-Cldn11, עלולות לגרום לחירשות ולתפקוד לקוי של SV, כולל אובדן EP 19,20,21,22,23. בנוסף לשלושת סוגי התאים העיקריים, ישנם סוגי תאים אחרים פחות נחקרים ב-SV, כגון תאי ציר 22, תאי שורש12,24, מקרופאגים 25, פריציטים 26 ותאי אנדותל 27, שיש להם תפקידים לא מוגדרים לחלוטין הקשורים להומאוסטזיס יוני וליצירת EP 28.

בהשוואה לריצוף רנ"א בתפזורת, ריצוף רנ"א חד-גרעיני (sNuc-Seq) מספק מידע על הטרוגניות התא, ולא ממוצע של mRNA על פני קבוצת תאים29, ויכול להיות שימושי במיוחד כאשר חוקרים את SV30 ההטרוגני. לדוגמה, sNuc-Seq הפיק ניתוח שעתוק המצביע על כך שייתכן שיש תפקיד לתאי ציר ושורש ביצירת EP, אובדן שמיעה ומחלת מנייר18. אפיון שעתוק נוסף של סוגי תאי SV השונים יכול לספק לנו מידע רב ערך על הפתופיזיולוגיה העומדת בבסיס מנגנונים ותת-סוגים שונים של תנודות שמיעה הקשורות ל-SV ואובדן שמיעה. הקציר של מבני האוזן הפנימית העדינים הללו הוא בעל חשיבות עליונה לניתוח רקמות אופטימלי.

במחקר זה מתוארת גישת המיקרודיסקציה לגישה ולבידוד של כלי הדם הסטריה משברלול העכבר הבוגר עבור sNuc-Seq או immunostaining. דיסקציה של SV עכבר בוגר נדרשת כדי להבין סוגים שונים של תאי SV ולאפיין עוד יותר את תפקידם בשמיעה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים וההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי והמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכונים הלאומיים לבריאות. כל הפרוטוקולים הניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי והמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכונים הלאומיים לבריאות. כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות של הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי והמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכונים הלאומיים לבריאות.

1. המתת חסד של בעלי חיים

  1. השתמש C57BL/6J או Kcnj10-ZsGreen עכברים טרנסגניים, יום לאחר הלידה 30+ (P30+), כי לשקול בין 15-20 גרם.
  2. יש להרדים עכבר בוגר (מגיל P30 ומעלה) באמצעות פרוטוקול מאושר (כאן חנק CO2 ). בצע עריפת ראש כשלב משני.
    הערה: במקרה של immunostaining, נוגדנים מסוימים עשויים להיות אות רקע עקב קשירה לא ספציפית לדם בנימים של SV. זילוח לב עם קיבוע יכול לטפל בבעיה זו על ידי הסרת דם מן הנימים של SV. עם זאת, רוב הנוגדנים יכולים להשיג תוצאות טובות ללא שיטה זו, וזה לא יהיה מכוסה בפרוטוקול זה.

2. חשיפת מבוך גרמי

  1. נקו את העכבר על ידי ריסוס באתנול 70% וניגוב במגבת נייר. שימו לב במיוחד לאזור הראש כדי להפחית את הסיכון לזיהום. הסר את העור מהגולגולת על ידי משיכת העור לכיוון האף.
  2. בעזרת מספריים חדים, פצלו את הגולגולת לאורך מישור הקשת האמצעית כדי להפריד בין החלק השמאלי לחלק הימני.
  3. הסר את המוח מהגולגולת כדי לחשוף את המבוך הגרמי.

3. מיצוי האוזן הפנימית

  1. זהו את האוזן הפנימית בתוך העצם הרקתית (איור 2A) וגרדו את עצבי הגולגולת באמצעות מלקחיים #55.
    הערה: המשתמש צריך לייצב את הדגימה עם היד הלא דומיננטית שלו באמצעות קבוצה שנייה של #55 מלקחיים. אזורים שונים של הדגימה עשויים להיתפס עם המלקחיים המייצבים לאורך כל הדיסקציה אם נמנעים מאזורים קריטיים של הדגימה (למשל, לא למחוץ את השבלול).
  2. באמצעות #55 מלקחיים, לנתח את הבולה ואת הקפסולה, לנתק אותם מן העצם שמסביב. יש להסיר את שאריות הרקמה הרכה משטח האוזן הפנימית.
  3. העבירו את הדגימה לצלחת תרבית רקמה שקופה המכילה 1x PBS קר (מלח חוצץ פוספט), pH 7.4, והניחו תחת תחום דיסקציה (איור 2B).

4. דיסקציה SV

הערה: עם תרגול, ניתן לנתח את SV כמו חתיכה אחת ארוכה הדומה לסרט. ה-SV שביר, כך שאם הוא נשבר לחתיכות, ניתן לאחסן אותן יחד. לחלופין, ניתן לאחסן אותם בבארות המסומנות בנפרד בהתאם לתורם (למשל, בזאלי, אמצעי, אפיקלי).

  1. אם ניתן להזיז את מקורות האור של טווח הדיסקציה, הניחו מקור אור אחד מעל הצלחת ואת מקור האור השני מהצד, במקביל למשטח הניתוח. זה מאפשר ניגודיות טובה יותר של הרקמה מתחת לעצם השבלול.
  2. באמצעות מלקחיים #55, החזיקו את הדגימה בחלק שיווי המשקל כשהשבלול פונה כלפי מעלה.
  3. באמצעות #55 מלקחיים, לחדור דרך עצם השבלול בקודקוד.
    הערה: #5 מלקחיים עבים יותר מ #55 וניתן להשתמש בהם לשבירת עצם, אך הגידול בגודל / כוח מקריב את עדינות המלקחיים ואת היכולת לתפעל רקמות קטנות. שקול להשתמש במלקחיים העשויים מחומר כגון inox או dumostar כדי למנוע נזק שעלול להתרחש למלקחיים עדינים יותר. הימנע מדחיפת המלקחיים עמוק מדי מתחת לעצם כדי למנוע נזק ל- SV.
  4. באמצעות מלקחיים #55, גרדו לאורך הסיבוב האפי (איור 2C), תוך הפעלת כוח עדין כדי לשבור חתיכות קטנות של שכבת העצם החיצונית. הרימו בעדינות את העצם ונתקו אותה מהדופן הצידית.
    הערה: ייתכן שיהיה מועיל לחשוב על נתיחה זו כעל "הסרת הכל מה-SV", במקום "לנתח את ה-SV מתוך השבלול".
  5. המשיכו להשתמש במלקחיים #55 כדי להסיר חתיכות עצם שבלול מהפניות האפיקליות והאמצעיות (איור 2D,E). דוחפים בעדינות את הקיר הרוחבי, מחטטים ומסירים חתיכות דופן עצם לכיוון הפנייה האמצעית כדי לחשוף את הקיר הצידי של הסיבובים האפיקליים והאמצעיים.
  6. ממשיכים להשתמש במלקחיים #55, דוחפים בעדינות את הקיר הצידי של הסיבוב האפי הצידה כדי לחשוף את הגנגליון הספירלי. נתקו את הדופן הצידית של סיבובים אפיים ואמצעיים מהגנגליון הספירלי לאורך שכבת תא השערה החיצונית. הסר חתיכות של גנגליון ספירלי מתוך השבלול.
    הערה: #55 מלקחיים קטנים יותר ומספקים יתרון בעת מניפולציה של רקמות קטנות ועדינות. יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע כיפוף או פגיעה בהם.
  7. כדי לקבל גישה טובה יותר לדופן הצידית של סיבוב הבסיס, נתק את השבלול מהחלק הווסטיבולרי של העצם הטמפורלית באמצעות מלקחיים #55. הכניסו את המלקחיים #55 לחלון העגול והסגלגל ודחפו כלפי מטה לכיוון הפרוזדור. השבלול יתנתק. הסר את החלק הווסטיבולרי של האוזן הפנימית.
  8. המשך שימוש #55 מלקחיים, עכשיו להסיר חתיכות של עצם השבלול הבסיסית, החל מאזור הסיבוב האמצעי. דחפו בעדינות את שכבת הדופן הצידית מתחת לעצם כדי לנתק אותה.
  9. הסר את החלק הבסיסי הרחוק ביותר של הדופן הצידית על ידי חטטנות ומשיכה עדינה של הרקמה. העצם באזור זה עשויה להיות עבה מכדי שניתן יהיה להסיר אותה מבלי לפגוע ברקמה הרכה שמתחתיה.
  10. כעת, כאשר החלק הבסיסי של הדופן הצידית מנותק, יש להפריד ככל האפשר את הדופן הצידית מהשבלול. ניתן לעשות זאת על ידי מעקב אחר המלקחיים #55 לאורך הקיר הרוחבי. מברישים בעדינות את המלקחיים בין העצם לדופן הצידית הנותרת. ניתן לעשות זאת עד לשיא בחתיכה אחת אם המשתמש מנוסה. העבר את הקיר הצידי ל- PBS טרי.
    הערה: אף על פי שחתיכות SV גדולות יותר עשויות להיות קלות יותר לצילום, בהתחשב באופי העדין של הרקמות, ניתן לצלם חתיכות קטנות יותר (איור 2F,G), ובהתאם לגודל, הן יכולות לעבוד גם להדמיה.
  11. השתמש #55 מלקחיים כדי להניח את הקיר לרוחב שטוח. ה- SV צריך להיראות כשכבה כהה יותר של רקמה בצד הפנימי של הקיר הצידי.
    הערה: משתמשים עשויים לגלות, במיוחד קרוב יותר לקצה האפיקאלי, שחלק מרקמת SV מתנתקת אגב מהדופן הצידית לאורך כל הדיסקציה.
  12. חטטו בעדינות בשכבת SV כדי לנתק אותה מהדופן הצידית בקצה הבסיסי שלה (איור 2H). דחפו הצידה בעדינות את ה-SV המנותק והזיזו את המלקחיים עוד יותר לכיוון הקצה האפי של הקיר הצידי, תוך ניתוק ה-SV כסרט אחד ארוך במידת האפשר (איור 2I). אין לסחוט את ה-SV עם מלקחיים כדי למשוך אותו. אם הרקמה שברירית מכדי שניתן יהיה לתפוס אותה, ניתן לחילופין לאסוף אותה באמצעות סקופ רקמה, כגון גרידת כלזיון.
    הערה: הזזת SV צריכה להיעשות תמיד תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח שהוא לא יאבד. היזהר תמיד בעת אחיזה באמצעות מלקחיים בשל הסיכון לנזק. משתמשים עשויים לגלות כי שימוש בגרידת chalazion מפחית את הסיכון לנזק לרקמת SV. לריצוף גרעין יחיד, המשך לסעיף 5. עבור SV immunostaining, המשך לסעיף 7.

5. מתלה SV בעל גרעין יחיד

הערה: פרוטוקול זה מותאם לרקמת SV במיוחד מפרוטוקול השעיה של גרעין יחיד של יצרן שפורסם. ניתן להשתמש בפלטפורמות של יצרנים שונים31. בהינתן וריאציה ספציפית לפלטפורמה, מומלץ לסקור את הפרוטוקול הספציפי ליצרן שסופק עם הציוד. כדי להשיג תוצאות אופטימליות עבור sNuc-Seq ולמזער את פירוק ה-RNA, ככל שדיסקציה של הרקמה מהירה יותר כך טוב יותר (מומלץ תוך 15-20 דקות מהמתת חסד). זה עשוי להיות מועיל להרדים בעל חיים אחד בכל פעם ורק כאשר מוכן לנתח. העובדה שמספר אנשים עובדים בו זמנית על הנתיחות יכולה גם למנוע את זמן ההשפלה (למשל, צוות מעבדה אחד עובד על אוזן שמאל בעוד שאחר עובד על אוזן ימין).

  1. אם רקמת SV תשמש עבור sNuc-Seq, מקם את הרקמה במאגר ליזה מקורר (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.005% nonidet P40 במים ללא נוקלאז).
    הערה: אם יש לבצע ריצוף מיד לאחר הנתיחה, המשך את הפרוטוקול. אם רוצים להשהות את הפרוטוקול, שימור SV אפשרי על ידי הכנסת SV ל-RNAlater. יש לאחסן למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C, ולאחר מכן להקפיא במהירות הבזק בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש מוכן. כאשר המוצר מוכן לשימוש, יש להפשיר ולשטוף פעמיים ב-PBS למשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן להמשיך בהומוגניזציה (שלב 5.2).
  2. הומוגניזציה של הרקמה בהומוגנייזר 2 מ"ל עם 10-20 פעימות על קרח.
    הערה: גליל הזכוכית יבוא במגע ידני עם תחתית צינור הזכוכית ויקטע את ה-SV. SV הוא עדין, ולכן 20 שבץ בדרך כלל משיג הומוגניזציה מוצלחת.
  3. מפזרים את הרקמה על קרח במשך 25 דקות.
    הערה: זמן הליזה משתנה בהתאם לסוג הרקמה. ליזה של 25 דקות ברקמת SV עשויה להשיג כדאיות תאים נמוכה (פחות מ -4%), אך הזמן עשוי להיות מותאם אם הכדאיות התאית גבוהה מדי (שלב 5.8).
  4. סנן דרך מסנן 30 מיקרומטר וסובב את התסנין ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  5. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 1 מ"ל של גרעינים לשטוף חיץ השעיה (1x PBS, 1% אלבומין בסרום בקר [BSA], 0.2U / μL מעכב RNase).
  6. סנן את התאים דרך מסנן 10 מיקרומטר וצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  7. הסר את supernatant ו resuspend ב 50 μL של גרעינים לשטוף ואת חיץ התלייה.
  8. ספרו את הגרעינים באמצעות מונה תאים וצביעה כחולה טריפאן. לדלל 5 μL של תרחיף התא לתוך 50 μL של 1x PBS לספירת תאים; הכדאיות צריכה להיות מינימלית (3%-4%) בשלב זה. אם הכדאיות נמצאה גבוהה יותר, התאימו את הפרוטוקול לשלב 5.3 (ליזיס) ותקננו את זמן הליזה כדי להבטיח ליזה נאותה של התאים.
    הערה: יכולת קיום גבוהה של תאים בהכנת גרעין יחיד פירושה שיש יותר תאים שלמים מהרצוי, וכי ייתכן שיהיה צורך בעיכול נוסף.
  9. טען את הדגימה עם הצפיפות הגרעינית הרצויה על המנגנון/שבב של היצרן (ראה מדריך יצרנים). לכידות של גרעינים בודדים מוכנות כעת.
    הערה: מעכבר בוגר אחד SV, 50 μL של התרחיף בריכוז של 150,000 גרעינים/מ"ל מושגת בדרך כלל.

6. ריצוף גרעין יחיד SV

  1. שלח את הדגימות למתקן הליבה לריצוף.
    הערה: חלק זה של הפרוטוקול עוקב אחר השלבים הכלליים של (1) יצירה וקידוד של חרוזי ג'ל בתחליב (GEM), (2) ניקוי לאחר GEM-RT והגברת cDNA, ו-(3) בניית ספריית ביטוי גנים 3 אינץ'. שאר פרוטוקול sNuc-Seq ארוך יחסית, ומומלץ לקוראים להשתמש בפרוטוקול הספציפי ליצרן שלהם. סביר להניח שמדריך היצרן יתאר שלבים עם פרטים ספציפיים ותמונות נלוות. ייתכנו גם סרטוני 'כיצד לבצע' באתר היצרן. מערכי נתונים שנוצרו עשויים להיות מיוצגים באופן מופחת ממדים, כגון קירוב סעפת אחיד והקרנה (UMAP; איור 3). מעבדות רבות משתמשות בליבת ריצוף שעשויה לבצע פרוטוקול זה עבור משתמשים.

7. SV immunostaining והרכבת רקמות

  1. אם הרקמה תשמש לצביעת חיסון, העבירו אותה לצלחת בת 24 בארות, שקועה ב-200 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-1x PBS, ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: כדאי לבצע את כל ההסרה, השטיפה והצביעה החיסונית של נוזלים מתחת למיקרוסקופ. הדמיה תוך כדי פיפטינג הרקמה תבטיח שהיא לא תאבד בטעות במהלך הסרת נוזלים. ניתן להתאים את נפחי הנוגדנים והשטיפות כל עוד הנפח גדול מספיק כדי להטביע את רקמת SV בתוך התמיסה.
  2. לאחר שלב הקיבוע, הסר את ה- PFA על ידי ביצוע שתי שטיפות קצרות ב- 1x PBS (כ- 500 μL) ב- 4 ° C למשך 5 דקות כל אחת על שייקר מסלול בסל"ד נמוך (30-50). אם מאחסנים, ניתן לאחסן את הרקמה ב-1x PBS ב-4°C.
  3. יש להסיר את ה-PBS ולחדור ולחסום למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר בכ-300 מיקרוליטר של תמיסת PBS-T (0.05 Tween20 ב-1x PBS עם 10% נסיוב בקר עוברי).
    הערה: יש לדלל נוגדנים ראשוניים ומשניים בתמיסת חסימה זו.
  4. מכתימים את הרקמה בנוגדן ראשוני בהתאם למפרט של הנוגדן המסוים בו משתמשים, בדרך כלל לילה ב 4 מעלות צלזיוס . הסר את PBS הנותרים והוסף את הנוגדן הראשוני המדולל.
    הערה: יש לבחור את הדילול על סמך הצעות היצרן, הנתונים שפורסמו, ניסיון קודם וכו'. בדרך כלל, הריכוז הראשון שיש לבדוק הוא דילול של 1:100-200. לדוגמה המוצגת במאמר זה, נוגדני GS-IB4 ו- DAPI דוללו כל אחד בשעה 1:200. אם מכתימים יותר מחלבון אחד, ניתן לשלב נוגדנים ראשוניים מרובים לאותה תמיסה, כל עוד לכל נוגדן ראשוני יש מארח שונה כדי למנוע תגובתיות צולבת של נוגדנים משניים.
  5. שטפו את הנוגדן הראשוני מהרקמה באמצעות כ-500 μL של 1x PBS פעמיים למשך 10 דקות כל אחת על שייקר אורביטלי בסל"ד נמוך.
    הערה: המשך לוודא שרקמת SV שקועה בתמיסה, ולא תקועה בצד הבאר.
  6. מכתים בנוגדן משני בהתאם למפרט הנוגדן המסוים בו משתמשים, בדרך כלל למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי בסל"ד נמוך. כסו את צלחת 24 הבארות כך שהנוגדן המשני המתויג פלואורסצנטית מוגן מפני אור.
    הערה: אם יש צורך ביותר מנוגדן משני אחד, שלב את הנוגדנים המשניים לאותה תמיסה. הקפד להימנע מתיוג צולב.
  7. שטפו את הנוגדן המשני מהרקמה באמצעות כ-500 מיקרוליטר של PBS 1x ארבע פעמים למשך 5 דקות כל אחת על שייקר אורביטלי בסל"ד נמוך. שמור את צלחת 24 בארות מכוסה כדי להגן עליו מפני אור.
  8. הכינו את המגלשה הגדולה יותר (75 מ"מ x 25 מ"מ) על ידי הנחת שני פסים קטנים של דבק לאורך ציר ה-25 מ"מ, קטנים רק מכיסויי הזכוכית הקטנים יותר בגודל 18 מ"מ x 18 מ"מ. הניחו טיפה אחת של מגיב הרכבה (כ-50 מיקרוליטר) בין פסי הדבק.
    הערה: הדבק יוצר כמות קטנה של רווח אנכי כך שכאשר מניחים את הכיסוי השני למעלה, דגימת רקמת SV יכולה להתקיים בבטחה, אך להמשיך להישאר במקומה. בעוד שעובי הסטריה הוא 30-40 מיקרון, יש להימנע מסחיטת הרקמה בין משטחי הזכוכית כדי לשמר מורפולוגיה. לחלופין, ניתן להשתמש גם בסרט שקוף.
  9. באמצעות #55 מלקחיים, לתפוס כמה שפחות רקמות על קצה אחד של SV ולהעביר מן PBS כדי טיפה של מגיב הרכבה על microslide גדול יותר (75 מ"מ x 25 מ"מ). הניחו קצה אחד של מכסה זכוכית קטן יותר (18 מ"מ x 18 מ"מ) על המגלשה שבה הונח פס דבק אחד ושחררו בעדינות כדי למנוע יצירת בועות אוויר. הכיסוי ייפול לפס הדבק השני ויכסה את רקמת SV.
  10. אטמו את התושבת על ידי טבילת טיפה של לק שקוף בכל פינה של התושב. תייגו את הדגימה בהתאם על כיסוי הזכוכית הרחק משדה ההדמיה. כעת הוא מוכן למיקרוסקופ קונפוקלי (איור 4).
  11. דמיינו את רקמת SV באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה כדי לוודא שהיא מונחת שטוחה ולא ליד בועות אוויר. אם רקמת SV אינה מכוונת כראוי, המשתמש יכול לנסות לדחוף החוצה בועות אוויר או להסיר בזהירות את כיסוי הזכוכית הקטן יותר ולמקם מחדש את ה- SV. יש לעשות זאת בעדינות כדי למנוע שבירת כיסויי הזכוכית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אנו מציגים שיטה לבודד את SV לשימוש עבור sNuc-Seq או immunostaining. האנטומיה הרלוונטית (איור 1) של השבלול ביחס ל-SV יכולה לעזור למשתמשים להבין טוב יותר את הארגון של SV ואת השלבים של פרוטוקול הדיסקציה.

כל שלב של מיקרו-דיסקציה זו של SV מעכבר P30 מפורט בווידיאו המשויך, ותצלומי בזק של שלבי המפתח של הדיסקציה והבידוד של SV מוצגים באיור 2.

sNuc-Seq שימושי בחקירת פרופיל השעתוק של התאים השונים ב-SV ההטרוגני. דרך אחת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לפני הופעתו של ריצוף תא יחיד, חוקרים רבים השתמשו בניתוח רקמות בתפזורת, אשר איפשר רק לנתח תעתיקים ממוצעים על פני תאים. בפרט, תא בודד ו- sNuc-Seq אפשרו לבודד את התעתיק של תא בודד או גרעין יחיד, בהתאמה32. במקרה זה, ניתן לזהות תעתיקי גרעין יחיד עבור תאים שוליים, בינוניים ובזאליים, כמו גם תאי ציר30. זה מאפשר לחקור הטרוגניות שעתוק בין סוגי תאים SV וניתן להשתמש בו בעתיד כדי לחקור את התרומה של סוגי תאים אלה לתפקוד SV, כולל יצירה ותחזוקה של EP. מערכי נתונים שנוצרו באמצעות sNuc-Seq י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר האינטרמורלית של ה-NIH, NIDCD to M.H. (DC000088)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10 ומיקרו; מסנן m (Polyethylenterephthalat)PluriSelect#43-50010-01רקמת סינון במהלך sNuc-Seq
18 x 18 מ"מ כיסוי זכוכיתפישר סיינטיפיק12-541Aהחלקת כיסוי להרכבה SV
30-µ מסנן m (Polyethylenterephthalat)PluriSelect#43-50030-03סינון רקמות במהלך sNuc-Seq
75 x 25 מ"מ Superfrost Plus/Colorforst Plus MicroslideDaiggerEF15978Z-Microslide להרכבת SV על
עכברי C57BL/6JThe Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:000664זן עכבר לשימוש כללי שיש לו פיגמנט שנראה ביתר קלות בתאי הביניים של ה-SV.
Cell CounterLogos BiosystemsL20001משמש לספירת תאים
Chalizon curette 5 '', גודל 3 2.5 מ"ממכשירי מחקר ביו-רפואיים15-1020משמש להעברת SV
כרום הבא GEM תא יחיד 3' ערכת GEM v3.1כרוםPN-1000141מייצר ספריות ביטוי גנים של תא יחיד 3'
לק שקוףפישר סיינטיפיקNC1849418משמש לאיטום SV mount
Corning Falcon כלי תרבית רקמות סטנדרטיים, 24 בארצלחת תרבית קורנינג08-772Bהמשמשת להחזקת דגימה במהלך דיסקציה
DAPIInvitrogenD1306, RRID: AB_2629482כתם המשמש לתיוג גרעין
הומוגנייזרDounce Sigma-AldrichD8938משמש להומוגניזציה של רקמות עבור sNuc-seq
Dumont #5 מלקחייםFine Science Tools11252-30מלקחיים כלליים לדיסקציה
Dumont #55 מלקחייםFine ScienceTools 11255-20מלקחיים עם קצה עדין המקל על מניפולציה של SV
סרום בקר עובריThermoFisher16000044משמש לשלבים של מקל דבק sNuc-Seq
Fisher ScientificNC0691392משמש להרכבת
נוגדן SV GS-IB4 מולקולרי בדיקותI21411, RRID: AB-2314662נוגדן המשמש לתיוג נימי
KCNJ10-ZsGreen עכבריםn/an/a עכברטרנסגני המבטא KCNJ10-ZsGreen, באופן חלקי בתאי הביניים של ה-SV.
MgCl2ThermoFisherAM9530Gמשמש לשלבים של sNuc-Seq
מגיב הרכבהThermoFisher#S36940מגיב הרכבה לצלחת SV
Multiwell 24 בארCorning#353047צלחת המשמשת לצביעה חיסונית
NaClThermoFisherAAJ216183משמש לשלבים של sNuc-Seq
Nonidet P40Sigma-Aldrich9-16-45-9משמש לשלבים של sNuc-Seq
מים ללא נוקלאזThermoFisher4387936משמש לשלבים של שייקר אורביטלי sNuc-Seq
Silent ShakeSYC-2102Aמשמש לשלבים של צביעה חיסונית
PBSThermoFisherJ61196. APמשמש לשלבים של צביעה חיסונית ודיסקציה
RNA מאוחר יותרInvitrogenAM7021משמש לשימור SV עבור sNuc-Seq
ScizzorsFine Science Tools14058-09משמש לפיצול גולגולת עכבר
Tris-HClSigma-Aldrich15506017משמש לשלבים של sNuc-Seq
Trypan כתם כחולGibco15250061משמש לספירת תאים
Tween20ThermoFisherAAJ20605AP משמש לשלבים של sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo סטריאומיקרוסקופZeissn/aמיקרוסקופ המשמש לנתיחות

מקורות

  1. Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).
  2. Patuzzi, R. Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential. Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).
  3. Wangemann, P. K+ cycling and the endocochlear potential. Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).
  4. Adachi, N., et al. The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear. The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).
  5. Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).
  6. Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).
  7. Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. The human "cochlear battery"-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239(2017).
  8. Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).
  9. Spicer, S. S., Schulte, B. A. Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity. Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).
  10. Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).
  11. Yoshida, T., et al. The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential. Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).
  12. Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hearing Research. 428, 108682(2023).
  13. Kim, J., Ricci, A. J. In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119(2022).
  14. Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models. Physiology. 24, 307-316 (2009).
  15. Chen, J., Zhao, H. B. The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss. Neuroscience. 265, 137-146 (2014).
  16. Steel, K. P., Barkway, C. Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear. Development. 107 (3), 453-463 (1989).
  17. Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome. Neuroscience. 310, 188-197 (2015).
  18. Gu, S., et al. Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 18100(2020).
  19. Gow, A., et al. Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function. The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).
  20. Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).
  21. Faridi, R., et al. Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome. Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).
  22. Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Medicine. 2, 30(2004).
  23. Kitajiri, S. -I., et al. Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear. Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).
  24. Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).
  25. Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y. Tissue-resident macrophages in the stria vascularis. Frontiers in Neurology. 13, 818395(2022).
  26. Zhang, J., et al. VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss. JCI Insight. 6 (8), e143285(2021).
  27. Shi, X. Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review). Hearing Research. 338, 52-63 (2016).
  28. Gu, S., et al. Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis. Frontiers in Neurology. 12, 630561(2021).
  29. Fischer, J., Ayers, T. Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).
  30. Korrapati, S., et al. Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316(2019).
  31. Pyle, M. P., Hoa, M. Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review. Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).
  32. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
  33. Shafer, M. E. R. Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175(2019).
  34. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317(2019).
  35. Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
  36. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).
  37. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).
  38. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Stria Vascularis
דיסקציה של Stria vascularis עכבר בוגר עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.