שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

Summary

מספר שיטות נפוצות מוצגות כאן כדי לחקור את אירועי הסחר בקרום של קולטן פלזמה קינאז. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים מפורטים הכוללים את הכנת החומר הצמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית.

Abstract

בתאים אאוקריוטים, מרכיבי הממברנה, כולל חלבונים ושומנים, מועברים באופן מרחבי-זמני ליעדם בתוך מערכת האנדוממברנה. זה כולל הובלה הפרשה של חלבונים מסונתזים חדשים אל פני התא או אל מחוץ לתא, הובלה אנדוציטית של מטענים חוץ-תאיים או רכיבי קרום פלזמה לתוך התא, והובלה מיחזור או העברה של מטענים בין האברונים התת-תאיים וכו'. אירועי סחר בממברנות חיוניים להתפתחות, צמיחה והסתגלות סביבתית של כל התאים האיקריוטים, ולכן הם נמצאים תחת רגולציה מחמירה. קינאזות קולטן פני השטח של התא, אשר קולטות אותות ליגנד מהמרחב החוץ-תאי, עוברות הן הובלה הפרשה והן הובלה אנדוציטית. גישות נפוצות לחקר אירועי סחר בממברנות באמצעות קינאז קולטן לאוצין עשיר בחזרת פלזמה, ERL1, מתוארות כאן. הגישות כוללות הכנת חומר צמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית. כדי לעקוב אחר הוויסות המרחבי-זמני של ERL1, מחקר זה מתאר את ניתוח הלוקליזציה המשותפת בין ERL1 לבין חלבון סמן גוף רב-שלפוחיתי, RFP-Ara7, ניתוח סדרות הזמן של שני חלבונים אלה, וניתוח מחסנית z של ERL1-YFP שטופל במעכבי סחר בקרום ברפלדין A וורטמנין.

Introduction

תנועת ממברנות היא תהליך תאי שמור המפיץ רכיבי ממברנה (הידועים גם בשם מטענים), כולל חלבונים, שומנים ומוצרים ביולוגיים אחרים, בין אברונים שונים בתוך תא אאוקריוטי או על פני קרום הפלזמה אל החלל החוץ תאי וממנו¹. תהליך זה מתאפשר על ידי אוסף של ממברנות ואברונים הנקראים מערכת האנדוממברנה, המורכבת מקרום הגרעין, הרשתית האנדופלסמית, מנגנון גולג'י, החללית / ליזוזומים, קרום הפלזמה ואנדוזומים מרובים¹. מערכת האנדוממברנה מאפשרת שינוי, אריזה ושינוע של רכיבי הממברנה באמצעות שלפוחיות דינמיות העוברות בין אברונים אלה. אירועי סחר בממברנות חיוניים להתפתחות תאים, גדילה והסתגלות סביבתית, ולכן הם נמצאים תחת רגולציה מחמירה ומורכבת². כיום, גישות רבות בביולוגיה מולקולרית, ביולוגיה כימית, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסות פותחו ויושמו בתחום הסחר בממברנות וקידמו מאוד את ההבנה של הוויסות המרחבי-זמני של מערכת האנדוממברנה ^3,4. ביולוגיה מולקולרית משמשת למניפולציות גנטיות קלאסיות של שחקנים פוטנציאליים המעורבים בסחר בממברנה, כגון שינוי ביטוי הגנים של החלבון המעניין או תיוג החלבון המעניין בתגים מסוימים. כלים בביולוגיה כימית כוללים שימוש במולקולות המפריעות באופן ספציפי לתנועה של נתיבים מסוימים ^4,5. ספקטרומטריית מסות היא רבת עוצמה לזיהוי הרכיבים באברון שבודד מכנית על ידי גישות ביוכימיות ^3,4. עם זאת, תנועת הממברנות היא תהליך ביולוגי דינמי, מגוון ומורכב¹. כדי להמחיש את תהליך הסחר בקרום בתאים חיים בתנאים שונים, מיקרוסקופ אור הוא כלי חיוני. התקדמות מתמדת נעשתה בטכניקות מיקרוסקופ מתקדמות כדי להתגבר על האתגרים במדידת היעילות, הקינטיקה והמגוון של האירועים⁴. כאן, מחקר זה מתמקד במתודולוגיות המקובלות בביולוגיה כימית/פרמקולוגית, ביולוגיה מולקולרית ומיקרוסקופ לחקר אירועי סחר בממברנות במערכת פשוטה ונגישה באופן טבעי, תהליך ההתפתחות הסטומטאלי.

סטומטות הן מיקרו-נקבוביות על משטחים אוויריים של צמחים שנפתחים ונסגרים כדי להקל על חילופי הגזים בין התאים הפנימיים לסביבה ^6,7,8. לפיכך, הפיוניות חיוניות לפוטוסינתזה ולטרנספירציה, שני אירועים חיוניים להישרדות הצמח ולצמיחתו. התפתחות סטומטית מותאמת באופן דינמי על ידי רמזים סביבתיים כדי לייעל את הסתגלות הצמח לסביבה⁹. זיהוי חלבון הקולטן Too Many Mouths (TMM), שראשיתו במחקרים בשנת 2002, פתח את הדלת לעידן חדש של חקירת המנגנונים המולקולריים של התפתחות סטומטית בצמח המודל Arabidopsis thaliana¹⁰. לאחר כמה עשורים בלבד, זוהה מסלול איתות קלאסי. ממעלה הזרם אל במורד הזרם, מסלול זה כולל קבוצה של ליגנדות פפטידים מפרישים ממשפחת גורמי דפוס האפידרמיס (EFP), מספר קינאזות קולטן לאוצין עשיר בחוזר (LRR) ממשפחת EREECTA (ER), חלבון קולטן LRR TMM, מפל MAPK, וכמה גורמי שעתוק bHLH כולל SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA וצעקה (SCRM)^11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. עבודות קודמות מצביעות על כך שאחת הקינאזות של הקולטן, ER-LIKE 1 (ERL1), מדגימה התנהגויות תת-תאיות פעילות בתפיסת EPF²⁰. ERL2 גם נע באופן דינמי בין קרום הפלזמה לבין כמה אברונים תוך-תאיים²⁷. חסימת שלבי תנועת הממברנות גורמת לדפוס סטומטלי לא תקין, וכתוצאה מכך נוצרים אשכולות סטומטיים על פני העלה²⁸. תוצאות אלה מצביעות על כך שתעבורת הממברנות ממלאת תפקיד חיוני בהתפתחות סטומטלית. מחקר זה מתאר פרוטוקול לחקירה מרחבית-זמנית של דינמיקת ERL1 באמצעות ניתוח לוקליזציה תת-תאית של חלבון-חלבון בשילוב עם טיפול תרופתי באמצעות כמה מעכבי סחר בממברנה.

Protocol

1. הכנת הפתרונות

1. הכן תמיסת עיקור זרעים על ידי ערבוב 15 מ"ל אקונומיקה עם 35 מ"ל מים מזוקקים ו 50 מיקרוליטר של טריטון X-100.
2. הכינו תמיסת ברפלדין A (BFA) על ידי המסת אבקת BFA באתנול לריכוז סופי של 10 mM (מלאי). הכן תמיסת וורטמנין (Wm) על ידי המסת אבקת Wm ב- DMSO לריכוז סופי של 10 mM (מלאי).

2. זריעת הזרעים

1. Aliquot 10-50 זרעים מכל אחד מהצמחים הטרנסגניים הדרושים לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של תמיסת עיקור זרעים לכל צינור, וערבב היטב על ידי היפוך הצינור בעדינות במשך 10 דקות על שייקר.
2. השליכו את תמיסת עיקור הזרעים ושטפו את הזרעים ב-1 מ"ל מים מזוקקים חמש פעמים.
3. הוסיפו 300 μL של מים מזוקקים אוטוקלאביים לכל צינור, וזרעו את הזרעים על מצע טרשת נפוצה בחצי חוזק המכיל 1% (w/v) סוכרוז ו-0.75% (w/v) אגר. השלם את המדיום עם אנטיביוטיקה המתאימה לפי הצורך.
4. שמור את הצלחת הפוכה ב 4 ° C בחושך במשך 2 ימים כדי לסנכרן את הנביטה.
5. לאחר יומיים, העבירו את הצלחת לחדר גדילה עם מחזור אור / 8 שעות חושך של 16 שעות (80 μmol / m²/s¹) ב 22 ° C. זה נחשב היום הראשון לאחר הנביטה (1 dpg).
6. שתול את השתילים באדמה ב 10 dpg לצמיחה נוספת.

3. הכנת צמחים טרנסגניים F1 בצבע כפול

1. לגדל צמחים טרנסגניים הומוזיגוטיים הנושאים ERL1-YFP (צמח A) וצמחים טרנסגניים הומוזיגוטיים הנושאים חלבון סמן RFP-Ara7 (צמח B)20 זה לצד זה עד לפריחה בחדר צמיחה עם מחזור אור / 8 שעות כהה (80 μmol^{/ m 2}/s¹) ב ²² ° C.
2. בחרו תפרחת צעירה מצמח A. שמרו על פרח אחד שעומד להיפתח על התפרחת להצלבות גנטיות. מוציאים את כל הפרחים והסיליקים הישנים יותר. בנוסף, הסירו בזהירות את הפרחים הצעירים ואת המריסטמים הפרחוניים כדי למנוע בלבול עתידי.
3. נתחו בעדינות את הפרח שלא נפתח על ידי הסרת עלי הגביע, עלי הכותרת והאבקנים באמצעות זוג פינצטות חדות. השאירו רק את הפיסטיל על התפרחת.
4. לוקחים אבקן בוגר מפרח פתוח על צמח B, ומפקידים את גרגרי האבקה על הצלקת של הפיסטיל המנותח על צמח A.
5. תייגו את הפרח המוצלב ידנית על ידי ציון אביו, אמו ותאריך הצלב הגנטי. תנו לפרח להתבגר, וקצרו את זרעי F1 כאשר הסיליק הופך צהוב/חום (~ 20 יום לאחר הצלב). בדוק אם יש מפעל F1 מוצלח שיש לו גם אותות YFP וגם RFP.

4. טיפול תרופתי

1. לטיפול BFA, הסר את הקוטילדונים של שתילים בני 7 ימים, טבול את שאר השתילים בתמיסת דמה (0.3% אתנול) או בתמיסת BFA של 30 מיקרומטר, החל ואקום למשך דקה אחת ושמור את הדגימה שקועה במשך 30 דקות לפני ההדמיה.
2. לטיפול בוורטמנין, הסר את הקוטילדונים של שתילים בני 7 ימים, טבול את שאר השתילים בתמיסת DMSO 0.25% או וורטמנין 25 mM, החל ואקום למשך דקה אחת ושמור את הדגימה שקועה למשך 30 דקות לפני ההדמיה.
3. לטיפול ואקום של דגימות, בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל, להוסיף 500 μL של פתרון התרופה המתאימה, ולטבול את שתילים מנותחים לתוך הפתרון. חברו בחוזקה מזרק בנפח 10 מ"ל לצינור המיקרוצנטריפוגה, והפעילו ואקום למשך דקה אחת (איור 1). הסר את המזרק, ולשמור את הדגימה בתמיסה למשך הזמן הנדרש. מוציאים בעדינות את השתילים להכנת הדמיה.

איור 1: התקן ואקום פשוט. מזרק 10 מ"ל מחובר לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל לטיפול ואקום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

5. הכנת דגימה להדמיה

1. נתחו את העלה האמיתי מהדגימה שטופלה באמצעות סכין גילוח חד. הניחו בעדינות את העלה האמיתי בטיפת מים על מגלשת זכוכית, והשאירו את הצד האבקסי למעלה. כסו באיטיות את העלה האמיתי עם כיסוי תוך הימנעות מלכידת בועות.

6. הדמיה קונפוקלית

הערה: מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה הפוכה של Leica SP8 שימש לצילום האות הפלואורסצנטי של הדגימות בעבודה זו.

1. הגדרת נתיב אלומה
   1. בחר לייזר של 514 ננומטר לעירור YFP. השתמש בעוצמת לייזר גבוהה כדי להגביר את עוצמת האות, ובכך להשיג איכות תמונה גבוהה. עם זאת, עוצמת לייזר מעל 5% מסתכנת בהלבנה, ובריאות הדגימה עלולה להיפגע. אם אות הדגימה אינו עמום מדי, התחל בעוצמת לייזר נמוכה.
   2. הפעל PMT/HyD לצורך זיהוי, והגדר את ספי פס הפליטה העליון והתחתון בהתבסס על הספקטרום של פלואורופור YFP. הגדר חלון זיהוי של 530-570 ננומטר כדי לאסוף את אות YFP.
   3. הדמיה רציפה לצבע השני: לחצו על כפתור Seq והוסיפו ערוץ חדש. כברירת מחדל, נתיב קרן YFP שתוכנן בעבר יהיה Seq 1. ב- Seq 2, בחר לייזר של 561 ננומטר עבור עירור RFP, והגדר חלון זיהוי של 570-630 ננומטר כדי לאסוף את אות ה- RFP.
2. הגדרת תנאי סריקה (איור 2)
   1. כדי לדמות את פעילות התנועה של הממברנה התת-תאית בתוך תאים מקדימים סטומאטליים, בחר עדשת Corr 63x/1.2 W במערכת לצורך הדמיה.
   2. התבנית מתייחסת לגודל התמונה בפיקסלים. התחל עם 1,024 פיקסלים x 1,024 פיקסלים, ולאחר מכן מטב זאת בהתבסס על גורם הזום והגדרות המטרה לקבלת רזולוציה טובה של איכות פרסום.
   3. המהירות מתייחסת למהירות ראש הסריקה כאשר הלייזר עובר מעל כל פיקסל. למרות שמהירויות סריקה איטיות גורמות לעתים קרובות ליחס אות לרעש טוב יותר, ייתכן שהן לא ילכדו ביעילות את אירועי הסחר בממברנות המשתנים במהירות. התחל במהירות של 400 הרץ, ובצע אופטימיזציה זו בהתבסס על המצב הספציפי של הדגימות.
   4. מקדם הזום משמש להתקרבות של אזור עניין מבלי לשנות את עדשת המטרה. התחל עם מקדם זום של 1, ומטב אותו בהתאם לצרכים הספציפיים של הניסוי.
   5. ממוצע הקו מתייחס למספר הפעמים שכל קו X ייסרק כדי לקבל תוצאה ממוצעת. ממוצע קו גדול יותר מפחית את הרעש בתמונה המתקבלת, אך גם מאריך את זמן הסריקה ואת זמן החשיפה לאור הלייזר. כדי לדמות אירועי סחר בממברנה, אל תשתמש בממוצע קו גבוה. התחל עם ממוצע שורות פי 2, ומטב לפי הצורך.
3. איסוף סדרת זמן
   הערה: כאשר חוקרים אירועי סחר בממברנה, לעתים קרובות יש צורך בסדרת זמן כדי לתעד את התנועה המהירה של האנדוזומים התת-תאיים.
   1. במצב רכישה, בחר במצב סריקה xyt כדי להפעיל את כלי השירות של סידרת הזמן.
   2. החלט על תקופת המתנה בין נקודות הזמן תחת מרווח זמן. לחלופין, לחץ על מזער כדי לצלם את התמונות מיד בזו אחר זו. מרווח זמן של 7 שניות שימש בניסוי סדרת הזמן הבאה.
   3. בחר משך זמן והזן את הזמן הכולל להפעלת הניסוי. לחלופין, הגדר את מספר המסגרות שייאספו על-ידי בחירה באפשרות 'מסגרות ' (איור 3).
4. כדי לאסוף את המידע התלת-ממדי בנוגע לאירוע הסחר בממברנה בתוך התא כולו, השתמש במצב סריקה Z-stack. הקרנת העוצמה המרבית של תמונות מחסנית Z משמשת לעתים קרובות לניתוח.
   1. בחר את מצב הסריקה xyz במצב רכישה, ולאחר מכן כלי השירות Z-Stack יהפוך לנגיש.
   2. בחר באפשרות Z-wide. תחת מצב סריקה, הגדר את התמונה העליונה ואת התמונה התחתונה של ערימת Z באמצעות הלחצנים התחלה וסיום.
   3. הגדר את העובי של z-step על ידי לחיצה על גודל z-step. לחלופין, הגדירו כמה תמונות לצלם כדי לכסות את כל הטווח של ערימת Z. כדי להבטיח עקביות בין הדגימות, הגדירו את גודל שלב z (איור 4).
5. עיבוד תמונה
   1. הקרנת העוצמה המרבית של תמונות z-stack נוצרת על ידי התוכנה הקונפוקלית (http://www.leica-microsystems.com). בכרטיסייה ראשית תהליך , בחר תחילה את קובץ z-stack המעוניין תחת הכרטיסייה פתיחת פרויקטים בצד שמאל קיצוני. לאחר מכן, עבור לכרטיסייה האמצעית בשם Process Tools, בחר את פונקציית ההקרנה , בחר Maximum בחלונית הנפתחת של Method, ולחץ על הלחצן Apply . תמונת הקרנה של מחסנית z תיווצר תחת הכרטיסיה פרוייקטים פתוחים.
   2. הווידאו של תמונות סדרת הזמן נוצר על ידי פיג'י (https://imagej.net/Fiji). בכרטיסיה קובץ , השתמש בפונקציה פתח כדי לפתוח את כל התמונות של סדרות הזמן בסדר הנכון. בכרטיסייה תמונה , אתר את הפונקציה Stack ובחר Images to stack כדי ליצור סרטון. שמור את הקובץ בתבנית .avi עם קצב המסגרות הרצוי (5 מסגרות לשנייה לווידאו 1).

איור 2: לוח מצב הסריקה של ממד XY. החלונית 'מצב סריקה' משמשת להגדרת תנאי סריקת התמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: כלי השירות של סדרת הזמן במצב סריקה xyt. כלי השירות Time Series משמש להגדרת תנאי ההדמיה לאיסוף רצף של סידרת תמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: כלי השירות z-stack במצב סריקה xyz. כלי השירות z-stack משמש להגדרת תנאי הדמיה לאיסוף סדרה של תמונות על ציר z. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Results

מחקר קודם הצביע על כך ש-ERL1 הוא קולטן קינאז פעיל שעובר אירועי סחר דינמיים בממברנות²⁰. ERL1 הוא קינאז קולטן LRR טרנסממברנה על קרום הפלזמה. ERL1 מסונתז חדש ברשתית האנדופלסמית מעובד בגופי גולג'י ומועבר הלאה לקרום הפלזמה. מולקולות ERL1 על קרום הפלזמה יכולות לקלוט ליגנדות EPF באמצעות תחום LRR^{חוץ-תאי 18}. עם הפעלתו על ידי EPF מעכבים, כולל EPF1, ERL1 מופנם לתוך אנדוזומים, מועבר לגוף הרב-שלפוחית (MVB), ולאחר מכן מועבר לתוך vacuoles עבור השפלה כדי לסיים את האות²⁰

Discussion

מערכת האנדוממברנה מפרידה את הציטופלסמה של התא האיקריוטי לתאים שונים, מה שמאפשר את התפקוד הביולוגי המיוחד של אברונים אלה. כדי להעביר חלבוני מטען ומקרומולקולות ליעדם הסופי בזמן הנכון, שלפוחיות רבות מונחות לעבור בין אברונים אלה. אירועי סחר בממברנות מוסדרים מאוד ממלאים תפקידים בסיסיים בכדאיות, התפתחות וצמיחה של תאים. המנגנון המסדיר את התהליך החיוני והמסובך הזה עדיין אינו מובן.

תוארו כאן מספר גישות לצפייה בלוקליזציה תת-תאית של חלבוני ממברנה, ניתוח הקו-לוקליזציה בין שני חלבוני ממברנה המתויגים בחלבונ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מזרקים 10 מ"ל	VWR	BD309695	דגימות ואקום
ברפלדין A (BFA)	Sigma	B7651	סחר בממברנה סמים
מיקרוסקופ קונפוקלי	Leica	Lecia SP8 TCS עם חבילת תוכנה LAS-X	הדמיה
מלקחיים לניתוח	VWR	82027-402	צלב גנטי
פיג'י	NIH	https://imagej.net/Fiji	תוכנת עיבוד תמונה
Leica LAS AF Leica		http://www.leica-microsystems.com	עיבוד תמונה
זרעים טרנסגניים של ERL1-YFP			Qi, X. et al. הפעולות הרבות של פפטידי איתות על דינמיקה תת-תאית של קולטן מציינות את גורל תאי הפיוניות. אלייף. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
זרעים טרנסגניים של RFP-Ara7			Ebine, K. et al. מסלול סחר ממברנה המווסת על ידי RAB GTPase ARA6 הספציפי לצמח. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	סם סחר בממברנה