הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זילוח דם מהיר יעיל בקסנופוס

6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65287

⸱

16 במאי 2023

 , 
1Department of Systems Biology, Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

מוצג כאן פרוטוקול יעיל של זילוח דם מהיר להכנת דגימות רקמה מצפרדעים אפריקאיות בעלות טפרים למחקרי שעתוק ופרוטאומיקה.

תקציר

קסנופוס הם יצורי מודל רבי עוצמה להבנת התפתחות ומחלות של בעלי חוליות כבר למעלה מ-100 שנה. כאן מוגדר פרוטוקול זילוח דם מהיר בקסנופוס, שמטרתו הפחתה עקבית ודרסטית של הדם בכל הרקמות. הזלוף מתבצע על ידי החדרת מחט ישירות לחדר הלב ושאיבת מלח חוצץ פוספט (PBS) דרך מערכת כלי הדם. ניתן להשלים את ההליך תוך כ -10 דקות לכל חיה. הדם נשלט על ידי כמה חלבונים וסוגי תאים נפוצים מאוד, מה שיוצר בעיות רבות מכיוון שחלבונים אלה מסווים את רוב המולקולות וסוגי התאים האחרים המעניינים. האפיון הניתן לשחזור של רקמות קסנופוס בוגרות עם פרוטאומיקה כמותית ושעתוק חד-תאי יפיק תועלת מיישום פרוטוקול זה לפני דגימת האיברים. הפרוטוקולים לדגימת רקמות מוגדרים בניירות נלווים. נהלים אלה מכוונים לסטנדרטיזציה של פרקטיקות ברחבי Xenopus של מין, גיל ומצב בריאותי שונים, במיוחד X. laevis ו- X. tropicalis.

מבוא

זילוח הגוף כולו של דו-חיים מתבצע באופן שגרתי לצורך שימור וקיבוע 1,2,3,4,5,6. עם זאת, הליכים אלה מתרחשים בקצב המגביל את מספר הדגימות הטריות שניתן לקחת לכל חיה. מטרת עבודה זו היא לפתח פרוטוקול זילוח דם יעיל בקסנופוס, תוך מתן עדיפות למהירות הטכניקה. הפרוטוקול לוקח פחות מ-10 דקות לכל חיה עבור X. tropicalis ופחות מ-15 דקות לכל X. laevis חיה. סדרי העדיפויות המשניים הם קלות השכפול והשימוש בציוד שנרכש בקלות, כך שניתן יהיה לשתף דגימות באיכות גבוהה באופן נרחב בין מעבדות Xenopus.

צפרדעי קסנופוס נמצאות בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי כדי לחקור תהליכים ביולוגיים ופתולוגיים בסיסיים שנשמרו בין מינים. לטטרפוד זה יש קשר אבולוציוני קרוב יותר עם יונקים מאשר מודלים ימיים אחרים, ויש לו ריאות, לב בעל שלושה חדרים וגפיים עם ספרות. הקהילה הבינלאומית משתמשת ביעילות ב- Xenopus כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של מחלות אנושיות באמצעות מודלים מעמיקים של מחלות וניתוח מולקולרי של תפקוד גנים הקשורים למחלות. היתרונות הרבים של קסנופוס כמודל של בעלי חיים הופכים אותם לכלים יקרי ערך לחקר הבסיס המולקולרי של התפתחות אנושית ומחלות; יתרונות אלה כוללים: גודל ביציות ועובר גדול, פריון גבוה, קלות דיור, התפתחות חיצונית מהירה וקלות מניפולציה גנומית. ההערכה היא כי Xenopus חולקים ~80% מהגנים המזוהים של המחלה האנושית7.

בהשוואה למודלים פופולריים של יונקים, Xenopus הוא מודל מהיר וחסכוני, עם קלות של הפלת מורפולינו וזמינות של טרנסגניות יעילות ומוטציות גנטיות ממוקדות באמצעות CRISPR8. ספקטרומטריית מסה כמותית ושעתוק חד-תאי יושמו בהצלחה על עוברי Xenopus9,10, אך אטלס תאים עדכני של Xenopus laevis מראה כי הרכב רוב הרקמות נשלט על ידי סוגי תאי דם 11. על ידי פיתוח טכניקה המשחררת רקמות בקצב מהיר ושימוש במדיה צוננת, טריות הדגימה מושפעת באופן מינימלי מזילוח. זה חשוב במיוחד עבור יישומים שבהם המטרה היא פרופיל mRNA או ביטוי חלבון שאינם מוטרדים פיזיולוגית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו בהתאם לכללים ולתקנות של בית הספר לרפואה של הרווארד IACUC (הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים) (IS 00001365_3).

הערה: למרות שהשיטה העיקרית של המתת חסד המתוארת נחשבת לטכניקה מקובלת להמתת חסד על ידי האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית12, היא לא נמצאה כמובילה להפסקת פעימות לב13. גם השיטה המשנית הנפוצה של פיטום כפול אינה מונעת זאת, וגם לא הוצאת הלב מהחיה. גירוש בעלי חיים מורדמים נחשב לשיטה הומנית ויעילה להמתת חסד מוצלחת12. מכיוון ששמירה על רקמות טריות באמצעות המתת חסד היא המטרה של פרוטוקול זה, מועיל שהלב ימשיך לפעום באמצעות המתת חסד ראשונית עם MS-222, וכי זילוח הוא עצמו שיטת המתת חסד משנית באמצעות המתת חסד.

1. הכנה

  1. ודא שמוסד המחקר אישר את טכניקת המתת החסד והזילוח המתוארת בפרוטוקול זה.
  2. הכינו תמיסה של 5 גרם/ליטר MS-222 (טריקאין מתאן-סולפונט) ו-5 גרם/ליטר נתרן ביקרבונט. הנפח צריך להיות גדול יותר מהנפח הדרוש כדי לכסות לחלוטין את בעלי החיים המורדמים. בדוק את ה- pH כדי לוודא שהוא ≥7.
  3. הכינו 500 μL של 180 U/mL הפרין במי מלח חוצצי פוספט (PBS) לכל X. laevis, או 200 μL לכל X. tropicalis.
  4. לבצע המתת חסד ראשונית על ידי הצבת Xenopus בתמיסה זו (משלב 1.2); החיה תישאר שקועה במשך שעה אחת בסך הכל.
  5. אשר כי Xenopus איבד את תגובת הכאב שלו על ידי צביטת כף הרגל 15 דקות לתוך המתת חסד. אם בעל החיים מגיב, להחזיר אותו לפתרון המתת חסד עד תגובה זו אובדת.
  6. לשקול את Xenopus ולקחת את כל המדידות הנוספות הנדרשות לפני הדגימה.
  7. באמצעות מחט 31 G, להזריק X. laevis עם 250 μL ו X. tropicalis עם 100 μL של 180 U/mL הפרין ב PBS (משלב 1.3) לתוך השרירים של כל גפה קדמית.
  8. הכינו תמיסה של 1 מ"ל/גרם ממשקל בעלי החיים של 54 U/mL הפרין ב-PBS perfusate. אנשים מנוסים יותר עם פרוטוקול זה עשויים לגלות כי פחות מדיה נדרשת כדי להשלים זילוח.
  9. השתמש במחט היפודרמית 22 G כדי לחורר X. laevis, ומחט היפודרמית 25 G עבור X. tropicali s. הקהו את מחט הזילוח על-ידי חיתוך הקצה באמצעות חותכי חוטים (איור 1)14.
    הערה: פעולה זו מפחיתה את הסבירות שהמחט תנקב דרך החדר אם היא מוזזת. בנוסף לקהות, המחט עשויה להיות טחונה מעט עם אבן השחזה או קובץ, אך עדיין להישאר חדה מספיק כדי לחדור את החדר.
  10. הכינו את המשאבה על ידי חיבור המחט החתוכה ומחזור 54 U/mL פרפוזט PBS (משלב 1.8). הקפד לנקות את כל בועות האוויר מהצינור כדי למנוע את האפשרות של תסחיף אוויר, המוביל לירידה ביעילות הזילוח או לכשל (ראה טבלה 1). שמור את אמצעי הזלוף על קרח למשך ההליך.
  11. אם המשאבה אינה ניתנת לתכנות, כאשר המחט במקומה, מדוד את נפח המדיה השאובה תחת ההגדרות השונות כדי לקבוע אילו הגדרות קרובות ביותר ל- 5 מ"ל לדקה ול- 10 מ"ל לדקה. קצבי זרימה אלה ישמשו ללא קשר למין. אם משאבת הזילוח ניתנת לתכנות, כייל אותה עם המחט במקומה, בהתאם להוראות היצרן.
  12. הניחו את משטח הדיסקציה (מגש או יריעת קצף) בשיפוע בתוך מיכל משני, או סדרו אותו כדי להקל על ניקוז הדם.
  13. לאחר שהצפרדע הייתה בתמיסה במשך שעה אחת, המתת חסד ראשונית הושלמה. הסר את הצפרדע ובדוק מחדש את תגובת אובדן הכאב על ידי ביצוע צביטה ברגל.
  14. הניחו את הצפרדע על גבה ונעצו כל איבר (איור 2). אם נדרש שימור רקמת הגפיים, ניתן להניח סיכות דקות דרך הספרות או סיכות בצורת U סביב הגפיים.
  15. בעזרת מספריים דיסקציה, לחתוך דרך העור, במעלה קו האמצע, ולאחר מכן לרוחב, עושה שני דשים. (איור 2)
  16. השתמשו במלקחיים כדי לתפוס את הלינאה אלבה ולמשוך אותה הרחק מהחלל הקואלומי (איור 3). בזהירות להשתמש מספריים לחתוך דרך השרירים. עשו שני דשים מקיר החלל וחתכו או נעצו את כל הדשים מהדרך.
  17. השתמשו במספריים לדיסקציה כדי לחתוך דרך עצמות הקוראקואיד ולחתוך רקמה עודפת כדי לקבל גישה טובה יותר ללב (איור 3).
  18. הלב עדיין צריך לפעום. אם הלב הפסיק לפעום לפני הזילוח, שימו לב שטריות הדגימה נפגעה.

2. זילוח

  1. זהה את הבטן והזז אותה בעדינות כך שהיא נמצאת על גבי האונה השמאלית של הכבד (מימין לצופה), כאשר כלי הדם שלה גלויים למשך ההליך. זהה ריאה ואחז אותה בקצה שלה באמצעות מלקחיים רקמות. משכו את הריאה אל מחוץ לחלל הקואלומי ונעצו אותה דרך הקצה (איור 4). עשו זאת בעדינות, שכן כלי דם שבורים אינם מחוררים היטב. שים לב אם הדם גלוי בתוך האונה, שכן זה ישפיע על היכולת לקבוע את השלמת ההליך.
  2. צלם תמונה של החלל הקואלומי כדי להעריך טוב יותר את יעילות הזילוח ואולי לזהות רקמות חריגות במועד מאוחר יותר.
  3. זהו את קרום הלב הדק ומשכו אותו בעזרת מלקחיים רקמתיים (איור 5). בעדינות לנקב את קרום הלב באמצעות קצה מספריים iridectomy, נזהר לא לחתוך את הרקמות הבסיסיות. מקלפים את קרום הלב הרחק משלושת חדרי הלב.
  4. השתמש במלקחיים כדי לתפוס בעדינות את החדר על ידי קודקודו. הפעילו לחץ מוגבל כך שיהיה מספיק מקום בין משטחי המתיחה של המלקחיים כדי שמחט הזילוח תעבור (איור 6).
  5. הכניסו את המחט דרך סגירת המלקחיים לחדר החדר, תוך זהירות שלא לנקב דרך החדר (איור 7). מהדקים את מלקחיים הרקמה למקומם באמצעות מחזיק מחט באמצעות המוסטט.
    הערה: טכניקה זו מייצבת את מיקום המחט, שהוא עדיין חד. הצמדת המחט ישירות לחדר תגרום גם היא לנזק מיותר, מה שיקשה על הידוק במקרה הצורך (ראה טבלה 1).
  6. התחל את זרימת המשאבה במהירות של כ- 5 מ"ל/דקה. שלושת חדרי הלב ותא המטען העורקי יתחרתו (איור 8; ראו טבלה 1).
  7. עם מספריים, בזהירות lance את auricle ימין (בצד שמאל של הצופה); דם יישפך החוצה. הגדר את קצב הזרימה ל- 5 מ"ל לדקה או הגדל אותו ל- 10 מ"ל לדקה.
  8. המשיכו עד שכלי הדם של הקיבה מתכווצים (ראו טבלה 1), ואז השוו את הפיתול השמאלי של הלב (מימין לצופה). אם קצב הזרימה הוא עדיין 5 מ"ל/דקה, הגדל אותו לכ-10 מ"ל/דקה.
  9. השתמש פיפטה העברה כדי לשטוף את החלל coelomic במדיה זילוח, כדי לעזור לשמור על הראות כדי להעריך טוב יותר את הצבע של perfusate זורם מן auricles.
  10. שמור את המחט במקומה עד שהשקע הזורם מהאוריקלס ברור (ראה טבלה 1) והריאה איבדה את גוונה האדום (ראה טבלה 1; איור 9).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר זילוח מוצלח, כל הרקמות (למעט הכבד בקסנופוס פיגמנטי) יהיו קלות יותר באופן מובהק ורוויות פחות בדם. כלי דם עיקריים יהיו פחות בולטים (איור 10), ורקמות (למעט הכבד) יישטפו בצורה נקייה במאגר לאחר הדגימה. בעוד שביצוע מוצלח של הפרוטוקול יכול בסופו של דבר להיות מאושר רק על ידי איכות הנתונים מדגימות רקמה שהוצאו, מספר בעיות אופייניות, הגורמים האפשריים שלהן ופעולות מתקנות מוצעות מסופקים בטבלת פתרון הבעיות (טבלה 1 ואיור 11).

...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר טכניקות דיסקציה מסורתיות לגישה לחלל הקואלומי. טכניקות אחרות מקובלות גם כן, בתנאי שהן גורמות נזק מינימלי לרקמות, הלב נגיש, והריאה והקיבה גלויים. באופן דומה, ניתן להחליף בקלות את רוב כלי הדיסקציה המפורטים בפריטים דומים.

בעוד שנעשו ניסיונות לייעל את היעילות של הליך זה, התוצאות עשויות להשתנות בהתאם לניסיון ולשונות בין צפרדעים בודדות. היבט מעניין אחד של זילוח דם שנותר מחוץ לתחום מאמר זה הוא כיצד הליך זה בהשוואה לדרכים חלופיות של זילוח עבור בעלי חיים שעוברים ניתוח. משתנה נוסף שלא נח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק OD R24 של NIH OD031956 ומענק NICHD R01 HD073104. אנו מודים לדארסי קלי על דיונים מועילים וקלט ראשוני על פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לסמנתה ג'לברט, ג'יל רלסטון וויל רצן על עזרתם ותמיכתם, כמו גם לשלושת הסוקרים העמיתים האנונימיים שלנו על המשוב שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
זכוכית מגדלת 5x עם נורת LED ומעמדamazon.comאסור לאור B08QJ6J8P1 לייצר חום
צנרת העברה חד פעמיתVWRem>414004-036
ניתוח מלקחיים מחודדים עדיניםפישר Scinetific08-875
חיתוך מספריים פיונט חד, ישר 6.5 אינץ'VWR76457-374
מגש חיתוךFisher Scinetific14-370-284יריעות קלקר הן חלופה מקובלת
מיכל המתת חסדפלסטיק בארה"ב  2860מיכלים אטומים חלופיים
מכסה מיכל המתת חסדפלסטיק ארה"ב  3047
סיכות דיסקציה עדינותמערכות חי מכשורPIN-#3
שימוש כללי במחטים היפודרמיות, 22 GFisher Scientific14-826-5Aעבור X. laevis
מחטים היפודרמיות לשימוש כללי, 25 GFisher Scientific14-826AAעבור X. tropicalis
Heparin, רירית מעי חזיריתMilliporeSigma37-505-410MG
מספריים לכריתת אירית 6 "vwr470018-938מספריים לקשתית הם אלטרנטיבה מקובלת
מתאם Luer ל-barb זכר Luer עם טבעת נעילהamazon.comB09PTX6M2Zיהיה תלוי בצינור המשאבה המשמש
מחזיק מחט Mayo-HegarFisher Scinetific08-966מלקחיים נגד יתושים הם אלטרנטיבה מקובלת
MS-222: סינקאין (לשעבר טריקאין)Pentair AESTRS1
PBS 1xCorning21-040-CV
משאבת נוזל פריסטלטית משאבת מינון 5– 100 מ"ל לדקהamazon.comB07PWY4SM6כל משאבה פריסטלטית המסוגלת לשאוב 5-10 מ"ל לדקה מקובלת
אבן השחזהVWR470150-112אופציונלית; למחטים עמומות
נתרן ביקרבונט, אבקה, USPFisher Scientific18-606-333
מלקחיים לדגימה, משונניםVWR82027-442
פיני T לניתוחפישר ScinetificS99385
מזרקי אינסולין קצרים עדינים במיוחד, חותכי31 G VWRBD328438
חוטים, קוצץ חותך צד חד וחזק במיוחד בגודל 6 אינץ'amazon.comB087P191LP
< פריט מקובל פריט גודל שטיפה

מקורות

  1. Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).
  2. Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
  3. Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
  4. Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
  5. Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
  6. Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
  7. Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154(2019).
  8. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
  9. Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
  10. Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
  11. Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306(2022).
  12. AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37(2020).
  13. Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331(2022).
  14. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).
  15. Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
  16. Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
  17. Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

XenopusPBS
זילוח דם מהיר יעיל בקסנופוס
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.