מאמר שיטה

הליך מבוקר קצב להערכת תפקודים דיאסטוליים תלויי קצב לב במודלים של אי ספיקת לב מורין

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65384

⸱

21 ביולי 2023

 , 
1Department of Cardiovascular Medicine, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Therapeutic Strategy for Heart Failure, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Division of Cardiology, Department of Medicine, The Johns Hopkins Medical Institutions

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר השגת הקשר לחץ-נפח באמצעות קצב טרנס-וושט, המשמש כלי רב ערך בהערכת תפקוד דיאסטולי במודלים עכבריים של אי ספיקת לב.

תקציר

אי ספיקת לב עם מקטע פליטה שמור (HFpEF) הוא מצב המאופיין בתפקוד דיאסטולי וחוסר סובלנות לפעילות גופנית. בעוד שניתן להשתמש בבדיקות המודינמיות או MRI ללחץ גופני כדי לזהות תפקוד דיאסטולי לקוי ולאבחן HFpEF בבני אדם, שיטות כאלה מוגבלות במחקר בסיסי באמצעות מודלים של עכברים. מבחן אימון הליכון משמש בדרך כלל למטרה זו בעכברים, אך תוצאותיו יכולות להיות מושפעות ממשקל הגוף, כוח שרירי השלד והמצב המנטלי. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול קצב פרוזדורים כדי לזהות שינויים תלויי דופק (HR) בביצועים דיאסטוליים ולאמת את התועלת שלו במודל עכבר של HFpEF. השיטה כוללת הרדמה, אינטובציה וביצוע ניתוח לולאת נפח לחץ (PV) במקביל לקצב פרוזדורים. בעבודה זו הוכנס צנתר הולכה בגישה אפית של החדר השמאלי, וצנתר קצב פרוזדורים הוכנס לוושט. לולאות PV בסיסיות נאספו לפני שהדופק הואט עם ivabradine. לולאות PV נאספו ונותחו במרווחים של HR הנעים בין 400 פעימות לדקה עד 700 פעימות לדקה באמצעות קצב פרוזדורים. באמצעות פרוטוקול זה, הדגמנו בבירור ליקוי דיאסטולי תלוי HR במודל HFpEF המושרה מטבולית. הן קבוע זמן ההרפיה (Tau) והן יחסי הלחץ-נפח הדיאסטולי הסופי (EDPVR) החמירו ככל שהדופק גדל בהשוואה לעכברי ביקורת. לסיכום, פרוטוקול מבוקר קצב פרוזדורים זה שימושי לאיתור הפרעות לב תלויות HR. הוא מספק דרך חדשה לחקור את המנגנונים הבסיסיים של תפקוד דיאסטולי במודלים של עכברי HFpEF ועשוי לסייע בפיתוח טיפולים חדשים למצב זה.

מבוא

אי ספיקת לב מהווה גורם מוביל לאשפוזים ומוות ברחבי העולם, ואי ספיקת לב עם מקטע פליטה משומר (HFpEF) מהווה כ-50% מכלל האבחנות של אי ספיקת לב. HFpEF מאופיין בתפקוד דיאסטולי לקוי וסובלנות גופנית לקויה, ואת ההפרעות ההמודינמיות הקשורות, כגון תפקוד דיאסטולי, ניתן לזהות בבירור באמצעות בדיקות המודינמיות לחוצות פעילות גופנית או סריקות MRI 1,2.

במודלים ניסיוניים, לעומת זאת, השיטות הזמינות להערכת הפרעות פיזיולוגיות הקשורות ל- HFpEF מוגבלות 3,4. בדיקת התעמלות הליכון (TMT) משמשת לקביעת זמן ומרחק ריצה, אשר עשויים לשקף המודינמיקה לבבית במאמץ גופני; עם זאת, שיטה זו רגישה להפרעות ממשתנים חיצוניים כגון משקל הגוף, כוח שרירי השלד והמצב המנטלי.

כדי לעקוף מגבלות אלה, פיתחנו פרוטוקול קצב פרוזדורים המזהה שינויים עדינים אך מכריעים בביצועים דיאסטוליים בהתבסס על קצב הלב (HR) ותיקפנו את התועלת שלו במודל עכבר של HFpEF5. מספר גורמים פיזיולוגיים תורמים לתפקוד הלב הקשור לפעילות גופנית, כולל תגובת העצב הסימפתטי והקטכולאמין, הרחבת כלי הדם ההיקפיים, תגובת האנדותל וקצב הלב6. בין אלה, עם זאת, הקשר HR-לחץ (המכונה גם אפקט Bowditch) ידוע כקובע קריטי של תכונות פיזיולוגיות לב 7,8,9.

הפרוטוקול כולל ביצוע ניתוח קונבנציונלי של נפח לחץ בנקודת ההתחלה כדי להעריך את הפונקציה הסיסטולית והדיאסטולית, כולל פרמטרים כגון קצב התפתחות הלחץ (dp/dt), יחסי לחץ-נפח סיסטולי סופי (ESPVR) ויחסי לחץ-נפח קצה דיאסטולי (EDPVR). עם זאת, יש לציין כי פרמטרים אלה מושפעים HR, אשר יכול להשתנות בין בעלי חיים בשל הבדלים בקצב הלב הפנימי שלהם. בנוסף, יש לקחת בחשבון גם את השפעות ההרדמה על משאבי אנוש. כדי להתמודד עם זה, HR היה סטנדרטי על ידי מתן קצב פרוזדורים במקביל עם ivabradine, ומדידות פרמטרים לבביים בוצעו בקצב לב מצטבר. יש לציין כי תגובת הלב תלוית HR הבדילה עכברי HFpEF מעכברי קבוצת הביקורת, בעוד שלא נצפו הבדלים משמעותיים במדידות לולאת PV הבסיסית (באמצעות קצב הלב הפנימי)5.

בעוד פרוטוקול קצב זה עשוי להיראות מסובך יחסית, שיעור ההצלחה שלו עולה על 90% כאשר הוא מובן היטב. פרוטוקול זה יספק דרך שימושית לחקור את המנגנונים הבסיסיים של תפקוד דיאסטולי במודלים של עכברי HFpEF ויעזור בפיתוח טיפולים חדשים למצב זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה של בעלי חיים אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים ופעל בהתאם לתקנות לניסויים בבעלי חיים ופעילויות קשורות באוניברסיטת טוקיו. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57/Bl6J זכרים בני 8-12 שבועות. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). מודל של HFpEF הוקם על ידי מתן דיאטה עתירת שומן במשך 15 שבועות בשילוב עם NG-nitro-L-arginine methyl ester, כפי שתואר קודם10.

1. תכשירי קטטר וכיול לחץ/נפח

  1. מניחים צנתר מוליך במי מלח רגילים, ומחברים אותו למודול המורכב מ-PowerLab 8/35 ומיחידת נפח לחץ (מודול MPVS, ראה טבלת חומרים).
  2. כיול אלקטרוני של הלחץ והנפח באמצעות הקלטה של לחץ קבוע מראש (0 מ"מ כספית ו- 100 מ"מ כספית) ופרמטרי נפח (אלה משתנים בין מודולי MPVS) במודול MPVS 3,11 (ראה גם הוראות היצרן).

2. הכנת בעל חיים לצנתור

  1. הרדמה והנשמה
    1. יש לבצע זריקה תוך צפקית של 5 מ"ג/ק"ג אטומידאט ו-500 מ"ג/ק"ג אורתן (ראו טבלת חומרים) 5-10 דקות לפני אינטובציה.
      הערה: אורתאן, למרות יעילותו כחומר הרדמה במחקרים בבעלי חיים, חשוד כמסרטן בבני אדם. לכן, כאשר אורתן נחוץ להשגת מטרות הניסוי ואין די בחומרים חלופיים, יש לטפל בו בזהירות. אמצעי הגנה מתאימים, כגון לבישת כפפות ומסכות ושימוש במכסה אדים במהלך ההכנה, הם חובה. כחלופה אפשרית, קטמין (80 מ"ג / ק"ג, ip) עשוי להיות מועסק.
    2. הניחו את העכבר בתא הרדמה שהיה רווי בעבר באיזופלורן 2%, והעבירו את בעל החיים לכרית חימום שחוממה מראש ונשמרה בין 38°C ל-40°C עם השראת ההרדמה.
    3. יש לגלח את אזור הניתוח. לאחר מכן, לחטא את אתר הניתוח עם שלושה סיבובים לסירוגין של betadine ואלכוהול.
    4. בצע חתך אופקי (1-2 ס"מ) בצוואר, הבלו את שריר קנה הנשימה, ולחשוף את קנה הנשימה. מעבירים תפר משי כירורגי 2-0 מתחת לקנה הנשימה, מרימים אותו ומבצעים חתך קטן (1-2 מ"מ) כדי לפתוח אותו.
    5. הכניסו צינור אנדוטרכאלי לקנה הנשימה, וחברו אותו למכונת הנשמה המספקת תערובת של 100% חמצן ו-2% איזופלורן (מופחת ל-0.5% עד 1% מאוחר יותר).
  2. החדרת צנתר ורידי מרכזי (CV) והזרקת נוזלים
    1. אתר את הווריד הצווארי הפנימי מתחת לשריר sternocleidomastoid3.
    2. הכנס את הצנתר הוורידי המרכזי, המורכב מצינורית סילסטית PE-10 (ראה טבלת חומרים) המחוברת למחט 30 גרם, לתוך וריד הצוואר.
    3. יש לתת עירוי בולוס של 5-6 מיקרוליטר/גרם של משקל גוף של 10% אלבומין/NaCl במשך 3 דקות, ואחריו קצב עירוי קבוע של 5-10 מיקרוליטר/דקה.
      הערה: שלב זה חיוני למניעת לחץ דם נמוך הנובע מהרחבת כלי הדם ההיקפיים הנגרמת על ידי ההרדמה. וריד הצוואר הפנימי ממוקם בין שריר הסטרנוקלידומסטואיד לעורק התרדמה, והוא נראה בצבע כהה יותר מהעורק.

3. הליך כירורגי לצנתור חדר שמאל (גישת חזה פתוח)

  1. לגלח את האזור הכירורגי של העכבר המורדם. לאחר מכן, לחטא את אתר הניתוח עם שלושה סיבובים לסירוגין של betadine ואלכוהול.
  2. אשר את עומק ההרדמה על ידי ביצוע צביטת בוהן. לאחר מכן, לבצע חתך אופקי (2-3 ס"מ) מתחת לתהליך xiphoid, ולהפריד את העור מקיר החזה באמצעות מספריים קהה.
  3. חותכים את דופן בית החזה לרוחב משני הצדדים באמצעות צריבה חשמלית (ראה טבלת חומרים).
  4. לחשוף את הלב על ידי חיתוך דרך הסרעפת, ולהסיר את קרום הלב בעדינות מהלב באמצעות מלקחיים.
  5. יש להחדיר מחט 27 גרם לקודקוד החדר השמאלי (LV), ולהחדיר לאחור קטטר מוליך לתוך ה-LV דרך חור הנקב.
  6. כוונן את מיקום הצנתר כך שתתקבל לולאת לחץ-נפח בצורת ריבוע.
  7. ודא שהקטטר אינו בא במגע עם השריר הפפילרי כאשר מתרחשים שינויים בתנאי העמסה על ידי בדיקת צורת לולאת ה- PV במהלך חסימת הווריד הנבוב התחתון (IVC).
    הערה: חשיפה נאותה ללב מקלה על ההליך ומסייעת לקבל תצוגה ברורה.

4. הקלטת נתוני לולאת PV וקביעת יחסי לחץ-נפח קצה-סיסטולי (ESPVR) ויחסי לחץ-נפח קצה דיאסטולי (EDPVR)

הערה: הפחתת הטעינה מראש על-ידי חסימת IVC מאפשרת לקבוע את ESPVR ו-EDPVR.

  1. הקלט ונתח את לולאת נפח הלחץ הבסיסית (PV) באמצעות תוכנת LabChart (ראה טבלת חומרים), PowerLab ומודול MPVS לאחר ייצוב אות (5-10 דקות לאחר קנולציה).
  2. בצע חסימת IVC על ידי דחיסת IVC עם מלקחיים, ורשום את לולאת PV במשך לפחות 20 מחזורי לב במהלך חסימת IVC. קבע את ESPVR על ידי התאמת קו רגרסיה ליניארי דרך נקודות הקצה הסיסטוליות של לולאת ה- PV וה- EDPVR על ידי התאמת קו עקלקל דרך הנקודות הדיאסטוליות הסופיות של לולאת ה- PV באמצעות תוכנת LabChart.
    הערה: יש להפסיק את מכונת ההנשמה במהלך חסימת IVC כדי למנוע ממצאים בתנועת הריאות. חומר משותק כמו פנקורוניום (0.5-1 מ"ג / ק"ג) עשוי להיות מועיל כאשר תנועת הריאות מוגזמת ויש להשתמש בו רק לאחר אישור מטוס הרדמה יציב.

5. קצב טרנס-וושט

  1. הכנס צנתר אלקטרודה טטרה-פולרי 2-Fr לוושט, חבר את הצנתר לממריץ דופק (ראה טבלת חומרים), וקבע את סף לכידת הפרוזדורים (בדרך כלל, משרעת הגירוי היא 3 mA, ורוחב הדופק הוא 1 ms).
  2. האט את הדופק מתחת ל-400 פעימות לדקה באמצעות 20 מ"ג/ק"ג איבאברדין (ראה טבלת חומרים) הניתנים תוך צפקית.
  3. לאחר הייצוב, רכשו 20 מחזורי לב רצופים של לולאות PV בקצב שונה מ-400 פעימות לדקה עד 700 פעימות לדקה, עם תוספת של 100 פעימות לדקה; לרכוש את המחזורים מעל 5 דקות בכל קצב קצב.

6. כיול מי מלח וכיול זרימת אבי העורקים

  1. יש להשבית את מכונת ההנשמה, ולתת 5-10 מיקרוליטר של תמיסת מלח היפרטונית דרך הווריד דרך צנתר CV.
  2. תעד את התנודות בלחץ ובנפח במהלך הזרקת המלח, וחשב את ערך ה- VP באמצעות PowerLab 3,11.
  3. חזור על כיול המלח כדי לשפר את הדיוק ואת יכולת השחזור.
  4. סובב את העכבר לצדו השמאלי כדי לא להפריע לאות עוצמת הקול.
  5. בצע כריתת בית החזה הצידית בין Th3 ל-Th5 לכיוון עמוד השדרה, וחתך בעדינות חלק קטן מאבי העורקים היורד בעזרת מלקחיים.
  6. הניחו בדיקת זרימת כלי דם (ראו טבלת חומרים) מעל אבי העורקים כדי למדוד את תפוקת הלב.
    הערה: החישוב המדויק של הנפח המוחלט דורש שימוש בשני סוגים של כיול: כיול מי מלח וכיול זרימת אבי העורקים. חשוב להכיר את הסיכונים הפוטנציאליים הקשורים לעירוי מלח היפרטוני אצל נבדקים בבעלי חיים, שכן העמסת מלח מוגזמת עלולה לגרום לירידה בהתכווצות.

7. המתת חסד

  1. לאחר המחקר, יש להרדים את העכברים תחת מנת יתר של חומר הרדמה באמצעות פריקת צוואר הרחם.
    הערה: כדי להבטיח הפסקה מוחלטת של תפקוד חיוני, משתמשים בשיטה משנית של המתת חסד, כגון exsanguination תחת הרדמה עם קצירת רקמת הלב לאחר מכן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נתוני לולאת PV הבסיסית מוצגים באיור 1 ובטבלה 1. בתחילת המחקר (בהיעדר קצב), לא היו הבדלים משמעותיים בפרמטרים דיאסטוליים כגון קבוע זמן ההרפיה (Tau), קצב השינוי המינימלי בלחץ (dP/dt min) ו-EDPVR בין עכברי הבקרה לעכברי HFpEF. אולם עכברי HFpEF הפגינו לחץ דם גבוה יותר ואלסטיות עורקים (Ea), כפי שמוצג באיור 1, והדגימו לולאת PV טיפוסית בצורת הר במהלך סיסטולה חדרית. יש להבדיל זאת מזינוק שנגרם על-ידי מגע ישיר של שריר החדר במתמר הלחץ (א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מציגים מתודולוגיה להערכת יחסי לחץ-נפח עם יישום של קצב טרנס-וושט. אי סבילות לפעילות גופנית היא אחד המאפיינים העיקריים של HFpEF, אך אין טכניקות זמינות להערכת תפקוד הלב בעכברים במהלך פעילות גופנית. פרוטוקול הקצב שלנו מציע כלי רב ערך לאיתור תפקוד דיאסטולי, שאולי לא נראה לעין בתנאי מנוחה.

כדי להשיג לולאת PV באיכות מדויקת ועקבית, יש לבצע בקפדנות את השלבים הבאים 3,4,5,7,8,11,12,13,14: (1) יש להרדים את בעלי החיים בזהירות<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מקרן פוקודה לטכנולוגיה רפואית (ל- E.T. ו- G. N.) ומענק המחקר המדעי JSPS KAKENHI 21K08047 (ל- E.T).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-0 תפר משי, sterlieAlfresa Pharma Corporation, אוסקה, יפן62-9965-57אספקה כירורגית
2-Fr קטטר אלקטרודה טטרה-פולריפוקודה דנשי, יפן ו-UNIQUE MEDICAL, יפןאספקה כירורגיתבהתאמה אישית
אלבומין בקר סרוםNacalai Tesque, Inc., קיוטו, יפן01859-47שונות
C57/BI6J עכברמעבדת ג'קסוןבעלי חיים
קטטר מוליכותMillar Instruments, יוסטון, טקססPVR 1035
צריבה חשמלית, ערכת סכין צריבה חשמליתאלמן-יפן, אוסקה, יפן1-1861-21אספקה כירורגית
EtomidateTokyo Chemical Industory Co., Ltd., טוקיו יפןE0897הרדמה
S44G ממריץ דופק מרובעAstro-Med, מערב וורוויק, RIציוד קוצב
IsofluraneViatris Inc., טוקיו, יפן8803998הרדמה
IvabradineTokyo Chemical Industory Co., Ltd., טוקיו יפןI0847
שונות LabChart softwareADInstruments, סידני, אוסטרליהLabChart 7ציוד המודינמי
MPVS UltraMillar Instruments, יוסטון, טקססPL3516B49ציוד המודינמי
Pancronium bromideSigma Aldrich Co., סנט לואיס, MO15500-66-0
צינור פוליאתילן הרדמה PE10Bio Research Center  Co. Ltd., טוקיו, יפן62101010אספקה כירורגית
PowerLab 8/35ADInstruments, סידני, אוסטרליהPL3508/Pציוד המודינמי
PVR 1035Millar Instruments, יוסטון, טקסס842-0002ציוד המודינמי
אורטן (אתיל קרבמט)Wako Pure Chemical Industries, Ltd., אוסקה, יפן050-05821
בדיקת זרימת כלי דםטרנסונית, איתקה, ניו יורקMA1PRBציוד כירורגי
מכשיר דשא הרדמה

מקורות

  1. Backhaus, S. J. Exercise stress real-time cardiac magnetic resonance imaging for noninvasive characterization of heart failure with preserved ejection fraction. Circulation. 143 (15), 1484-1498 (2021).
  2. Borlaug, B. A., Nishimura, R. A., Sorajja, P., Lam, C. S. P., Redfield, M. M. Exercise hemodynamics enhance diagnosis of early heart failure with preserved ejection fraction. Circulation. Heart Failure. 3 (5), 588-595 (2010).
  3. Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., David, A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nature Protocols. 3 (9), 1422-1434 (2008).
  4. Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (6), 2198-2206 (2011).
  5. Numata, G., et al. A pacing-controlled protocol for frequency-diastolic relations distinguishes diastolic dysfunction specific to a mouse HFpEF model. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 323 (3), H523-H527 (2022).
  6. Piña, I. L., et al. Exercise and heart failure. Circulation. 107 (8), 1210-1225 (2003).
  7. Georgakopoulos, D., Kass, D. A. Minimal force-frequency modulation of inotropy and relaxation of in situ murine heart. Journal of Physiology. 534 (2), 535-545 (2001).
  8. Takimoto, E., et al. Frequency- and afterload-dependent cardiac modulation in vivo by troponin I with constitutively active protein kinase A phosphorylation sites. Circulation Research. 94 (4), 496-504 (2004).
  9. Meyer, M., Lewinter, M. M. Heart rate and heart failure with preserved ejection fraction: Time to slow β-blocker use? Circulation. Heart Failure. 12 (8), 006213(2019).
  10. Schiattarella, G. G., et al. Nitrosative stress drives heart failure with preserved ejection fraction. Nature. 568 (7752), 351-356 (2019).
  11. Abraham, D., Mao, L. Cardiac pressure-volume loop analysis using conductance catheters in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e52942(2015).
  12. Zhang, B., Davis, J. P., Ziolo, M. T. Cardiac catheterization in mice to measure the pressure volume relationship: Investigating the Bowditch effect. Journal of Visualized Experiments. (100), e52618(2015).
  13. Townsend, D. W. Measuring pressure volume loops in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (111), e53810(2016).
  14. Georgakopoulos, D., Kass, D. A. Estimation of parallel conductance by dual-frequency conductance catheter in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), H47(2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HFpEF

מאמרים קשורים