במחקר זה, יישום כתם נקודה תוכנן לזהות לפטוספירה משלושת הקלאדים העיקריים בדגימות מים. שיטה זו מאפשרת זיהוי של כמויות DNA מינימליות הממוקדות באופן ספציפי על ידי בדיקה המסומנת בדיגוקסיגנין, המזוהה בקלות על ידי נוגדן אנטי דיגוקסיגנין. גישה זו היא כלי רב ערך ומספק למטרות מיון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תגובת שרשרת פולימראז והכלאה של כתם נקודה לזיהוי לפטוספירה בדגימות מים
במאמר זה
סיכום
תקציר
כתם הנקודות הוא טכניקה פשוטה, מהירה, רגישה ורב-תכליתית המאפשרת זיהוי כמויות מינימליות של DNA הממוקדות ספציפית על ידי הכלאת בדיקה בנוכחות DNA נשא. הוא מבוסס על העברת כמות ידועה של DNA לתמיכה מוצקה אינרטית, כגון קרום ניילון, תוך שימוש במנגנון כתם הנקודה וללא הפרדה אלקטרופורטית. לקרומי ניילון יש יתרון של יכולת קשירה גבוהה של חומצות גרעין (400 מיקרוגרם לסמ"ק2), חוזק גבוה, והם טעונים חיובית או ניטרלית. הגשושית המשמשת היא מקטע ssDNA ספציפי ביותר של 18 עד 20 בסיסים ארוכים המסומנים בדיגוקסיגנין (DIG). הגשושית תצומד לדנ"א של לפטוספירה (Leptospira ). לאחר שהגשושית ביצעה הכלאה עם דנ"א המטרה, היא מזוהה על ידי נוגדן אנטי-דיגוקסיגנין, המאפשר את זיהויו בקלות באמצעות פליטותיו המתגלות בסרט רנטגן. הנקודות עם הפליטה יתאימו למקטעי הדנ"א המעניינים. שיטה זו משתמשת בתיוג לא איזוטופי של הבדיקה, אשר עשוי להיות זמן מחצית חיים ארוך מאוד. החיסרון של תווית חיסונית סטנדרטית זו הוא רגישות נמוכה יותר מאשר בדיקות איזוטופיות. עם זאת, היא מתמתנת על ידי צימוד תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ומבחני כתם נקודה. גישה זו מאפשרת העשרת רצף המטרה ואיתורו. בנוסף, ניתן להשתמש בו כיישום כמותי בהשוואה לדילול סדרתי של תקן ידוע. יישום נקודתי לזיהוי לפטוספירה משלושת הקלאדים העיקריים בדגימות מים מוצג כאן. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על כמויות גדולות של מים לאחר שהם רוכזו על ידי צנטריפוגה כדי לספק ראיות לנוכחות של DNA לפטוספירלי. זהו כלי בעל ערך ומספק למטרות סינון כלליות, וניתן להשתמש בו עבור חיידקים אחרים שאינם ניתנים לגידול שעשויים להימצא במים, ובכך לשפר את הבנת המערכת האקולוגית.
מבוא
לפטוספירוזיס בבני אדם מקורו בעיקר במקורות סביבתיים 1,2. נוכחותה של לפטוספירה באגמים, נהרות ונחלים היא אינדיקטור להעברת לפטוספירוזיס בקרב חיות בר, וחיות בית וייצור שעלולות בסופו של דבר לבוא במגע עם גופי מים אלה 1,3,4. יתר על כן, לפטוספירה זוהתה במקורות לא טבעיים, כולל ביוב, עומדים ומי ברז 5,6.
לפטוספירה הוא חיידקמופץ ברחבי העולם 7,8, ותפקיד הסביבה ב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מדגם
- רכז כל דגימת מים בצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל באמצעות צנטריפוגה ב 8,000 x גרם למשך 10 דקות ב -4 ° C. חזור על שלב זה, כמה פעמים שנדרש, כדי לרכז את הדגימה לנפח של 250 μL.
- השתמש בערכת מיצוי ה- DNA בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
- בצע את ה- PCR הספציפי בהתאם לבדיקת כתם הנקודה שתשמש (טבלה 1).
- בצע את ההגברה בצינורות PCR עם נפח סופי של 25 μL המכיל 1 X חיץ, 2.5 יחידות של Taq פולימראז, 1 מיקרומטר של כל פריימר, 0.2 מילימטר של כל dNTP, 1.5 mM MgCl2, ו 100 ng של DNA המטרה מכל דגימת מים או DNA גנומי ייחוס.
- תכנת את תגובת ה-PCR בתרמוסייקלר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להעריך את יעילות הטכניקה, נעשה שימוש בדנ"א גנומי מתרביות טהורות של כל לסרובר לפטוספירה (Leptospira serovar), יחד עם הגשושית הספציפית לקלייד. הממברנות הוכנו עם 100 ננוגרם של DNA גנומי לכל תגובת PCR עבור כל סרובר, ולאחר מכן שמונה דנ"א גנומי של חיידקים שאינם קשורים וריכוזים משתנים של DNA גנומי של סרובאר לפטוספירה אד-הוק . כל בדיקה כללה פקד חיובי, שלילי ושאינו תבנית. דנ"א גנומי לא קשור זה לא הראה זיקה לבדיקות כתם הנקודות. התפלגות הממברנות וקרומי כתם הנקודות מוצגים באיור משלים 2,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השלבים הקריטיים של טכניקת כתם הנקודה כוללים (1) אימוביליזציה של דנ"א, (2) חסימת אתרי הקישור החופשיים על הממברנה עם דנ"א לא הומולוגי, (3) השלמה בין הגשושית לבין מקטע המטרה בתנאי חישול, (4) הסרת הגשושית הבלתי היברידית, ו-(5) גילוי מולקולת הכתב41.
לכתם PCR-Dot-blot יש מגבלות מסוימות, כגון שהטכניקה אינה מספקת מידע על גודל המקטע ההיברידי37, היא דורשת דה-הכלאה של קרום יחיד לפני הכלאה מחדש עם בדיקה שנייה או שלישית, והיא דורשת זמן ומאמץ ניכרים עד לתוצאה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
תודות
אנו אסירי תודה לאוסף לפטוספירה של המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, הפקולטה לרפואה וטרינרית וזואוטכניקה, האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו. אנו אסירי תודה על תרומתם הנדיבה של זני הייחוס לפטוספירה (Leptospira ); Leptospira fainei serovar זן Hurstbridge BUT6 וזן Leptospira biflexa serovar Patoc Patoc I לד"ר Alejandro de la Peña Moctezuma. אנו מודים לד"ר חוסה אנטוניו אוקמפו סרוונטס, מתאם CIBAC, ולצוות על תמיכתם הלוגיסטית. EDT היה תחת תוכנית פרויקט מסוף לסטודנטים לתואר ראשון של האוניברסיטה האוטונומית מטרופוליטן קמפוס Cuajimalpa. אנו מכירים בתוכנת Biorender.com ליצירת איורים 1, 3 עד 9.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים | |||
| Purelink ערכת מיצוי DNA | Invitrogen | K182002 | |
| Gotaq Flexi DNA Polimerase (ערכת PCR Taq פולימראז נקודת קצה) | Promega | M3001 | |
| Whatman נייר סינון, כיתה 1, | Merk | WHA1001325 | |
| ממברנות ניילון, טעון חיובי רול 30 ס"מ x 3 מ | 'Roche | ||
| 11417240001 Anti-Digoxigenin-AP, שברי Fab כבשים פוליקלונל נוגדן ראשוני | Roche | 11093274910 | |
| בסיס בינוני EMJH | Difco | S1368JAA | |
| העשרת לפטוספירה EMJH | Difco | BD 279510 | |
| מגיב חוסם | Roche | 11096176001 | |
| CSPD מוכן לשימוש דיסודיום 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) פניל פוספט | Merk | 11755633001 | |
| חומצה דאוקסיריבונוקלאית מזרע הרינג | Sigma Aldrich | D3159 | |
| מפתח Carestream | Carestream Health Inc | GBX5158621 | |
| Digoxigenin-11-ddUTP | Roche | 11363905910 | |
| EDTA, מלח דיסודיום (דיהידרט) | Promega | H5032 | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fixer Carestream | Carestream Health Inc | GBX 5158605 | |
| מלח נתרן לאוריל סולפט (נתרן דודציל סולפט; SDS) C12H2504SNa | Sigma Aldrich | L5750 | |
| N- Lauroylsarcosine salt נתרן CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa | Sigma אולדריץ' | L-9150 | זהו חומר פעילי שטח אניוני |
| פוליוויניל פירולידון (PVP-40) | סיגמא אולדריץ' | PVP40 | |
| פוליאתילן גליקול סורביטן מונולאורט (טווין 20) | סיגמא אולדריץ' | 9005-64-5 | |
| נתרן כלורי (NaCl) | סיגמא אולדריץ' | 7647-14-5 | |
| נתרן דודציל סולפט (SDS) | סיגמא אולדריץ' | 151-21-3 | |
| נתרן הידרוקסיד (NaOH) | סיגמא אולדריץ' | 1310-73-2 | |
| נתרן פוספט דו-בסיסי (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| טרנספראז טרמינלי, רקומביננטי | Roche | 3289869103 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| SSPE 20X | Sigma-Aldrich | S2015-1L | זה יכול להיות תוצרת בית בעקבות קובץ משלים 6 |
| פריימרים | סיגמא-אולדריץ' | לפי דרישה | עקוב אחר טבלה 1 |
| בדיקות | סיגמא-אולדריץ' | לפי דרישה | עקוב אחר טבלה 1 |
| <חזק>ציוד | |||
| Nanodrop™ ספקטרופוטומטר אחד | Thermo-Scientific | ND-ONE-W | |
| מיקרוצנטריפוגה מקוררת Sigma 1-14K, מתאים לצנטריפוגה של צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ב-14,000 סל"ד | Sigma-Aldrich | 1-14K | |
| פיפטות מתכווננות מחוטאות, טווח 2-20 ומיקרו; l, 20-200 ומיקרו; l | גילסון | מק"ט:F167360 | |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה חד פעמיים 1.5 מ"ל (חיטוי) | Axygen | MCT-150-SP | |
| חד פעמי 600 ומיקרו; l צינורות מיקרוצנטריפוגה (חיטוי) | Axygen | 3208 | |
| קצות פיפטה חד פעמיים 1-10 ומיקרו; l | Axygen | T-300 | |
| קצות פיפטות חד פעמיות 1-200 ומיקרו; l | Axygen | TR-222-Y | |
| מנגנון נקודות כתם Bio-Dot | BIORAD | 1706545 | |
| נייד Hergom יניקה | Hergom | 7E-A | |
| תיבת אור מדעית (אור נראה PH90-115V) | Hoefer | PH90-115V | |
| UV Crosslinker | Hoefer | UVC-500 | |
| Thermo Hybaid PCR אקספרס Thermocycler | Hybaid | ||
| קלטת רדיוגרפית עם לוחית IP 14 X 17 | פוג'י |
מקורות
- Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055(2020).
- Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
