מאמר שיטה

שיטות להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים בהידרוג'לים בקנה מידה מאקרו

DOI:

10.3791/65500

⸱

23 ביוני 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מציגים שני פרוטוקולים להטמעת תגובות סינתזת חלבונים נטולי תאים במטריצות הידרוג'ל בקנה מידה מאקרו ללא צורך בפאזה נוזלית חיצונית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רשתות גנים סינתטיות מספקות פלטפורמה למדענים ומהנדסים לתכנן ולבנות מערכות חדשניות עם פונקציונליות המקודדת ברמה גנטית. בעוד הפרדיגמה השלטת לפריסת רשתות גנים היא בתוך שלדה תאית, רשתות גנים סינתטיות עשויות להיות פרוסות גם בסביבות נטולות תאים. יישומים מבטיחים של רשתות גנים נטולות תאים כוללים ביו-חיישנים, שכן התקנים אלה הוכחו נגד מטרות ביוטיות (נגיפי אבולה, זיקה ו-SARS-CoV-2) וא-ביוטיות (מתכות כבדות, סולפידים, חומרי הדברה ומזהמים אורגניים אחרים). מערכות נטולות תאים נפרסות בדרך כלל בצורה נוזלית בתוך כלי תגובה. היכולת להטמיע תגובות כאלה במטריצה פיזיקלית, לעומת זאת, עשויה להקל על היישום הרחב יותר שלהן בקבוצה רחבה יותר של סביבות. לשם כך פותחו שיטות להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) במגוון מטריצות הידרוג'ל. אחד המאפיינים העיקריים של הידרוג'לים התורמים לעבודה זו הוא יכולת הבנייה מחדש של מים גבוהים של חומרי הידרוג'ל. בנוסף, הידרוג'לים הם בעלי מאפיינים פיזיקליים וכימיים המועילים מבחינה תפקודית. ניתן לייבש הידרוג'לים בהקפאה לאחסון ולהתייבש מחדש לשימוש מאוחר יותר. מוצגים שני פרוטוקולים שלב אחר שלב להכללה ובדיקה של תגובות CFPS בהידרוג'לים. ראשית, ניתן לשלב מערכת CFPS בהידרוג'ל באמצעות התייבשות עם ליזט תא. לאחר מכן ניתן להשרות או לבטא את המערכת בתוך ההידרוג'ל באופן קונסטיטוטיבי לביטוי חלבוני מלא באמצעות ההידרוג'ל. שנית, ניתן להחדיר לליזט התא הידרוג'ל בנקודת הפילמור, וניתן לייבש את המערכת כולה בהקפאה ולהתייבש מחדש בנקודה מאוחרת יותר באמצעות תמיסה מימית המכילה את השראת מערכת הביטוי המקודדת בתוך ההידרוג'ל. לשיטות אלה יש פוטנציאל לאפשר רשתות גנים נטולות תאים המקנות יכולות חושיות לחומרי הידרוג'ל, עם פוטנציאל לפריסה מעבר למעבדה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביולוגיה סינתטית משלבת דיסציפלינות הנדסיות מגוונות כדי לתכנן ולהנדס חלקים, התקנים ומערכות מבוססי ביולוגיה שיכולים לבצע פונקציות שאינן נמצאות בטבע. רוב גישות הביולוגיה הסינתטית עדיין קשורות לתאים חיים. לעומת זאת, מערכות ביולוגיה סינתטית נטולות תאים מאפשרות רמות חסרות תקדים של שליטה וחופש בתכנון, ומאפשרות גמישות מוגברת וקיצור זמן להנדסת מערכות ביולוגיות תוך ביטול רבים מהאילוצים של שיטות מסורתיות לביטוי גנים מבוססי תאים 1,2,3. CFPS נמצא בשימוש במספר גדל והולך של יישומים על פני דיסציפלינות רבות, כולל בניית תאים מלאכותיים, אב טיפוס של מעגלים גנטיים, פיתוח biosensors, וייצור מטבוליטים 4,5,6. CFPS היה גם שימושי במיוחד לייצור חלבונים רקומביננטיים שאינם יכולים להתבטא בקלות בתאים חיים, כגון חלבונים נוטים לצבירה, חלבונים טרנסממברנליים וחלבונים רעילים 6,7,8.

CFPS מבוצע בדרך כלל בתגובות נוזליות. עם זאת, זה עשוי להגביל את פריסתם במצבים מסוימים, שכן כל מכשיר נוזלי ללא תאים חייב להיות כלול בתוך כלי תגובה. הרציונל לפיתוח השיטות שהוצגו כאן היה לספק פרוטוקולים חזקים להטמעת התקנים ביולוגיים סינתטיים נטולי תאים בהידרוג'לים, לא כפלטפורמה לייצור חלבונים כשלעצמה, אלא לאפשר שימוש בהידרוג'לים כמארז פיזי לפריסת התקנים נטולי תאים מעבר למעבדה. לשימוש בהידרוג'לים כמארז CFPS יש מספר יתרונות. הידרוג'לים הם חומרים פולימריים שלמרות תכולת מים גבוהה (לפעמים מעל 98%), הם בעלי תכונות מוצקות 9,10,11. יש להם שימושים כמו משחות, חומרי סיכה ודבקים והם נמצאים במוצרים מגוונים כמו עדשות מגע, תחבושות פצעים, סרטי דבק ימיים, משפרי קרקע וחיתולים לתינוקות 9,11,12,13,14. הידרוג'לים נמצאים גם הם תחת חקירה פעילה כרכבי משלוח סמים 9,15,16,17. הידרוג'לים עשויים גם להיות תואמים ביולוגית, מתכלים, ויש להם כמה תגובות גירוי משלהם 9,18,19,20. לכן, המטרה כאן היא ליצור סינרגיה בין פונקציונליות הנגזרת מביולוגיה מולקולרית לבין מדע החומרים. לשם כך נעשו מאמצים לשלב ביולוגיה סינתטית נטולת תאים עם מגוון חומרים, כולל קולגן, לפוניט, פוליאקרילאמיד, פיברין, פפטיד PEG ואגרוז 11,21,22, כמו גם לצפות משטחי זכוכית, נייר ובד 11,23,24 עם מכשירי CFPS. הפרוטוקולים המוצגים כאן מדגימים שתי שיטות להטמעת תגובות CFPS במטריצות הידרוג'ל בקנה מידה מאקרו (כלומר, >1 מ"מ), תוך שימוש באגרוז כחומר לדוגמה. אגרוז נבחרה בשל יכולת ספיגת המים הגבוהה שלה, תכונות הג'ל העצמי המבוקרות והתכונות המכניות הניתנות לכוונון 11,24,25,26. Agarose תומך גם CFPS פונקציונלי, הוא זול יותר מאשר חלופות הידרוג'ל רבות אחרות, והוא מתכלה, מה שהופך אותו בחירה אטרקטיבית כמערכת מודל ניסיוני. עם זאת, שיטות אלה הוכחו בעבר כמתאימות להטמעת CFPS במגוון הידרוג'לים חלופיים11. בהתחשב במגוון הרחב של יישומים של הידרוג'לים ואת הפונקציונליות של CFPS, השיטות שהודגמו כאן יכול לספק בסיס שממנו החוקרים מסוגלים לפתח חומרי הידרוג'ל משופרים ביולוגית המתאימים למטרותיהם.

במחקרים קודמים, מערכות מיקרוג'ל בטווח גדלים של 1 מיקרומטר עד 400 מיקרומטר שימשו לביצוע CFPS בהידרוג'לים השקועים בחיץ תגובה 23,27,28,29,30,31. עם זאת, הדרישה לטבול הידרוג'לים בתוך מאגרי התגובה של CFPS מגבילה את ההזדמנויות לפריסתם כחומרים בפני עצמם. הפרוטוקולים המוצגים כאן מאפשרים לתגובות CFPS להתרחש בתוך הידרוג'לים ללא צורך להטביע את הג'לים במאגרי תגובה. שנית, השימוש בג'לים בקנה מידה מאקרו (בין 2 מ"מ ל-10 מ"מ) מאפשר לחקור את האינטראקציה הפיזית בין הידרוג'לים לבין ביטוי גנים נטולי תאים. לדוגמה, באמצעות טכניקה זו, ניתן ללמוד כיצד מטריצת הידרוג'ל משפיעה על תגובות CFPS11 וכיצד תגובות CFPS יכולות להשפיע על מטריצת הידרוג'ל31. גדלים גדולים יותר של הידרוג'לים מאפשרים גם פיתוח של חומרים חדשניים הניתנים לתכנות ביולוגי32. לבסוף, על ידי הטמעת תגובות CFPS לתוך הידרוג'לים, יש גם הפחתה פוטנציאלית בדרישה לכלי תגובה פלסטיים. עבור פריסת חיישנים ללא תאים, יש לכך יתרונות ברורים על פני מכשירים התלויים בתוכנות פלסטיק. יחד, הטמעת תגובות CFPS בהידרוג'לים מספקת מספר יתרונות לפריסה של התקנים נטולי תאים מעבר למעבדה.

המטרה הכוללת של השיטות המוצגות כאן היא לאפשר פעולה של תגובות CFPS בתוך מטריצות הידרוג'ל. שתי שיטות שונות מודגמות להטמעת תגובות ייצור חלבון ללא תאים בחומרי הידרוג'ל בקנה מידה מאקרו (איור 1). בשיטה A, רכיבי CFPS מוכנסים להידרוג'ל אגרוז ליופילי כדי ליצור מערכת פעילה. בשיטה B, אגרוז מותך מעורבב עם רכיבי תגובת CFPS כדי ליצור מערכת הידרוג'ל CFPS שלמה, אשר לאחר מכן עוברת ליופיליזציה ומאוחסנת עד לצורך. מערכות אלה יכולות להיות מיובשות מחדש עם נפח של מים או חיץ ולנתח כדי להתחיל את התגובה.

מחקר זה משתמש במערכות מבוססות תאי ליזט Escherichia coli. אלו הן חלק ממערכות CFPS הניסיוניות הפופולריות ביותר, שכן הכנת תאי אי קולי ליזט היא פשוטה, זולה ומשיגה תפוקות חלבון גבוהות. ליזט התא משלים עם המרכיבים המקרומולקולריים הדרושים לביצוע שעתוק ותרגום, כולל ריבוזומים, tRNAs, סינתזות אמינואציל-tRNA, וגורמי ייזום, התארכות וסיום. באופן ספציפי, מאמר זה מדגים את הייצור של eGFP ו mCherry בהידרוג'לים agarose באמצעות תאי E. coli lysates ועוקב אחר המראה של פלואורסצנטיות באמצעות קורא לוחות ומיקרוסקופ קונפוקלי. תוצאות מייצגות עבור קורא לוחות microtiter ניתן לראות Whitfield et al.31, ואת הנתונים הבסיסיים זמינים לציבור 33. יתר על כן, הביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים לאורך הג'לים מאושר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. שני הפרוטוקולים שהודגמו במאמר זה מאפשרים הרכבה ואחסון של התקנים גנטיים מבוססי CFPS במאטריה במטרה הסופית ליצור סביבה פיזית מתאימה להפצה של מעגלי גנים נטולי תאים באופן התומך בפריסת השדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. חיץ ליזט תאים והכנת מדיה

  1. הכנת אגר YT+P 2x ובינוני
    1. הכינו אגר YT+P 2x על ידי מדידת 16 גרם/ליטר טריפטון, תמצית שמרים 10 גרם/ליטר, 5 גרם/ליטר NaCl, 40 מ"ל/ליטר, 1 M K 2, HPO 4, 22 מ"ל/ליטר, 1 M KH2PO4 ו-15 גרם/ליטר אגר. למרק YT+P 2x, עקבו אחר הרכב הקודם אך השמיטו את האגר.
    2. עיקור על ידי autoclaving 2x YT+P.
  2. הכנת חיץ S30A
    1. הכינו את חיץ S30A עם 5.88 גרם/ליטר מ"ג-גלוטמט, 12.195 גרם/ליטר K-גלוטמט ו-25 מ"ל/ליטר 2 M Tris, מותאם ל-pH 7.7 עם חומצה אצטית.
    2. אחסן את מאגר S30A בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע אחד.
  3. הכנת חיץ S30B
    1. הכינו את מאגר S30B עם 5.88 גרם/ליטר מ"ג-גלוטמט ו-12.195 גרם/ליטר K-גלוטמט, מותאם ל-pH 8.2 עם 2 M Tris.
    2. אחסן את מאגר S30B בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע אחד.

2. הכנת תאים ליזט (פרוטוקול 4 ימים)

  1. יום 1
    1. יוצקים את 2x YT+P לתוך צלחות אגר בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין.
    2. יש לפזר E. coli ממלאי גליצרול של -80°C, ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C.
  2. יום 2
    1. חסן מושבה אחת מצלחת 2x YT+P לתוך 400 מ"ל של 2x YT+P מרק (בתוספת אמפיצילין) בצלוחית 1 L מבולבלת.
    2. יש לדגור במשך 24 שעות ב-37°C עם רעידות של 220 סל"ד.
  3. יום 3
    1. למדוד ולתעד את OD600 של תרבויות 24 שעות; צמיחה מספיקה ב OD600 של 3-4.
      הערה: קח aliquot 1 מ"ל של תרבית חיידקים, ולבצע דילול סדרתי עם בינוני (2x YT+P מרק) לפני מדידת OD600 ננומטר. אפשר את אפקט הדילול בעת חישוב OD600.
    2. מעבירים את התרבית באופן שווה בין בקבוקי צנטריפוגות 500 מ"ל מקוררים מראש.
    3. צנטריפוגה ב 4,500 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן להשליך את supernatant.
    4. בזמן הצנטריפוגה, השלימו את הכנת חיץ S30A על ידי הוספת 2 מ"ל/ליטר של 1 M DTT למאגר S30A שהוכן קודם לכן, ערבוב ותחזוקה של החיץ על קרח.
    5. השהה מחדש את כדורי התא ב- 200 מ"ל של חיץ S30A.
    6. מערבבים את הבקבוקים במרץ עד שכל הגלולה מסיסה, תוך שמירה על התאים על קרח ככל האפשר.
    7. צנטריפוגה ב 4,500 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן להשליך את supernatant.
    8. חזור על שלבים 2.3.5-2.3.7 (כולל).
    9. הוסיפו 40 מ"ל של חיץ S30A לכל בקבוק צנטריפוגה, השהו מחדש את הכדוריות והעבירו לצינורות צנטריפוגות 50 מ"ל שנשקלו מראש.
    10. צנטריפוגה ב-4,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4°C. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, והוציאו את שאריות הסופרנאטנט על ידי פיפטה, תוך שמירה על קרח ככל האפשר.
    11. לשקול מחדש את צינורות הצנטריפוגות, לרשום את המסה החדשה, ולחשב את המסה של הכדורים.
    12. להקפיא כדורי הבזק בחנקן נוזלי, ולאחסן אותם ב -80 ° C.
  4. יום 4
    1. הפשירו את הכדוריות על קרח.
    2. לכל 1 גרם של כדור, הוסף את הדברים הבאים: 1.2 מ"ל של חיץ S30A (DTT הוסיף לפני השימוש), 275 μL של מעכב פרוטאז (8 מ"מ מלאי), ו 25 μL של lysozyme (10 מ"ג / מ"ל מלאי).
    3. מערבלים במרץ עד שהכדורים מסיסים לחלוטין ללא גושים שנותרו, ושומרים אותם על קרח ככל האפשר.
    4. בצינורות צנטריפוגות של 50 מ"ל, הפעל את מתלי התא ב-120 W, 20 kHz, 30% משרעת ו-20 s/40 s בפולסי הפעלה/כיבוי למשך 5 דקות של סוניקציה.
    5. צנטריפוגה במהירות 4,000 x גרם למשך שעה אחת ב-4°C כדי להשליך את פסולת התא.
    6. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות צנטריפוגות טריים בנפח 50 מ"ל.
    7. צינורות הדגירה ב-37°C ב-220 סל"ד למשך 80 דקות.
    8. הכינו חומרי דיאליזה על ידי הוספת 1 מ"ל/ליטר של 1 M DTT למאגר S30B. מערבבים ומוסיפים 900 מ"ל לכד סטרילי של 1 ליטר. הוסיפו מערבל מגנטי ושמרו על טמפרטורה של 4°C.
    9. בעקבות תגובת הנגר, העבר את תמצית התא משלב 2.4.7 לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 2 מ"ל, וצנטריפוגה ב -20,000 x גרם למשך 10 דקות ב -4 מעלות צלזיוס.
    10. אחדו את הסופרנאטנט נטול הכדוריות על קרח בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
    11. קבע את הנפח הכולל של תמצית התאים המיוצרת, והלחלח את המספר הדרוש של קלטות דיאליזה MWCO 10K על ידי טבילתן ב- S30B למשך 2 דקות.
    12. לטעון את הקלטות באמצעות מזרק עם עד 3 מ"ל של תמצית. Dialyze עד שלוש קלטות לכל 1 ליטר beoaker, תוך ערבוב ב 4 ° C במשך 3 שעות.
    13. לאחר השלמת הדיאליזה, המבהירה את התמצית, מעבירים את התמצית לצינורות מיקרו-צנטריפוגות של 2 מ"ל. צנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    14. אחדו את התמצית המזוקקת לצינור צנטריפוגה טרי על קרח, וערבבו לזמן קצר כדי לערבב.
    15. לקבוע את ריכוז החלבון של תמצית באמצעות fluorometer.
    16. יש לדלל את התמצית לריכוז של 44.5 מ"ג/מ"ל באמצעות ddH2O מקורר מראש.
    17. Aliquot לתוך 200 μL aliquots, להקפיא הבזק בחנקן נוזלי, ולאחסן ב -80 ° C.

3. הכנת הידרוג'לים ליופיליים (שיטה A)

  1. שוקלים 0.75 גרם אגרוז, מוסיפים ddH2O לנפח של 100 מ"ל, ומחממים במיקרוגל בהתפרצויות של 30 שניות בטמפרטורות גבוהות כדי ליצור מלאי אגרוז מותך.
  2. באמצעות פיפטה, להעביר 50 μL של agarose מותך לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, ולאפשר את הג'ל פילמור במשך 20-30 דקות (פילמור מתרחשת מהר יותר אם הג'לים מועברים למקרר).
  3. הקפיאו במהירות הבזק את צינורות המיקרוצנטריפוגה, המכילים את הג'לים הפולימריים, בחנקן נוזלי.
  4. הסירו את מכסה צינורות הצנטריפוגה, כסו את פתחי צינורות הצנטריפוגות בסרט שעווה ונקבו את הסרט מספר פעמים בעזרת מחט או קצה פיפטה.
  5. מעבירים את צינורות המיקרוצנטריפוגות המכילות את הג'לים הפולימריים לאחסון של -80°C למשך 1-2 שעות.
  6. שחזרו את צינורות הצנטריפוגות מאחסון של -80°C, והכניסו לייבוש בהקפאה, כדי להבטיח שהצינורות יבשים לחלוטין.
  7. הפעילו את מייבש ההקפאה עם ההגדרות הבאות: טמפרטורה: −20 °C, לחץ: 0.1 mbar.
  8. השאירו את הג'ל לייבוש בהקפאה למשך הלילה.
  9. החזירו את הג'לים ממייבש ההקפאה, והכניסו אותם לאחסון של -80°C עד לצורך.
    הערה: ניתן לאחסן ג'לים מיובשים בהקפאה עד שנה.

4. הכנת מלאי תמיסות אנרגיה 14x

  1. שלב את כל רכיבי התגובה (טבלה 1) בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל על קרח כדי ליצור תמיסת אנרגיה 14x.
  2. Aliquot את פתרון האנרגיה 14x לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל, ולאחסן ב -80 ° C (aliquots נפח קטן יותר ניתן להשתמש).
    הערה: ניתן לאחסן את תמיסת האנרגיה 14x למשך מספר חודשים בטמפרטורה של -80°C אם נמנעת הפשרה חוזרת ונשנית של הצינורות.

5. הכנת מלאי חומצות אמינו 4x

  1. הפשירו, על קרח, את כל 20 רכיבי חומצות האמינו של ערכת RTS Amino Acid Sampler. מערבלים את חומצות האמינו כדי להבטיח שהן מומסות לחלוטין.
  2. בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, מערבבים את כל 20 חומצות האמינו, ומוסיפים 12 מ"ל של מערבולת סטרילית ddH2O. עד שהתמיסה מתבהרת, עם אובך קל בלבד של צבע לבן.
  3. Aliquot את 4x חומצות אמינו לתוך 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge (500 μL aliquots).
  4. הקפיאו במהירות הבזק את תמיסת חומצות האמינו 4x aliquots בחנקן נוזלי, והעבירו את aliquots לאחסון של -80°C.

6. כיול מאגר ללא תאים

הערה: מאגר CFPS המשמש לתגובות הידרוג'ל כויל לריכוזים אופטימליים של DTT, Mg-גלוטמט ו-K-גלוטמט בהתאם לפרוטוקול ב-Banks et al.34 שונה מ-Sun et al.35. הרכבי תגובת הכיול נבחרו בשיטת תכנון ניסויים (DOE), כאשר נבחרו שבע רמות גורם עבור K-גלוטמט (200 מילימול, 400 מילימול, 600 מילימול, 1,000 מילימול, 1,200 מילימול, 1,400 מילימול), מג-גלוטמט (0 מילימול, 10 מילימול, 20 מילימול, 30 מילימול, 40 מילימול, 50 מילימול, 60 מילימול) ו-DTT (0 מילימול, 5, 10 מילימול, 15 מילימול, 20 mM, 25 mM, 30 mM) מניות. JMP Pro 15 שימש ליצירת עיצוב DOE מותאם אישית (טבלה 2) ולביצוע הניתוח כדי לקבוע את ריכוזי הגורמים האופטימליים.

  1. שחזרו את התמצית נטולת התאים מאחסון של -80°C, והפשירו על קרח.
  2. הפשירו את 4x חומצות אמינו, 14x תמיסת אנרגיה, 40% PEG-8000, פלסמיד DNA, 3 M K-גלוטמט, 100 mM Mg-גלוטמט, ו 100 mM DTT מלאי על קרח.
  3. צור תערובת אב לכיול על ידי שילוב של 12.5 μL של 4x חומצות אמינו, 3.57 μL של תמיסת האנרגיה 14x, 2.5 μL של 40% PEG-8000, 3 מיקרוגרם של DNA פלסמיד ו-10 μL של תמצית נטולת תאים (44.5 מ"ג/מ"ל), וצור עד 35 μL לכל תגובה עם ddH2O.
  4. מפזרים את 35 μL של תערובת מאסטר לתוך בארות של צלחת microtiter שחור 384 באר.
  5. לאחר תכנון DOE, הוסף את הנפח המתאים של Mg-גלוטמט, K-גלוטמט ו- DTT לכל תגובה, יחד עם ddH2O כדי להפוך כל תגובה לעד 50 μL.
  6. העבר את צלחת המיקרוטיטר לקורא לוחות לצורך זיהוי וניתוח פלואורסצנטיות באמצעות הגדרות קורא הלוחות המתוארות (עבור mCherry): עירור: 587 ננומטר, פליטה: 610 ננומטר, רוחב פס אורך גל: 12 ננומטר, אופטיקה: למעלה, טמפרטורה: 37 ° C, עם קריאות פלואורסצנטיות נאספות כל 5 דקות במשך 4 שעות של זמן קריאה כולל. לדגור על הלוחות עם טלטול על הגדרת פולסים ב 60 סל"ד.
  7. להעלות את התוצאות לתכנון JMP DOE, וליצור פרופיל חיזוי כדי לקבוע את רמות הריכוז האופטימליות עבור K-גלוטמט, Mg-גלוטמט ו- DTT בהתבסס על משתני התגובה הרצויים; במקרה זה, הפלואורסצנטיות המקסימלית וקצב התגובה היו משתני התגובה.
  8. שלב את הריאגנטים כפי שמוצג בטבלה 3 כדי ליצור את מאגר 2X CFPS
  9. Aliquot ולאחסן ב -80 °C

7. CFPS בהידרוג'לים ליופיליים מיובשים (שיטה A)

הערה: הפלסמידים המשמשים בתגובות CFPS נוצרו באמצעות רכיבים מערכת הכלים המודולרית EcoFlex עבור E. coli36 ותוארו ב- Whitfield et al.11 mCherry ו- eGFP היו תחת שליטתו של מקדם JM23100 המכונן. רכיבים אלה זמינים מ-Addgene.

  1. שחזרו את התמצית נטולת התאים מאחסון של -80°C, והפשירו על קרח למשך כ-20 דקות.
  2. אספו את חיץ CFPS 2x ואת DNA פלסמיד, והפשירו על קרח.
  3. אספו את ההידרוג'לים המיובשים בהקפאה, ואפשרו להם להגיע לטמפרטורת החדר למשך 15 דקות על ידי השארת הג'לים לעמוד על הספסל.
  4. מעבירים את הג'לים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, חותכים את הג'לים באזמל במידת הצורך כדי להתאים אותם לבארות.
  5. בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, לשלב 10 μL של תמצית ללא תאים עם 25 μL של 2x CFPS מאגר ו 4 מיקרוגרם של DNA פלסמיד; ליצור עד נפח כולל של 50 μL עם ddH2O כדי ליצור את פתרון CFPS.
  6. פיפטה את תמיסת CFPS על הידרוג'לים מיובשים בהקפאה.
  7. יש להשרות את הג'לים במערכת CFPS למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. מעבירים את הג'לים לצלחת מיקרוטיטר שחורה בעלת 384 בארות בעזרת מרית.
  9. העבר את לוח המיקרוטיטר לקורא לוחות לצורך זיהוי וניתוח פלואורסצנטיות באמצעות הגדרות קורא הלוחות המתוארות בשלב 6.6. תוצאות מייצגות זמינות במחקרים קודמים31,33.

8. סינתזת חלבונים ללא תאים בהידרוג'לים הניתנים לפריסה (שיטה B)

  1. יש לשחזר תמצית נטולת תאים מאחסון של -80°C, ולהפשיר על קרח למשך כ-20 דקות.
  2. לאסוף את DNA פלסמיד, ולהפשיר על קרח.
  3. בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל על קרח, שלב 10 μL של תמצית ללא תאים עם 3 מיקרוגרם של DNA פלסמיד ו 25 μL של 2x CFPS חיץ היוצר עד נפח כולל של 37.5 μL.
  4. מדדו 3 גרם אגרוז, והוסיפו ל-100 מ"ל של חיץ ddH2O כדי ליצור 3% אגרוז.
  5. חממו במיקרוגל את 3% האגרוז בהתפרצויות של 30 שניות בעוצמה גבוהה.
  6. פיפטה 12.5 μL של אגרוז מותך לתוך 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגות המכילים CFPS לערבב לנפח כולל של 50 μL.
  7. אפשר agarose מותך להתקרר, אבל לא פולימריזציה, משאיר את agarose בלוק חום להגדיר 50 ° C.
  8. שלב את האגרוז המותך עם תמיסת CFPS; יש לערבב באמצעות פיפטינג וערבוב עם הקצה, ולהקפיד לנוע במהירות כדי למנוע פילמור ג'ל לפני שניתן יהיה לערבב את תמיסת CFPS.
  9. מניחים לג'לים להתקרר בטמפרטורת החדר ומתפלמרים במשך כ-2 דקות.
  10. מעבירים את האגרוז הפולימרי לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל עם מרית, ומקפיאים במהירות הבזק בחנקן נוזלי.
  11. הכניסו את ההידרוג'לים הקפואים במהירות הבזק לאחסון של -80°C למשך שעה אחת.
  12. לשחזר את הג'לים מאחסון; הסירו את מכסי צינורות המיקרוצנטריפוגה, כסו את הצינורות בסרט שעווה ונקבו את היריעה כדי לאפשר את ייבוש הלחות.
  13. הפעילו את מייבש ההקפאה עם ההגדרות הבאות: טמפרטורה: −20 °C, לחץ: 0.1 mbar, ייבוש בהקפאה למשך 18 שעות (למשך הלילה).
  14. אחסנו את מכשירי CFPS המיובשים בהקפאה באחסון של -80°C עד לשימוש.
  15. מכשירי CFPS מיובשים בהקפאה, עם נפח רטוב משוער של 50 μL, ניתן לייבש מחדש עם 50 μL של ddH2O ללא נוזל עודף. החזרת נוזלים אורכת כ-30 דקות.
  16. מעבירים את הג'לים לצלחת מיקרוטיטר שחורה בעלת 384 בארות בעזרת מרית.
  17. העבר את לוח המיקרוטיטר לקורא לוחות לצורך זיהוי וניתוח פלואורסצנטיות באמצעות הגדרות קורא הלוחות המתוארות בשלב 6.6. תוצאות מייצגות זמינות בפרסומים קודמים31,33.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות להטמעת תגובות CFPS במטריצות הידרוג'ל, כאשר איור 1 מציג סקירה סכמטית של שתי הגישות. שתי השיטות מקובלות לייבוש בהקפאה ואחסון לטווח ארוך. שיטה א' היא המתודולוגיה הנפוצה ביותר משתי סיבות. ראשית, היא הוכחה כשיטה הישימה ביותר לעבודה עם מגוון חומרי הידרוג'ל11. שנית, שיטה א' מאפשרת בדיקה מקבילה של מבנים גנטיים. שיטה ב' מתאימה יותר לייצור מערכת אופטימלית ופריסה בשטח. שני הפרוטוקולים מאפשרים להכין דגימות רבות בבת אחת כדי לסייע בשחזור ניסיוני. תכונה זו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להלן שני פרוטוקולים לשילוב תגובות CFPS מבוססות תאי E. coli ליזט בהידרוג'לים של אגרוז. שיטות אלו מאפשרות ביטוי גנים בו זמנית בכל החומר. ניתן להתאים את הפרוטוקול למערכות CFPS אחרות והוא נערך בהצלחה עם ערכות CFPS זמינות מסחרית בנוסף לליזטים התאיים שהוכנו במעבדה המפורטים כאן. חשוב לציין כי הפרוטוקול מאפשר ביטוי גנים בהיעדר פאזה נוזלית חיצונית. משמעות הדבר היא שהמערכת עצמאית ואינה דורשת אמבט תגובה ללא תאים. להבדיל משיטות קודמות בהן התרחשו תגובות CFPS בתוך הידרוג'לים, הדרישה למאגרים חיצוניים וכלי תגובה מוסרת בשיטה זו....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים מאוד על תמיכתם של פרסי מועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) ו- BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), ופרס EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H). נתונים התומכים בפרסום זה זמינים באופן גלוי בכתובת: 10.25405/data.ncl.22232452. לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון Creative Commons Attribution (CC BY) על כל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומר
3-PGAסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-214793B
חומצה אצטיתסיגמא-אולדריץ'A6283
אגרתרמו פישר סיינטיפיקA10752.22
AgaroseSevern Biotech30-15-50
ערכת דגימת חומצות אמינוVWR
ATPSigma-AldrichA8937-1G
cAMPSigma-AldrichA9501-1G
קו-אנזים A (CoA)Sigma-AldrichC4282-100MG
CTPAlfa AesarJ14121.MC
DTTThermo Fisher ScientificR0862
חומצה פוליניתSigma-AldrichF7878-100MG
GTPקרבוסינת'NG01208
HEPESסיגמא-אולדריץ'H4034-25G
K-גלוטמטסיגמא-אולדריץ'G1149-100G
ליזוזיםסיגמא-אולדריץ'L6876-1G
מגה-גלוטמטסיגמא-אולדריץ'49605-250G
NADסיגמא-אולדריץ'N6522-250MG
PEG-8000PromegaV3011
אשלגן הידרוקסיד (KOH)סיגמא-אולדריץ'757551-5G
אשלגן פוספט דו-בסיסי (K2HPO4)סיגמא-אולדריץ'P3786-500G
אשלגן פוספט מונובסיסי (KH2PO4)סיגמא-אולדריץ'RDD037-500G
קוקטייל מעכב פרוטאזסיגמא-אולדריץ'P2714-1BTL
ערכת ריכוז חלבון קיוביטתרמו פישר סיינטיפיקA50668
רוסטה 2 DE 3 E.coliסיגמא-אולדריץ'71397-3
נתרן כלורי (NaCl)סיגמא-אולדריץ'S9888-500G
ספרמידיןסיגמא-אולדריץ'85558-1G
טריפטוןתרמו פישר סיינטיפיק211705
TrisSigma-AldrichGE17-1321-01
tRNASigma-Aldrich10109541001
UTPAlfa AesarJ23160.MC
תמצית שמריםSigma-AldrichY1625-1KG
<חזק>ציוד
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהSigma-AldrichHS4323-500EA
10K MWCO קלטות דיאליזהתרמו פישר סיינטיפיק66381
צינור צנטריפוגה 15 מ"לSarstedt62.554.502
בקבוקי צנטריפוגה 50 מ"לSarstedt62.547.254
בקבוקי צנטריפוגה 500 מ"לThermo Fisher Scientific3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus מייבש הקפאהישוחלק מס' 101521, 101522, 101527
צנטריפוגה ספסליתתרמו פישר סיינטיפיקH-X3R
שחור 384 באר צלחות מיקרוטיטרפישר סיינטיפיק66
קובטותתרמו פישר סיינטיפיק222S
אלגה Purelab מקהלהאלגה#####
אפנדורף מיקרוצנטריפוגה 5425RאפנדורףEP00532
צנטריפוגה במהירות גבוההבקמן קולטרB34183
רישיון JMPמכון SAS15
בוחש מגנטיפישר 15353518
מדעי ParafilmAmcorPM-966
פוטוספקטרומטר (ביופוטומטר)Eppendorf16713
פיפטות וטיפיםגילסון#####
איזון דיוקSartorius16384738
קיוביט 2.0 פלואורומטרתרמו פישר מדעיQ32866
חממת טלטול תרמופישר סיינטיפיקSHKE8000
סוניק דיסמברטור (סוניקטור)ThermoFisher Scientific12893543
חממה סטטיתSanyoMIR-162
מזרק ומחטיםThermo Fisher Scientific66490
Thermo max Q8000 (חממת טלטול)Thermo Fisher ScientificSHKE8000
Varioskan Lux קורא פלטותThermo Fisher ScientificVLBL00GD1
Vortex Genie 2Cole-parmerOU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/° מטר סיVWR662-1657
BTRABR1401801

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
  2. Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853(2016).
  3. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  4. Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
  5. Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
  6. Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248(2019).
  7. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  8. Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958(2021).
  9. Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702(2020).
  10. Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580(2021).
  11. Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
  12. Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429(2022).
  13. Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261(2019).
  14. Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
  15. Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188(2020).
  16. Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357(2021).
  17. Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7(2018).
  18. Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050(2020).
  19. Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64(2019).
  20. Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407(2020).
  21. Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
  22. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  23. Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105(2018).
  24. Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
  25. Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785(2022).
  26. Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150(2020).
  27. Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
  28. Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
  29. Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165(2013).
  30. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  31. Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
  32. Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163(2019).
  33. Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , Newcastle University. UK. (2020).
  34. Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
  35. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  36. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  37. Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים