הפרוטוקול מציג כלי חדש לפישוט הדמיה תוך חיונית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גישת הדמיה תוך-חיונית יעילה לניטור ארוך טווח של דינמיקה של רקמת אפיתל במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך
במאמר זה
סיכום
תקציר
הבנת התנהגויות נורמליות וחריגות של תאי in vivo נחוצה לפיתוח התערבויות קליניות לסיכול התחלת המחלה והתקדמותה. לכן חיוני לייעל גישות הדמיה המאפשרות תצפית על דינמיקה של תאים באתרם, כאשר מבנה הרקמה והרכבה נותרים ללא הפרעה. האפידרמיס הוא המחסום החיצוני ביותר של הגוף, כמו גם המקור לסרטן האנושי הנפוץ ביותר, כלומר קרצינומה עורית של העור. הנגישות של רקמת העור מהווה הזדמנות ייחודית לנטר התנהגויות אפיתל ותאי עור בבעלי חיים שלמים באמצעות מיקרוסקופ תוך-חיוני לא פולשני. עם זאת, גישת הדמיה מתוחכמת זו הושגה בעיקר באמצעות מיקרוסקופים רבי-פוטונים זקופים, המהווים חסם כניסה משמעותי עבור רוב החוקרים. מחקר זה מציג עלון במה מותאם אישית למיקרוסקופ מודפס בתלת-ממד המתאים לשימוש עם מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, ומייעל את ההדמיה התוך-חיונית ארוכת הטווח של עור האוזן בעכברים טרנסגניים חיים. אנו מאמינים כי המצאה רב-תכליתית זו, אשר עשויה להיות מותאמת אישית כך שתתאים למותג המיקרוסקופ ההפוך ולדגם המועדף ותותאם לתמונות של מערכות איברים נוספות, תוכיח את עצמה כבעלת ערך רב לקהילת המחקר המדעי הגדולה יותר על ידי שיפור משמעותי של הנגישות של מיקרוסקופיה תוך חיונית. התקדמות טכנולוגית זו היא קריטית לחיזוק הבנתנו את הדינמיקה של תאים חיים בהקשרים נורמליים ומחלות.
מבוא
מיקרוסקופיה תוך-חיונית היא כלי רב עוצמה המאפשר ניטור של התנהגויות תאים בסביבות in-vivo שאינן מוטרדות. שיטה ייחודית זו סיפקה תובנות מפתח על פעולתן הפנימית של מערכות איברים מורכבות של יונקים, כולל ריאות1, מוח2, כבד3, בלוטת חלב4, מעי5 ועור6. יתר על כן, גישה זו חשפה שינויים התנהגותיים בתאים במהלך התפתחות הגידול7, ריפוי פצעים8,9, דלקת10, ופתולוגיות מגוונות אחרות באתרן. במחקר זה אנו מתמקדים בשיפור הנגישות של מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה בוצע בהתאם להנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אמורי והמרכז הרפואי לענייני חיילים משוחררים באטלנטה ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).
1. התקנת עלון ההדמיה החיה על במת המיקרוסקופ ההפוך
- בנה את ההוספה באמצעות קובצי .stl (קובץ משלים 1, קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3) המציינים את הממדים והעיצוב התלת-ממדיים (ראה איור 1 ואיור 2A), מדפסת תלת-ממד וחומצה פולילקטית (PLA).
- הניחו בזהירות את האינסרט (איור 2B,C) בחריץ הגדול של שלב המיקרוסקופ (איור....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הרכבה נכונה של עלון הדמיה חיה במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך והתמצאות מתאימה של עכבר מהונדס על גבי העלון מאומתת על ידי רכישת ערימות z של רקמת אוזן חיה עם תווית פלואורסצנטית לאורך מסלול זמן ≥1 שעות עם עדות מינימלית לסחף בצירי x, y ו-z. יש לצלם תמונות במרווחי זמן קבועים (זמן המרווח יהיה תלוי בשאלה הביולוגית, עוצמת האות הפלואורסצנטי וכו ') כך שניתן יהיה לעקוב אחר דינמיקת התא וסחף התמונה לאורך זמן. במהלך הזמן, ניטור של מישורי Z בודדים כדי לוודא שהם נשארים בפוקוס מגלה אם תנועת בעלי חיים מפריעה ליציבות ההדמיה. דוגמה למישורי z בודדים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במחקר זה אנו מציגים כלי חדש המאפשר הדמיה תוך-חיונית יציבה וארוכת טווח של אפיתל עור עכבר שלם על גבי מיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים. המצאה זו עשויה PLA, שהוא החומר הנפוץ ביותר וזול ביותר להדפסה תלת מימדית; כל עלויות הדפסת התלת-ממד הפנימיות עבור עלון זה מסתכמות ב-<$5. את שני חלקי ההוספה הנפרדים (איור 1, קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2) ניתן להרכיב בקלות באמצעות ברגים קבועים (ראו טבלת חומרים). יש לציין כי קבצי .stl שסופקו יכולים לשמש גם להזמנת הוספה ז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
אנו מודים לוולנטינה גרקו על עכברי K14-mCherry-H2B. אנו אסירי תודה לחנות המכונות של המחלקה לפיזיקה באוניברסיטת אמורי על יצירת דיסקיות כיסוי הזכוכית. עבודה זו מומנה על ידי פרס פיתוח קריירה #IK2 BX005370 מהמחלקה לענייני חיילים משוחררים של ארה"ב BLRD Service ל-LS, פרסי NIH RF1-AG079269 ו-R56-AG072473 ל-MJMR, ופרס I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award ל-MJMR.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מדפסת תלת מימד | Qudi Tech | i-Fast | הדפסות תלת מימד באמצעות חומר PLA |
| 40x 1.25NA עדשת אובייקטיבית סיליקון | Nikon | ||
| AxR סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי | ניקון | ||
| ספוגית כותנה | VWR | 76337-046 | יישום קרם / משחה |
| דוקסיציקלין היקלאט | סיגמא-אולדריץ' | D9891 | גורם לתיוג GFP של גרעיני פיברובלסטים ב-Pdgfra-rtTA; עכברי pTRE-H2B-GFP |
| מברג שטוח (2.5 מ"מ) | הכנס אפיקס למיקרוסקופ | ||
| ברגים שטוחים x 4 (#6-32) | ניקון | בורג הכנס למיקרוסקופ | |
| זכוכית תחתונה תרבית צלחת | chemglass מדעי החיים | CLS-1811-002 | שונה על ידי הסרת קירות הכלי לשימוש כדיסק כיסוי תואם להכנסה חיה; דיסק ברוחב 35 מ"מ מכיל כיסוי זכוכית ברוחב 20 מ"מ; קירות הכלים היו הוסר על ידי |
| חנות מכונות בקר לוחית חום | Physitemp | TCAT-2LV | בקר טמפרטורת בעלי חיים - מתח נמוך; חיבור בדיקה אנאלי לניטור טמפרטורת גוף העכבר |
| מפתח משושה (1.5 מ"מ) | לכוונון בורג M3 | ||
| מפתח משושה (2.5 מ"מ) | התאם את המתח על קליפ אוזן מתכת | ||
| הכנס | |||
| הדמיה תוך-חיוניתIsoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | הרדמה לעכבר |
| (או סקוטש) | VWR | 10127-458 | אלטרנטיבה לקליפ אוזניים ממתכת לקיבוע אוזן לכיסוי |
| אטב | המשמש כאטב אוזניים | ||
| עכבר: C57BL / 6-Pdgfraem1 (rtTA) Xsun / J | מעבדת ג'קסון | RRID: IMSR_JAX: 034459 | מקדם ספציפי לפיברובלסט המניע ביטוי rtTA המעורר דוקסיציקלין |
| עכבר: K14-H2BPAmCherry | באדיבות ד"ר ולנטינה גרקו מאוניברסיטת | מסמן גרעיני תאי אפיתל אפידרמיס עם mCherry; מכונה בטקסט "K14-H2B-mCherry" | |
| עכבר: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J | מעבדת ג'קסון | RRID: IMSR_JAX:005104 | תוויות גרעיני פיברובלסטים עם GFP בשילוב עם Pdgfra-rtTA ומושרה עם דוקסיציקלין |
| עטיפת איטום רב תכליתית | שמחה להגביר | את חום העכבר | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | ברגי סט חומר סיכה לעיניים |
| x 3 (M3; 6 מ"מ) | Thorlabs | SS3M6 | חיבור למודול לוח חום |
| שמן | מוחל על 40x סיליקון אובייקטיבי | ||
| צלחת חימום בעלי חיים קטנים | Physitemp | HP-4M | מספק חום לבעלי חיים |
| Somnoflow וופורייזר אלקטרוני בזרימה נמוכה | קנט סיינטיפיק | SF-01 | הרדמת עכבר |
| גריז ואקום | Flinn Scientific | AP1095 | אוטם כיסוי דיסק להכנסת |
| Veet | |||
| כרית חום במחזור מים | Stryker Medical | TP700 | להחייאת עכבר לאחר הדמיה |
מקורות
- Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
- Nal Chen,, et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy. Cells. 11 (14), 2196(202....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
