הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

כרומטוגרפיית גז - ספקטרומטריית מסות מבוססת מטבולומיקה ממוקדת של דגימות אלמוגים קשים

3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65628

⸱

13 באוקטובר 2023

 ,  ,  ,  , 
1Climate Change Cluster (C3), University of Technology Sydney, 2Metabolomics Australia, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, The University of Melbourne, 3School of Biological Sciences, Victoria University of Wellington

במאמר זה

סיכום

במאמר זה אנו מציגים את ההפקה וההכנה של מטבוליטים קוטביים וקוטביים למחצה מהולובונט אלמוגים, כמו גם רקמת מארח אלמוגים מופרדת ושברי תאים Symbiodiniaceae, לצורך ניתוח ספקטרומטריית מסות של כרומטוגרפיית גז.

תקציר

גישות המבוססות על ספקטרומטריית מסות כרומטוגרפיה של גז (GC-MS) הוכיחו את עצמן כחזקות להבהרת הבסיס המטבולי של סימביוזה cnidarian-dinoflagellate וכיצד אלמוגים מגיבים ללחץ (כלומר, במהלך הלבנה הנגרמת על ידי טמפרטורה). פרופיל מטבוליטים במצב יציב של הולוביונט האלמוגים, הכולל את הפונדקאי הקנידריאני ואת המיקרובים הקשורים אליו (Symbiodiniaceae ופרוטיסטים אחרים, חיידקים, ארכאה, פטריות ווירוסים), יושם בהצלחה בתנאי סביבה ועקה כדי לאפיין את המצב המטבולי ההוליסטי של האלמוג.

עם זאת, כדי לענות על שאלות סביב אינטראקציות סימביוטיות, יש צורך לנתח את פרופילי המטבוליטים של מארח האלמוגים וסימביונטות האצות שלו באופן עצמאי, אשר ניתן להשיג רק על ידי הפרדה פיזית ובידוד של הרקמות, ואחריו מיצוי עצמאי וניתוח. בעוד היישום של מטבולומיקה הוא חדש יחסית בתחום האלמוגים, המאמצים המתמשכים של קבוצות מחקר הביאו לפיתוח שיטות חזקות לניתוח מטבוליטים באלמוגים, כולל הפרדת הרקמה המארחת של האלמוגים וסימביונטים של אצות.

מאמר זה מציג מדריך שלב אחר שלב להפרדת הולוביונט ומיצוי מטבוליטים לניתוח GC-MS, כולל שלבי אופטימיזציה מרכזיים שיש לקחת בחשבון. אנו מדגימים כיצד, לאחר ניתוח עצמאי, פרופיל המטבוליטים המשולב של שני השברים (אלמוגים ו- Symbiodiniaceae) דומה לפרופיל של השלם (holobiont), אך על ידי הפרדת הרקמות, אנו יכולים גם לקבל מידע מפתח על חילוף החומרים והאינטראקציות בין שני השותפים שלא ניתן להשיג מהשלם בלבד.

מבוא

מטבוליטים מייצגים את התוצרים הסופיים של תהליכים תאיים, ומטבולומיקה - המחקר של חבילת המטבוליטים המיוצרים על ידי אורגניזם או מערכת אקולוגית נתונה - יכולה לספק מדד ישיר לתפקוד אורגניזם1. זה קריטי במיוחד לחקר מערכות אקולוגיות, אינטראקציות סימביוטיות וכלי שיקום, שכן המטרה של רוב אסטרטגיות הניהול היא לשמר (או לשחזר) פונקציות ספציפיות של שירותי מערכת אקולוגית2. שוניות אלמוגים הן מערכת אקולוגית מימית אחת המדגימה את הערך הפוטנציאלי של מטבולומיקה להבהרת אינטראקציות סימביוטיות ולקישור תגובות פיזיולוגיות של אלמוגים להשפעות ברמת הקהילה וברמת המערכת האקולוגית3. היישום של ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז בתפוקה גבוהה (GC-MS) מוערך במיוחד בשל יכולתו לנתח במהירות מגוון רחב של סוגי מטבוליטים בו זמנית עם סלקטיביות ורגישות גבוהות, לספק זיהוי מורכב מהיר כאשר ספריות ספקטרליות זמינות, ולספק רמה גבוהה של שחזור ודיוק, עם עלות נמוכה יחסית לדגימה.

אלמוגים הם הולוביונטים המורכבים מחיית האלמוגים, אנדוסימביונטים פוטוסינתטיים של דינופלגלאט (משפחה: Symbiodiniaceae4), ומיקרוביוםמורכב 5,6. באופן כללי, הכושר של ההולוביונט נשמר בעיקר באמצעות חילופי מולקולות ואלמנטים קטנים כדי לתמוך בתפקוד המטבולי של כל חבר 7,8,9,10. גישות מטבולומיות הוכחו כחזקות במיוחד להבהרת הבסיס המטבולי של ספציפיות סימביוזה 9,11, תגובת הלבנה לעקה תרמית7,8,12,13, תגובות מחלה 14, תגובות חשיפה לזיהום 15, פוטואקלום 16 ואיתות כימי 17 באלמוגים, כמו גם סיוע בגילוי סמנים ביולוגיים 18,19. בנוסף, מטבולומיקה יכולה לספק אישור רב ערך למסקנות שהוסקו מטכניקות מבוססות DNA ו- RNA 9,20. קיים אפוא פוטנציאל רב לשימוש במטבולומיקה להערכת בריאות השונית ולפיתוח כלים לשימור שוניות3, כגון באמצעות איתור סמנים ביולוגיים מטבוליים של עקה18,19 ולבחינת הפוטנציאל של אסטרטגיות ניהול אקטיבי כגון סובסידיות תזונתיות21.

הפרדת התאים המארח והסימביונט וניתוח פרופילי המטבוליטים שלהם באופן עצמאי, ולא יחד כהולוביונט, יכולים להניב מידע נוסף על אינטראקציות בין בני הזוג, סטטוסים פיזיולוגיים ומטבוליים עצמאיים, ומנגנונים מולקולריים פוטנציאליים להסתגלות 11,12,22,23,24. מבלי להפריד בין האלמוגים לבין Symbiodiniaceae, כמעט בלתי אפשרי להבהיר את תרומתם וחילוף החומרים של אלמוגים ו / או Symbiodiniaceae באופן עצמאי, למעט שחזור גנום מורכב ומידול מטבולי25, אך זה עדיין לא יושם על סימביוזה אלמוג-dinoflagellate. יתר על כן, ניסיון לחלץ מידע על חילוף החומרים האישי של הפונדקאי או סימביונט אצות מפרופיל המטבוליטים של ההולוביונט יכול להוביל לפרשנות שגויה.

לדוגמה, עד לאחרונה, הנוכחות של חומצות שומן רב בלתי רוויות C18:3n-6, C18:4n-3 ו-C16 בתמציות מרקמות אלמוגים והולוביונט נחשבה כנגזרת מסימביונט האצות, שכן ההנחה הייתה שלאלמוגים אין את ωx desaturases החיוני לייצור חומצות שומן אומגה-3 (ω3); עם זאת, ראיות גנומיות עדכניות מצביעות על כך שלקנידארים מרובים יש את היכולת לייצר ω3 PUFA de novo ולבצע ביוסינתזה נוספת של ω3 PUFA26 ארוך שרשרת. שילוב GC-MS עם תיוג איזוטופי יציב (למשל, 13 C-ביקרבונט, NaH 13CO 3) יכול לשמשלמעקב אחר גורלו של פחמן קבוע פוטוסינתטי באמצעות רשתות מטבוליות הולוביונט אלמוגים הן בתנאי בקרה והן בתגובה לגורמי עקה חיצוניים27,28. עם זאת, שלב קריטי במעקב אחר גורל 13 C הוא הפרדת רקמת האלמוג מתאי האצות – רק אז ניתן להקצות באופן חד משמעי נוכחות של תרכובת המסומנת ב-13C בחלק המארח של האלמוגים כמטבוליט שמקורו ב-Symbiodiniaceae המועתק לאלמוג או כתוצר במורד הזרם של תרכובת מסומנת שעברה. טכניקה זו הוכיחה את כוחה על ידי קריאת תיגר על ההנחה ארוכת השנים כי גליצרול הוא הצורה העיקרית שבה פוטוסינתאט מועבר מסימביונט למארח29, כמו גם הבהרה כיצד שטף תזונתי בין שותפים משתנה במהלך הלבנה27,28 ובתגובה למיני Symbiodiniaceae11 שאינם תואמים.

בעוד שההחלטה להפריד רקמות מונעת בעיקר על ידי שאלת המחקר, חשוב לקחת בחשבון את המעשיות, האמינות וההשפעות המטבוליות הפוטנציאליות של גישה זו. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות ומוכחות להפקת מטבוליטים מההולוביונט, כמו גם את השברים המארח והסימביונט הנפרדים. אנו משווים את פרופילי המטבוליטים של המארח והסימביונט באופן עצמאי וכיצד פרופילים אלה בהשוואה לפרופיל המטבוליט של הולוביונט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: תכנון הניסוי, איסוף הדגימות ואחסונם תוארו בפירוט במקומות אחרים 2,30,31. יש לקבל אישור לאיסוף אלמוגי בר לפני איסוף וניסויים. הדגימות כאן נאספו ממושבות של Montipora mollis (שינוי צורה בצבע ירוק) שיובאו מחוות האלמוגים Batavia (Geraldton, WA), שנאספו במקור משונית ליד איי אברוהלוס (מערב אוסטרליה; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) בעומק של 1 מ 'תחת רישיון חקלאות ימית AQ1643. לפני הדגימה, המושבות הוחזקו באקווריום של 800 ליטר ב 35 PSU, תחת אור כחול לבן ב 150 μmol פוטונים ·m −2·s −1, וב 25 ° C ± 0.5 ° C במשך 3 חודשים. שברי האלמוגים (~5 ס"מ2, N=6) הוקפאו בחנקן נוזלי ואוחסנו בטמפרטורה של 80°C עד לעיבודם.

1. הכנת פתרונות החילוץ והציוד

  1. לפחות יום אחד לפני הסרת רקמת האלמוגים, הכינו את פתרונות החילוץ והציוד.
  2. יש להכין מים אולטרה-טהורים בכלי זכוכית נקיים ללא חומרי ניקוי בטמפרטורה של 4°C.
  3. ערבבו מתנול 100% LC עם ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם·מ"ל−1 של תקנים פנימיים מתאימים (למשל, 13C6 סורביטול).
  4. צור תמיסת מיצוי מתנול 50% באמצעות חצי מתנול 100% LC וחצי מים טהורים במיוחד. אחסנו את שתי תמיסות המתנול בטמפרטורה של -20°C.
    הערה: כדי לסייע במניעת פירוק המטבוליטים, מומלץ לבצע את שלבי עיבוד הדגימה באצוות של חמישה מקטעי אלמוגים בכל פעם, עם אחד ביולוגי נוסף (מים בלבד) ריק (סה"כ דגימות N = 6). לאחר שכל דגימת אלמוגים הופרדה לשני השברים (רקמת אלמוג מארח, מעתה "מארח", ותאי מיקרו-אצות, מעתה "סימביונט"), המספר הכולל של דגימות באצוות עיבוד אחת יהיה 12.

2. מטבוליזם אלמוגים מרווה

הערה: תכנון הניסוי, איסוף הדגימות ואחסונם תוארו בפירוט במקומות אחרים 2,30,31. עם זאת, יש לציין כי הזמן שלוקח להרוות את חילוף החומרים (כלומר, הזמן בין איסוף דגימות האלמוגים ושימורן) הוא קריטי כדי ללכוד את התגובה המקורית30. שמור על הדגימה מהר ככל האפשר לאחר האיסוף כדי למנוע שינויים בהרכב המטבוליטים עקב התפרקות הדגימה או תגובות פיזיולוגיות שאינן מטרה32.

  1. הניחו את שברי האלמוגים בשקית איסוף דגימות סטרילית, ונקזו את עודפי מי הים ככל האפשר. יש לטבול את הדגימה בחנקן נוזלי למשך 30 שניות לפחות. העבירו את הדגימות בהקדם האפשרי למקפיא בטמפרטורה של 80°C לאחסון.
    הערה: ניתן להקפיא דגימות בטמפרטורה של -80°C במיכלים חסומים לאור עד לעיבוד, תוך הימנעות ממחזורי הקפאה-הפשרה.

3. הסרת רקמת אלמוג מהשלד

הערה: הדגימות צריכות להישמר על קרח (4 ° C) בכל עת כדי להבטיח שהן בו זמנית בצורה נוזלית תוך מניעת חילוף חומרים מתמשך.

  1. הניחו שקית איסוף דגימות נקייה וסטרילית על קרח כך שהשקית תהיה יציבה ופתוחה על גבי הקרח בבאר רדודה אך לא תהיה שקועה בקרח. הוסיפו 10 מ"ל מים אולטרה-טהורים קרים (4°C) לשקית.
    הערה: זה יעזור למנוע הפשרה חוזרת ונשנית של שבר האלמוגים בהקפאה בגלל האוויר בלחץ קר והקרח שמסביב.
  2. בחרו שבר אלמוגים בפינצטה מעוקרת, ושטפו במים אולטרה-טהורים קרים (4°C) באמצעות פיפטת פסטר סטרילית עד שלא יישארו שאריות מי ים. השקיעו את שבר האלמוגים השטופים בשקית המכילה 10 מ"ל של מים טהורים במיוחד.
    הערה: שטיפה זו חיונית להסרת שאריות מלחים שיפריעו לניתוח במורד הזרם. הימנע ממגע יד עם המים או שבר האלמוגים דרך השקית כדי לשמור על הדגימה ב -4 מעלות צלזיוס.
  3. הדביקו קצה פיפטה סטרילי בנפח 1 מ"ל על קצה אקדח אוויר בעזרת סרט חשמלי, כאשר ~5 מ"מ נחתכו מקצה הקצה (איור 1A).
  4. כוונו את אקדח האוויר אל שבר האלמוג כאשר השקית אטומה למחצה וזרימת האוויר על נמוכה-בינונית כדי להסיר בעדינות את הרקמה על ידי עידוד תנועה מעגלית של המים מעל שבר האלמוג.
  5. לאחר ~3 דקות, או כאשר נראה שכל הרקמה הוסרה מהשלד, כבו את האוויר והוציאו את מברשת האוויר. אטמו לחלוטין את השקית.
  6. סחטו את כל רקמת האלמוגים שהוסרה לפינה התחתונה של השקית. חותכים את הפינה הנגדית ושופכים בעדינות את תכולת השקית לתוך צינור 15 מ"ל על קרח.

4. הומוגניזציה אופציונלית

הערה: חלק ממיני האלמוגים צמיגים יותר מאחרים, כלומר צחצוח האוויר יסיר את הרקמה בגושים במקום בתרחיץ. אם גושי רקמה נראים בהומוגנט המוברש באוויר, ניתן להוסיף שלב הומוגניזציה ב -4 מעלות צלזיוס לכל הדגימות.

  1. נקו פעמיים הומוגנייזר מכני עם שיני מסור עם 4°C 70% מתנול ולבסוף עם 4°C מים טהורים במיוחד.
  2. הומוגניזציה של דגימת האלמוגים בצינור של 15 מ"ל למשך ~1 דקות עד שהדגימה הומוגנית לחלוטין ולא נראים גושים.
  3. נקה את ההומוגנייזר כמו בשלב 4.1 בין כל דגימה. שמור על זמן הומוגניזציה עקבי בין הדגימות.

5. איסוף דוגמאות לנורמליזציה

  1. אספו אליציטוט של 1,000 μL מהרקמה ההומוגנית לצורך ספירת תאים של Symbiodiniaceae, ניתוח תכולת חלבון ברקמת מארח האלמוגים והערכת כלורופיל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C עד להכנה לניתוח (סעיף 10).

6. רקמת מארח אלמוגים אופציונלית - הפרדת תאים Symbiodiniaceae

  1. צנטריפוגה של האלמוגים הומוגנט ב 2,500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C באמצעות צנטריפוגה בקירור.
    הערה: מהירות זו אופטימלית להפרדת תאי Symbiodiniaceae הכבדים יותר, תוך שמירה על דפנות התא שלהם שלמות, מרקמת המאכסן, אשר תלויה בסופרנטנט.
  2. מוציאים את הסופרנאטנט המכיל את החומר המארח, ומניחים בצינור חדש של 15 מ"ל.
    הערה: השומנים מרקמת המאכסן יוצרים בדרך כלל שכבה ורודה/לבנה צרה על גבי התאים הסימביונטיים. השכבה הזו יכולה להיאסף יחד עם הסופרנאטנט המארח המסיס באמצעות פיפטינג (איור 1B).
  3. מערבלים במרץ את המארח במשך דקה אחת בדיוק. שמור את דגימת גלולת האצות ואת דגימת הסופרנאטנט המארח על קרח.
  4. הוסף 2 מ"ל של מים טהורים במיוחד ב 4 ° C לגלולת האצות. מערבלים במרץ במשך 2 דקות בדיוק כדי להשעות מחדש את הכדור.
    הערה: אם לא נאספו מקטעים בודדים של 1 ס"מ ממושבת האלמוגים עבור גנוטיפ Symbiodiniaceae, ניתן לאסוף כאן אליציטוט של 200 μL של תרחיף התא Symbiodiniaceae, להישמר בתמיסת חיץ הדנ"א המועדפת, ולאחסן כמתואר ב-Thurber et al.30 עבור גנוטיפ Symbiodiniaceae (למשל, לפי González-Pech et al.12).
  5. חזור על שלבים 6.1-6.4 פעם נוספת.
    הערה: ההפרדה האמינה בין הפונדקאי לסימביונט תלויה בביומסה ובמין האלמוגים, מאחר שמינים מסוימים יכולים להיות צמיגים יותר מאחרים. מומלץ לבצע לפחות שלושה שלבי שטיפה, אך ניתן להגדיל זאת בהתאם להצלחת ההפרדה. חזרו על שלבי השטיפה 4.7-4.9 עד שלא ניתן לראות תאי Symbiodiniaceae בתחתית החלק המארח ועד שהמקטע Symbiodiniaceae יהיה נקי באופן גלוי מחומר מארח (למשל, ללא שכבה לבנה למעלה) (איור 1).
  6. מוציאים את הסופרנאטנט המכיל את החומר המארח, ומניחים בצינור חדש של 15 מ"ל.
  7. שמור את גלולת הסימביונט בצינור 15 מ"ל.

7. ייבוש לדוגמה

  1. הקפיאו את ההומוגנט של ההולוביונט או את שני הפונדקאי המופרד ואת שברי Symbiodiniaceae, בטמפרטורה של -80°C למשך ~120 דקות. Lyophilize הדגימות לילה עם ואקום 0.01 mbar ב -85 ° C.
    הערה: כדי למנוע אובדן דגימה במהלך ליופיליזציה, מומלץ להשתמש במכסה שנחתך מצינור סטרילי אחר, או פרפילם סטרילי, עם חור ~ 2 מ"מ מנוקב בזהירות באמצעות מחט סטרילית של 25 גרם.
  2. כאשר יבש, באמצעות איזון מעבדה, לשקול אחד מהבאים: 1) 25 מ"ג של holobiont; 2) 15 מ"ג של חלק סימביונט; או 3) 30 מ"ג של הרקמה המארחת מכל דגימה לצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים ללא פלסטיסייזר 2 מ"ל.
    הערה: שלב קריטי: אופטימיזציה של הביומסה למיצוי חיונית כדי להבטיח כי GC-MS אינו עמוס יתר על המידה תוך הבטחת אות מספיק. חומר האלמוגים המיובש הוא סטטי מאוד. כדי למנוע אובדן דגימה, השתמש בהתקנים אנטי-סטטיים כדי לסלק מטענים אלקטרוסטטיים מהדגימות ומכלי השקילה. חלופה פשוטה וחסכונית היא להניח סדין מייבש כביסה מתחת לצינור הדגימה. את גלולת הסימביונט המיובשת ניתן לחתוך למשקל הרצוי באמצעות להב סטרילי.

8. מיצוי מטבוליטים תוך תאיים

  1. מיצוי מטבוליטים תוך תאיים מהולובונט ליופילי:
    1. הוסף 400 μL של מתנול 100% קר (-20°C) עם תקן פנימי (IS; 13C6 סורביטול ו / או 13C5-15 N ואלין, ב 10מיקרומטר) לכל צינור.
    2. הוסף מספר קטן של 710-1,180 מיקרומטר חרוזי זכוכית שטופים בחומצה (~ 10 מ"ג) לכל דגימה. מניחים בטחנת חרוזים בטמפרטורה של 50 הרץ למשך 3 דקות בתוסף טחנת חרוזים מקורר מראש (-20°C).
    3. הוסף 600 μL נוסף של מתנול 100% קר (-20 ° C) עם ISs (13 C6 סורביטול ו / או 13C 5-15 N ואלין, ב 10μM) לכל צינור.
    4. מערבבים במשך דקה. מניחים על שייקר רוטיסרי בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות.
  2. מיצוי מטבוליטים תוך תאיים מתאי Symbiodiniaceae מופרדים מליופיליה:
    1. הוסף 200 μL של מתנול 100% קר (-20 ° C) עם ISs (13 C6 סורביטול ו / או 13C 5-15 N ואלין, ב 10μM) לחומר מיובש Symbiodiniaceae.
    2. הוסף מספר קטן של 710-1,180 מיקרומטר חרוזי זכוכית שטופים בחומצה (~ 10 מ"ג). מניחים בטחנת חרוזים בטמפרטורה של 50 הרץ למשך 3 דקות בתוסף טחנת חרוזים מקורר מראש (-20°C).
    3. הוסף 800 μL נוספים של מתנול 100% קר (-20 ° C) עם ISs, ומערבולת במשך 30 שניות.
  3. מיצוי מטבוליטים תוך תאיים מרקמת פונדקאי מופרדת ליופילית:
    1. הוסף 1 מ"ל של 100% קר (-20 ° C) מתנול כיתה LC המכיל ISs (13 C6 סורביטול ו / או 13C 5-15 N ואלין, ב 10מיקרומטר) לחומר המארח המיובש.
    2. מערבולת לערבב במשך 20 שניות. יש להניח במחזיק צינור צף באמבט סוניקציה בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות.

9. טיהור תמצית מטבוליטים

  1. צנטריפוגה את הדגימות (holobiont/host/symbiont) ב 3,000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
  2. מעבירים את כל הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 2 מ"ל, תוך זהירות שלא להפריע לכדורית פסולת התא.
    הערה: אלה הן תמציות קוטביות למחצה. אלה יכולים להישמר על קרח באופן זמני אך מאוחסנים לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס בחושך.
  3. לפסולת התא הנותרת, הוסיפו 1,000 מיקרוליטר מתנול קר (-20°C). מערבלים במרץ במשך דקה אחת כדי להשהות מחדש.
  4. צנטריפוגה הדגימות ב 3,000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
  5. אספו ואגרו את הסופרנאטנט (תמציות קוטביות) עם תמציות קוטביות למחצה מאותה דגימה.
    הערה: פסולת התא יכולה להיות מאוחסנת בטמפרטורה של -80°C ולהשתמש בה לנורמליזציה של תכולת החלבונים (סעיף 11).
  6. צנטריפוגה את התמציות המצטברות ב 16,100 גרם למשך 15 דקות כדי להסיר את כל המשקעים, ולהעביר את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ללא פלסטיסייזר (2 מ"ל).
    הערה: ניתן לאחסן את תמציות הדגימה בטמפרטורה של -80°C בחושך.
  7. כאשר מוכן לנתח, aliquot 50 μL של כל תמצית לתוך תוספת זכוכית. יש להתרכז למשך 30 דקות ב-30°C באמצעות רכז ואקום. יש לחזור על הפעולה ארבע פעמים נוספות (לקבלת 250 מיקרוליטר של תמצית מיובשת כוללת).
    הערה: ניתן לאחסן את הדגימות המיובשות בטמפרטורת החדר בתנאי ייבוש עד לניתוח.

10. מטבוליט derivatization

הערה: תהליך דה-ריוואטיזציה מקוון דו-שלבי משמש למתוקסימציה וטרימתילסילציה של מטבוליטים קוטביים.

  1. הוסף 25 μL של methoxyamine hydrochloride (30 מ"ג / מ"ל בפירידין) לכל דגימה.
  2. יש להתסיס ב-37°C בשייקר מסלולי, שנקבע ב-750 סל"ד למשך שעתיים.
  3. הוסף 25 μL של N,O-bis (trimethylsilyl)trifluoroacetamide + trimethylchlorosilane לכל דגימה.
  4. יש להתסיס שוב ב-37°C וב-750 סל"ד למשך שעה.
  5. אפשרו לדגימות להתאזן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפני הזרקת 1 μL ביחס פיצול של 1:10 על ה-GC.

11. כרומטוגרפיית גז-ניתוח ספקטרומטריית מסות

הערה: יש לכוונן את ספקטרומטר המסות בהתאם להמלצות היצרן באמצעות tris-(perfluorobutyl)-amine (CF43).

  1. השתמש בהליום בעל טוהר גבוה במיוחד כגז המוביל בקצב זרימת עמוד קבוע של 1 מ"ל/דקה.
  2. השתמש בעמוד DB-5 באורך 30 מ' עם עובי סרט של 1 מיקרומטר וקוטר פנימי של 0.25 מ"מ.
  3. תוכנית תנור GC
    1. הגדר את טמפרטורת הכניסה ל 280 ° C.
    2. מתחילים בהזרקה בטמפרטורת תנור של 100 מעלות צלזיוס, ומחזיקים 4 דקות.
    3. יש להעלות את הטמפרטורה ב-10°C/min ל-320°C ולאחר מכן להחזיק למשך 11 דקות.
  4. פרמטרים של ספקטרומטר מסה
    1. הגדר את קו ההעברה של MS ל- 280°C וכוונן את מקור היונים ל- 200°C.
    2. השתמש בארגון כגז תא התנגשות כדי ליצור את יון המוצר ניטור תגובה מרובה (MRM).
    3. השג זיהוי מטבוליטים ביחס לספריית MRM מקוטעת בזמן המכילה יעדי MRM.

12. ספירת תאי Symbiodiniaceae, ניתוח תכולת חלבון ברקמת מארח האלמוגים והערכת כלורופיל A

  1. ספירת תאי Symbiodiniaceae:
    1. קח aliquot של רקמת האלמוג homogenate.
    2. צנטריפוגה את הדגימות ב 2,000 × גרם כדי להניף את האצות.
    3. הסר את הסופרנאטנט ~ 200 μL מגלולת האצות, והכנס לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
      הערה: זו תהיה דגימת החלבון שתשמש לנרמול הנתונים; אחסנו אותו בטמפרטורה של -20°C לפני הניתוח, במידת הצורך.
    4. יש להשהות מחדש את כדורית האצות ב-1 מ"ל של מי ים מסוננים על-ידי פיטום עדין למעלה ולמטה. במידת הצורך, דללו את תרחיף האצות כדי להקל על ספירת התא.
    5. בצע ספירת תאים באמצעות המוציטומטר תחת מיקרוסקופ אור על ידי הוספת 10 μL לאחד החדרים. השלם 8-10 ספירות לכל מדגם.
      הערה: ניתן ליישם גם שיטות חלופיות לספירת תאי אצות כאשר הן זמינות (למשל, ציטומטריית זרימה, מיקרוסקופ קונפוקלי בתפוקה גבוהה).
    6. חשב את ריכוז התאים הסימביונטים (mL−1), תוך התחשבות בכל גורמי הדילול המשמשים.
  2. בדיקה עבור תכולת החלבון
    1. לכמת את תכולת החלבון בדגימה (למשל, באמצעות הבדיקה הקולרימטרית של ברדפורד, כפי שתוארה בתחילה על ידי Bradford et al.33, או בדיקת לורי34,35, שהפרוטוקול שלה תואר עבור cnidarians במקומות אחרים 36).
  3. כלורופיל מיצוי
    1. השתמש גלולה תא של ~ 200, 000 תאים, קפוא או טרי.
    2. מעבירים כל כדורית אצות ל-2 מ"ל של דימתילפורממיד (DMF) בבקבוקון זכוכית, ודגרים בחושך ב-4°C למשך 48 שעות.
      הערה: DMF הוא רעיל ומסרטן, ולכן יש להשלים את הכנת הדגימה תחת מכסה אדים כהה ככל האפשר ועל קרח. אם יש <200,000 תאים, השתמש בפחות DMF.
    3. צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 16,000 × גרם.
    4. העבר 200 מ"ל לתוך צלחת באר UV-96 למדידות פוטומטריות. הפעל כל דגימה במשולש עם DMF כפריט הריק.
    5. מדוד את הבליעה באורכי גל (E) 663.8 ננומטר, 646 ננומטר ו-750 ננומטר. הפחיתו את הבליעה ב-750 ננומטר מהבליעה בשני אורכי הגל האחרים.
      הערה: מדידה ב-750 ננומטר מתקנת כל פיזור או עכירות בדגימה.
    6. חשב את ריכוז הכלורופיל A (מק"ג/מ"ל) באמצעות משוואה (1):
      Chl ריכוז A (מיקרוגרם / מ"ל) = (12.00 × E 663.8) - (3.11 × E646.8) (1)

13. כימות הביומסה של התא בעקבות מיצוי מטבוליטים לצורך נורמליזציה

הערה: ישנן שתי אפשרויות לכימות ביומסה של התא המתוארות להלן: כימות של חלבון הקשור לביומסה באמצעות שיטה קולורימטרית ברדפורד שונה ומדידת המשקל היבש של פסולת התא. שתי השיטות מתאימות לשימוש, שכן שתיהן מציעות כימות מדויק של הביומסה של התא.

  1. תכולת החלבון של פסולת התא
    1. השהה מחדש את פסולת התאים הקפואה עם 1 מ"ל של 0.2 M NaOH, ודגר על הדגימות ב 98 ° C במשך 20 דקות.
    2. מצננים את הדגימות על קרח למשך ~10 דקות, וצנטריפוגות ב-3,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת הסביבה.
    3. לכמת את תכולת החלבון בדגימה (למשל, באמצעות הבדיקה הקולרימטרית של ברדפורד, כפי שתוארה בתחילה על ידי Bradford et al.33 ושונתה על ידי Smart et al.37).
  2. מדידת משקל יבש של פסולת תאים
    1. השהה מחדש את פסולת התא ממיצוי המטבוליטים התוך תאיים במים מזוקקים פעמיים (~ 10 מ"ל).
    2. סנן את התמיסה תחת ואקום באמצעות מסנן ממברנה שוקל מראש (0.22 מיקרומטר נקבוביות, 47 מ"מ).
    3. שטפו את הצינורות המכילים ביומסה פעמיים במים טהורים במיוחד כדי להבטיח העברה מלאה של ביומסה למסנן הממברנה.
    4. הסר את מסנן הממברנה המכיל את הביומסה וייבש אותו באמצעות תנור מיקרוגל (הספק נמוך; ~ 250 W למשך 20 דקות).
    5. אחסנו את נייר הסינון במייבש למשך הלילה. רשום את המשקל היבש של נייר הסינון וחשב את המשקל היבש של הביומסה על ידי הפחתת משקל מסנן הממברנה היבשה (באמצעות מסנן קרום יבש נקי שיובש לצד מסנן הדגימה) מהמשקל הכולל.

14. ניתוח נתונים

  1. ניתוח יעדי מטבוליטים באמצעות מסדי נתונים מטבוליטים כאשר כל יעד מורכב מ-MRM מכמת ומזהה.
  2. בדוק חזותית את מטרות המטבוליטים שזוהו ושלב אותם ידנית לפי הצורך.
  3. השתמש באזור שיא מטבוליט כדי לחשב את השפע היחסי של כל דגימה עבור כל קבוצה. הערכים ריקים, מתוקנים ומנורמלים כדי לדגום את אזור השיא הסטנדרטי הפנימי, ולאחר מכן לדגום את תכולת חלבון פסולת התא לפי Smart et al.37.
  4. השליכו מטבוליטים עם סטיית תקן יחסית גדולה מ-35% בכל קבוצות הטיפול (N = 23 מטבוליטים).
  5. להפוך את הנתונים (למשל, שורש קובייה), ו מתכוון למרכז אותם; לאשר התפלגות נורמלית והומוגניות של שונות.
  6. בצע את ניתוח הנתונים (ANOVA ובניית מפת חום; למשל, באמצעות https://www.metaboanalyst.ca)38. קבץ את הדגימות כדי לבחון את השונות בתוך הטיפול באמצעות החבילות "cluster", "factoextra" ו- "klustR". חישוב סטטיסטיקת הפער (שיטה לקביעת המספר האופטימלי של אשכולות39) באמצעות הפונקציה "clusGap" ב- R ומגרשים באמצעות חבילת R "tidyverse". בצעו PERMANOVAs כדי לבחון את המשמעות בהפרדה בין פרופילי המטבוליטים של הטיפול (למשל, בפריימר).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כל הנתונים שהופקו במהלך עבודה זו זמינים במידע המשלים.

הפרדה בין מארח לסימביונט

figure-results-1
איור 1: הגדרה ותיקוף של ההפרדה בין רקמות מארחות אלמוגים ותאי Symbiodiniaceae. (A) מערך אקדח האוויר לסילוק רקמת אלמוג משלד האלמוג. קצה פיפטה מחובר לאקדח האוויר עם סרט חשמלי, וקטע קטן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההפרדה בין הפונדקאי לסימביונט ניתנת להשגה בקלות ובמהירות באמצעות צנטריפוגה פשוטה, והתוצאות כאן מראות כי הפרדת השברים יכולה לספק מידע רב ערך המעיד על תרומות ספציפיות של חברי הולוביונט, אשר יכול לתרום לניתוח פונקציונלי של בריאות האלמוגים. באלמוגים בוגרים, סינתזת שומנים מבוצעת בעיקר על-ידי סימביונטאצות תושב 40, אשר מספק שומנים (למשל, טריאצילגליצרול ופוספוליפידים)41 וחומצות שומן שיכולות לקדם התאוששות מסטרס 11,42.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.

תודות

J.L.M. נתמך על ידי מלגת מחקר של UTS Chancellor.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100% מתנול בדרגת LCMerck439193
מיקרוצנטריפוגה חיוניים 2 מ"ל, PPEppendorf30121880פוליפרופילן מספק עמידות גבוהה בפני כימיקלים, לחץ מכני וטמפרטורות קיצוניות
2030 Shimadzu גז כרומטוגרףShimadzuGC-2030
710-1180 & מיקרו; m חרוזי זכוכית שטופים בחומצהMerck
G1152		גודל זה אופטימלי לשבירת תאי Symbiodiniaceae
AOC-6000 Plus דגימה אוטומטית רב תכליתיתShimadzuAOC6000
מגיב ברדפורדMerckB6916כל מגיב קולורימטרי חלבון מקובל
אקדח אוויר דחוסOzito6270636עיצוב דומה מקובל. התאמה שתתאים לטיפ של 1 מ"ל היא קריטית.
  עמודת DB-5 עם עמודה בקוטר פנימי של 0.25 מ"מ ו-1 µ עובי סרט mAgilent122-5013
DMFMerckRTC000098
D-Sorbitol-6-13C ו/או 13C5– 15N ValineMerck605514/ 600148ניתן להוסיף למתנול אחד מהתקנים הפנימיים או את שניהם.
תחתית שטוחה 96 בארות צלחתMerckCLS3614
בקבוקוני נצנוץ זכוכיתMerckV713020 מ"ל, עם אטם לא פלסטיק
Immunoglogin GMerck56834אם לא זמין, סרום בקר אלבומין מקובל
Primerv4
Rv4.1.2
תוכנתShimadzu LabSolutions Insightv3.6
נתרן הידרוקסידMerckS5881כדורים להכנת 1 M פתרון
tidyversev1.3.1R חבילה
TissueLyser LTQiagen85600או דומה
TQ8050NX משולש ספקטרומטר מסה מרובעShimadzuGCMS-TQ8050 NX
UV-96 צלחת בארגריינרM3812
תיק מדגם Whirl-Pak תיקמדגם MerckWPB01018WA; גודל: גדול מספיק כדי להכיל שבר אלמוג ~5 ס"מ, אך לא גדול מדי כדי שהמים יהיו מפוזרים מדי
צינורות איסוף

מקורות

  1. Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
  2. Matthews, J. L., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. Beale, D. J., Hillyer, K. E., Warden, A. C., Jones, O. A. H. , Academic Press. Cambridge, MA. 211-229 (2022).
  3. Lawson, C. A., et al. Informing coral reef conservation through metabolomic approaches. Coral Reef Conservation and Restoration in the Omics Age. Coral Reefs of the World. van Oppen, M. J. H., Aranda Lastra, M. , Springer. Cham, Switzerland. 179-202 (2022).
  4. LaJeunesse, T. C., et al. Systematic revision of Symbiodiniaceae highlights the antiquity and diversity of coral endosymbionts. Current Biology. 28 (16), 2570-2580 (2018).
  5. Rohwer, F., Seguritan, V., Azam, F., Knowlton, N. Diversity and distribution of coral-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 243, 1-10 (2002).
  6. Maire, J., et al. Intracellular bacteria are common and taxonomically diverse in cultured and in hospite algal endosymbionts of coral reefs. The ISME Journal. 15 (7), 2028-2042 (2021).
  7. Hillyer, K. E., et al. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in the coral Acropora aspera. Coral Reefs. 36, 105-118 (2016).
  8. Hillyer, K. E., Tumanov, S., Villas-Bôas, S., Davy, S. K. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Journal of Experimental Biology. 219 (4), 516-527 (2016).
  9. Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), 13194-13199 (2017).
  10. Rosset, S. L., et al. The molecular language of the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Trends in Microbiology. 29 (4), 320-333 (2020).
  11. Matthews, J. L., et al. Partner switching and metabolic flux in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Royal Society. 285 (1892), 20182336(2018).
  12. González-Pech, R. A., et al. Physiological factors facilitating the persistence of Pocillopora aliciae and Plesiastrea versipora in temperate reefs of south-eastern Australia under ocean warming. Coral Reefs. 41, 1239-1253 (2022).
  13. Williams, A., et al. Metabolomic shifts associated with heat stress in coral holobionts. Science Advances. 7 (1), (2021).
  14. Deutsch, J. M., et al. Metabolomics of healthy and stony coral tissue loss disease affected Montastraea cavernosa corals. Frontiers in Marine Science. 8, 1421(2021).
  15. Stien, D., et al. A unique approach to monitor stress in coral exposed to emerging pollutants. Scientific Reports. 10 (1), 9601(2020).
  16. Lohr, K. E., et al. Resolving coral photoacclimation dynamics through coupled photophysiological and metabolomic profiling. Journal of Experimental Biology. 222 (8), (2019).
  17. Jorissen, H., et al. Coral larval settlement preferences linked to crustose coralline algae with distinct chemical and microbial signatures. Scientific Reports. 11 (1), 14610(2021).
  18. Roach, T. N., Dilworth, J., Jones, A. D., Quinn, R. A., Drury, C. Metabolomic signatures of coral bleaching history. Nature Ecology & Evolution. 5 (4), 495-503 (2021).
  19. Parkinson, J. E., et al. Molecular tools for coral reef restoration: Beyond biomarker discovery. Conservation Letters. 13 (1), 12687(2020).
  20. Jiang, J., et al. How Symbiodiniaceae meets the challenges of life during coral bleaching. Coral Reefs. 40, 1339-1353 (2021).
  21. Guerra, F. D., Attia, M. F., Whitehead, D. C., Alexis, F. Nanotechnology for environmental remediation: materials and applications. Molecules. 23 (7), 1760(2018).
  22. Matthews, J. L., et al. Metabolite pools of the reef building coral Montipora capitata are unaffected by Symbiodiniaceae community composition. Coral Reefs. 39, 1727-1737 (2020).
  23. Papina, M., Meziane, T., van Woesik, R. Symbiotic zooxanthellae provide the host-coral Montipora digitata with polyunsaturated fatty acids. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 135 (3), 533-537 (2003).
  24. Kellogg, R., Patton, J. Lipid droplets, medium of energy exchange in the symbiotic anemone Condylactis gigantea: A model coral polyp. Marine Biology. 75, 137-149 (1983).
  25. Ankrah, N. Y., Chouaia, B., Douglas, A. E. The cost of metabolic interactions in symbioses between insects and bacteria with reduced genomes. mBio. 9 (5), e01433(2018).
  26. Kabeya, N., et al. Genes for de novo biosynthesis of omega-3 polyunsaturated fatty acids are widespread in animals. Science Advances. 4 (5), (2018).
  27. Hillyer, K. E., Dias, D., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. 13C metabolomics reveals widespread change in carbon fate during coral bleaching. Metabolomics. 14 (1), 12(2018).
  28. Hillyer, K. E., Dias, D. A., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. Mapping carbon fate during bleaching in a model cnidarian symbiosis: the application of 13C metabolomics. New Phytologist. 214 (4), 1551-1562 (2017).
  29. Burriesci, M. S., Raab, T. K., Pringle, J. R. Evidence that glucose is the major transferred metabolite in dinoflagellate-cnidarian symbiosis. Journal of Experimental Biology. 215 (19), 3467-3477 (2012).
  30. Thurber, R. V., et al. Unified methods in collecting, preserving, and archiving coral bleaching and restoration specimens to increase sample utility and interdisciplinary collaboration. PeerJ. 10, 14176(2022).
  31. Grottoli, A. G., et al. Increasing comparability among coral bleaching experiments. Ecological Applications. 31 (4), 02262(2020).
  32. Mushtaq, M. Y., Choi, Y. H., Verpoorte, R., Wilson, E. G. Extraction for metabolomics: access to the metabolome. Phytochemical Analysis. 25 (4), 291-306 (2014).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
  34. Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
  35. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
  36. Zamer, W. E., Shick, J. M., Tapley, D. W. Protein measurement and energetic considerations: Comparisons of biochemical and stoichiometric methods using bovine serum albumin and protein isolated from sea anemones. Limnology and Oceanography. 34 (1), 256-263 (1989).
  37. Smart, K. F., Aggio, R. B., Van Houtte, J. R., Villas-Boas, S. G. Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 5 (10), 1709-1729 (2010).
  38. Pang, Z., et al. Using MetaboAnalyst 5.0 for LC-HRMS spectra processing, multi-omics integration and covariate adjustment of global metabolomics data. Nature Protocols. 17 (8), 1735-1761 (2022).
  39. Tibshirani, R., Walther, G., Hastie, T. Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology). 63 (2), 411-423 (2001).
  40. Chen, W. -N., et al. Diel rhythmicity of lipid-body formation in a coral-Symbiodinium endosymbiosis). Coral Reefs. 31 (2), 521-534 (2012).
  41. Imbs, A. Fatty acids and other lipids of corals: composition, distribution, and biosynthesis. Russian Journal of Marine Biology. 39 (3), 153-168 (2013).
  42. Rosset, S., et al. Lipidome analysis of Symbiodiniaceae reveals possible mechanisms of heat stress tolerance in reef coral symbionts. Coral Reefs. 38 (6), 1241-1253 (2019).
  43. Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Del Angel-Rodriguez, J. A., Perez-Espana, H. Seasonal shifts in fatty acids and sterols in sponges, corals, and bivalves, in a southern Gulf of Mexico coral reef under river influence. Coral Reefs. 40 (2), 571-593 (2021).
  44. Imbs, A. B., Dang, L. T. Seasonal dynamics of fatty acid biomarkers in the soft coral Sinularia flexibilis, a common species of Indo-Pacific coral reefs. Biochemical Systematics and Ecology. 96, 104246(2021).
  45. Oku, H., Yamashiro, H., Onaga, K., Sakai, K., Iwasaki, H. Seasonal changes in the content and composition of lipids in the coral Goniastrea aspera. Coral Reefs. 22 (1), 83-85 (2003).
  46. Weis, V. M. Cell biology of coral symbiosis: foundational study can inform solutions to the coral reef crisis. Integrative and Comparative Biology. 59 (4), 845-855 (2019).
  47. Oakley, C., Davy, S. Cell biology of coral bleaching. Coral Bleaching. van Oppen, M., Lough, J. , Springer. Cham, Switzerland. 189-211 (2018).
  48. Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  49. Lawson, C. A., et al. Heat stress decreases the diversity, abundance and functional potential of coral gas emissions. Global Change Biology. 27 (4), 879-891 (2021).
  50. Olander, A., et al. Comparative volatilomics of coral endosymbionts from one-and comprehensive two-dimensional gas chromatography approaches. Marine Biology. 168 (5), 76(2021).
  51. Wuerz, M., et al. Symbiosis induces unique volatile profiles in the model cnidarian Aiptasia. Journal of Experimental Biology. 225 (19), (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Symbiodiniaceae
כרומטוגרפיית גז - ספקטרומטריית מסות מבוססת מטבולומיקה ממוקדת של דגימות אלמוגים קשים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.