הפרוטוקול מראה איסוף חוזר של נוזל המוח השדרה ודם מחולדות אפילפטיות, המבוצע במקביל לניטור וידאו-אלקטרואנצפלוגרם רציף (EEG). אלה חיוניים לחקר קשרים אפשריים בין שינויים במולקולות שונות של נוזל הגוף לבין פעילות התקפים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דגימת נוזל מוחי ודם מווריד זנב לטרלי בחולדות במהלך רישומי EEG
במאמר זה
סיכום
תקציר
מכיוון שהרכב נוזלי הגוף משקף דינמיקות פיזיולוגיות ופתולוגיות רבות, דגימות נוזל ביולוגיות מתקבלות בדרך כלל בהקשרים ניסיוניים רבים כדי למדוד מולקולות מעניינות, כגון הורמונים, גורמי גדילה, חלבונים או רנ"א קטנים שאינם מקודדים. דוגמה ספציפית היא דגימה של נוזלים ביולוגיים במחקר של סמנים ביולוגיים לאפילפסיה. במחקרים אלה, רצוי להשוות את רמות המולקולות בנוזל השדרה (CSF) ובפלזמה, על ידי משיכת CSF ופלזמה במקביל והתחשבות במרחק הזמן של הדגימה מהתקפים ואליהם. הדגימה המשולבת של CSF ופלזמה, יחד עם ניטור וידאו-EEG בבעלי חיים אפילפטיים, היא גישה מבטיחה לאימות של סמנים ביולוגיים אבחוניים ופרוגנוסטיים משוערים. כאן מתואר הליך של נסיגה משולבת של CSF מ- cisterna magna ודגימת דם מווריד הזנב הצידי בחולדות אפילפטיות המנוטרות באופן רציף באמצעות וידאו EEG. הליך זה מציע יתרונות משמעותיים על פני טכניקות נפוצות אחרות. הוא מאפשר דגימה מהירה עם מינימום כאב או פולשניות, וקיצור זמן ההרדמה. בנוסף, ניתן להשתמש בו כדי להשיג דגימות CSF ופלזמה הן בחולדות קשוחות והן בחולדות שנרשמו באמצעות טלמטריה, וניתן להשתמש בו שוב ושוב במשך מספר ימי ניסוי. על ידי מזעור הלחץ כתוצאה מהדגימה על ידי קיצור הרדמה איזופלורנית, המדדים צפויים לשקף בצורה מדויקת יותר את הרמות האמיתיות של מולקולות נחקרות בנוזלים ביולוגיים. בהתאם לזמינות של בדיקה אנליטית מתאימה, טכניקה זו עשויה לשמש למדידת רמות של מולקולות מרובות ושונות תוך ביצוע רישום EEG בו זמנית.
מבוא
נוזל מוחי שדרתי (CSF) ודגימת דם חשובים לזיהוי ואימות סמנים ביולוגיים של אפילפסיה, הן במחקר פרה-קליני והן במחקר קליני 1,2. כיום, האבחנה של אפילפסיה ורוב המחקר על סמנים ביולוגיים של אפילפסיה מתמקדים ב- EEG והדמיה מוחית 3,4,5. גישות אלה, עם זאת, מציבות מספר מגבלות. מלבד מדידות שגרתיות בקרקפת, במקרים רבים, EEG דורש טכניקות פולשניות כמו אלקטרודות עומק6. שיטות הדמיה מוחית הן בעלות רזולוציה טמפורלית ומרחבית ירודה והן יקרות יחסית וגוזלות זמן 7,8
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פרארה ועל ידי משרד הבריאות האיטלקי (אישור: D.M. 603/2022-PR) בהתאם להנחיות המפורטות בדירקטיבה של מועצת הקהילות האירופית מיום 24 בנובמבר 1986 (86/609/EEC) להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות ניסוייות ומדעיות אחרות. פרוטוקול זה מותאם במיוחד לניתוחים כמותיים נוספים של תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) של חומצה ריבונוקלאית קטנה שאינה מקודדת (sncRNAs) בחולדה, CSF ופלזמה שהתקבלו תחת בקרת EEG בבעלי חיים אפילפטיים. לבחירתו, אנא עיין בסרטון JoVE הקשור להבנה טובה יותר ושיפורים של הניתוח 19,20,21.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאות של CSF שונים והליכי גמילה מדם שבוצעו ב -9 ביקורת ו -18 חולדות אפילפטיות, כולן מושתלות עם אלקטרודות חודש לאחר SE, מדווחת במונחים של שיעור הצלחה. לאחר ההשתלה, כל החולדות נוטרו באמצעות וידאו EEG במשך חודש אחד, שבמהלכו CSF בתוספת הדם הוצא 5x כל 3 ימים במהלך השבועיים האחרונים של הניסוי (כלומר, בימים 52, 55, 58, 61 ו-64 לאחר SE; dpSE). נתונים מנסיגות מרובות בבעלי חיים שונים שימשו להשוואת שיעור ההצלחה של איסוף CSF בחולדות בעלות ראש כפול שניחן בשתלים (מקופסאות שימורים למשיכת CSF) עם שיעור ההצלחה של איסוף CSF (שבוצע על יד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
העבודה הנוכחית מדגימה טכניקה קלה לשליטה של CSF ואיסוף דם בחולדות, אשר עשויה להיות שימושית לא רק למחקרים במודלים של אפילפסיה אלא גם של מצבים נוירולוגיים אחרים או מחלות כגון אלצהיימר, פרקינסון או טרשת נפוצה. במחקר אפילפסיה, שני הליכי הדגימה יחד עם וידאו-EEG הם אידיאליים כאשר מחפשים מתאם בין רמות של מולקולות מסיסות שונות לבין פעילות ההתקפים. מסיבה ספציפית זו, נעשה שימוש בהקלטת וידאו-EEG רציפה: i) על מנת לאבחן נכון אפילפסיה או ii) כדי לעקוב אחר השלבים השונים של התקדמות המחלה, ו / או iii) כדי להתאים דגימה עם התרחשות של התקפים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מענק מתוכנית העבודה Horizon 2020 של האיחוד האירופי (התקשר H2020-FETOPEN-2018-2020) במסגרת הסכם מענק 964712 (PRIME; ל- M. Simonato).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סט איסוף דם BD Vacutainer Safety-Lok | BD איטליה SpA, מילאנו, איטליה | 367246 | חומר |
| צינורות איסוף דם (Microtainer K2E) | BD איטליה SpA, מילאנו, איטליה | 365975 | חומר |
| עירוי כנפי פרפר 23G x 3/4 אינץ' 0.6 x 19 מ"מ | Nipro, אוסקה, יפן | PSY-23-ET-ICU | חומר |
| צנטריפוגה מקוררת ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, בקינגהאמשייר, אנגליה | 112000033 | חומר |
| תפר כותנה 3-0 | Ethicon, Johnson & ג'ונסון טכנולוגיות כירורגיות, רריטאן, ניו ג'רזי, ארה"ב | 7343H | חומר |
| דיאזפם 5 מ"ג/2 מ"ל, Solupam | Dechra מוצרים וטרינריים, טורינו, איטליה | 105183014 (AIC) | פתרון |
| וידאו דיגיטלי 8 ערוצים מערכת מקליט מדיה של טלמטריה EEG הוקמה Data | Sciences International (DSI), סנט פול, מינסוטה, ארה"ב | PNM-VIDEO-008 | ציוד |
| מערכת מעקב וידאו דיגיטלית של EEG קשור | רשת EZVIZ, האנגג'ואו, סינה | EZVIZ (V5.3.2) | חומר |
| חיטוי ציוד המבוסס על פרוקסידים מיוצבים ופעילות אמוניום רביעונית | מעבדת גרסין-בקטיניל, צרפת | LB 920111 | פתרון |
| צינורית מדריך דמה 8 מ"מ | Agn Tho's, Lindigö, שוודיה | CXD-8 | חומר |
| אלקטרודה 3 ערוצים דו-מעוותים | Invivo1, פלסטיק אחד, רואנוק, וירג'יניה, ארה"ב | MS333 / 3-B / SPC | |
| חומר מחזיק אלקטרודה לניתוח סטריאוטקסי | Agn Tho's, Lindigö, שוודיה | 1776-P1 | ציוד |
| Eppendorf BioSpectrometer בסיסי | Eppendorf AG, המבורג, גרמניה | 6137 | ציוד |
צינורות Eppendorf PCR 0.2 מ"ל | Eppendorf Srl, מילאנו, איטליה | 30124332 | חומר |
| Eppendorf μ Cuvette G1.0 | Eppendorf AG, המבורג, גרמניה | 6138 | ציוד |
| מחט האכלה גמיש 17G לחולדה | Agn Tho's, Lindigö שוודיה | 7206 | |
| חומר דשא טכנולוגיה מכשירים | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, פלזנטון, קליפורניה, ארה"ב | M665G08 | (מגבר AS40, תיבת ראש, כבלים מחברים, דגם טלפקטור RPSA S40) |
| איזופלורן 100%, IsoFlo | Zoetis, רומא, איטליה | 103287025 (AIC) | תמיסה |
| קטמין (Imalgene) | מריאל, טולוז, צרפת | 221300288 ( AIC) | תמיסה |
| ליתיום כלוריד | סיגמא-אולדריץ', מילאנו, איטליה | L9650 | חומר |
| צינורית מיקרו-הזרקה 31G 9 מ"מ | Agn Tho's, Lindigö שוודיה | CXMI-9 | חומר |
| MP150 רכישת נתונים מודולריים ו מערכת ניתוח | ביופאק, גולטה, קליפורניה, ארה"ב | ציוד | MP150WSW |
| משחה וטרינרית עיניים, Hylo night | Ursapharm, מילאנו, איטליה | 941791927 (AIC) | חומר |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, מילאנו, איטליה | P6503 | |
| חומר צינור PTFE עם מפרק | Agn Tho's, Lindigö, שוודיה | JT-10 | חומר |
| מלח | 0.9% NaCl, pH מותאם ל 7.0 | תמיסה | |
| סקופולמין הידרוברומיד טריהידראט | סיגמא-אולדריץ', מילאנו, איטליה | S2250 | חומר |
| סקופולמין מתיל חנקתי | סיגמא-אולדריץ', מילאנו, איטליה | S1876 | חומר |
| כסף סולפאדיאזין 1% קרם | Sofar, Trezzano Rosa, מילאנו, איטליה | 025561010 (AIC) | חומר |
| סימפלקס מהיר צמנט מתאקרילי דנטלי | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, סווינדון, בריטניה | ACR811 | |
| חומר מכשיר סטריאוטקסי | דיוויד קופף אינסטרומנטס, לוס אנג'לס, קליפורניה, ארה"ב | דגם 963 | ציוד |
| תמיסת סוכרוז | 10% סוכרוז במים מזוקקים | תמיסה תוצרת בית | |
| 1 מ"ל | ביוסיגמה, קונה, ונציה, איטליה | 20,71,26,03,00,350 | |
| טלמטר | מדעי הנתונים הבינלאומי (DSI), סנט פול, מינסוטה, ארה"ב | CTA-F40 | |
| טלמטריית חומרים מנתח עקבות EEG | מדעי הנתונים הבינלאומי (DSI), סנט פול, מינסוטה, ארה"ב | NeuroScore v3-0 | |
| ציוד מערכת טלמטריה | מדעי הנתונים הבינלאומי (DSI), סנט פול, מינסוטה, ארה"ב | חומרה פלוס תוכנה Ponemah ליבה 6.51 | ציוד |
| קסילזין הידרוכלוריד | סיגמא-אולדריץ', מילאנו, איטליה | X1251 | חומר |
מקורות
- Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
- Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
- Dl....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
