בידוד, הרחבה חוץ גופית ואפיון תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן אפידידימלית של עכבר

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הם תאים רב-פוטנציאליים בוגרים המתמיינים לתאים כגון אוסטאובלסט, כונדרובלסט ואדיפוציט ^1,2. תאים אלה שוכנים במספר איברים, ובגלל זה, הם יכולים להיות מופקים מרקמות בוגרות כגון מח עצם, שריר, שומן, זקיק שיער, שורש השן, שליה, דרמיס, פריכונדריה, חבל הטבור, ריאות, כבד, טחול ^3,4.

ההשפעות של MSCs על הפיזיולוגיה והמערכת החיסונית דווחו ^5,6. תאים אלה היו מבטיחים לטיפול במספר מחלות, הן ברפואה האנושית והן ברפואה הווטרינרית. MSCs יכולים לשלוט בדלקת ולקדם אנגיוגנזה והומאוסטזיס רקמות באמצעות מנגנונים שונים, כגון מגע בין תאים, גורמים מסיסים ובועיות חוץ-תאיות קטנות 7,8,9,10. יתר על כן, MSCs הם תאים בעלי זכויות חיסון המסוגלים לשרוד אצל מושתלים אלוגניים שאינם תואמים אימונולוגית מכיוון שתאים אלה מראים ביטוי נמוך של מולקולות מורכבות היסטותאימות עיקריות מסוג I (MHC) ומשמשים בטיפול מבוסס תאים להשתלה אלוגנית^11,12. האימונוגניות הנמוכה בשילוב עם הפוטנציאל הרגנרטיבי הופכת MSCs למועמדים אידיאליים לטיפול תאי, כגון מחלת השתל נגד המאכסן (GvHD)¹³, זאבת אדמנתית מערכתית (SLE)¹⁴, וטרשת נפוצה¹⁵, בין היתר^16,17.

למרות העובדה כי MSCs שוכנים במספר רקמות בוגרות, רקמת השומן מציעה יתרונות על פני מקורות אחרים, כגון נגישות לקציר, עם התערבות כירורגית מינימלית; מספר גדול של תאים זמינים עם קצב התפשטות גבוה; והרחבה קלה במבחנה באמצעות פרוטוקול קל לביצוע ללא צורך בציוד ספציפי וחומרים בעלות נמוכה 18,19,20. לאחר החילוץ, יש לאפיין את תאי הגזע שמקורם ברקמת השומן (ADSCs) כפי שהוקם על ידי האגודה הבינלאומית לטיפול תאי (ISCT)²¹. לפיכך, MSCs חייבים להראות מורפולוגיה דמוית פיברובלסט, דבקות בתרבית פלסטית, המבטאת אחוז גבוה (≥95%) של סמנים מזנכימליים כגון אנדוגלין (CD105), ecto-5'-nucleotidase (CD73) ו- Thy-1 (CD90), ואחוז נמוך (≤2%) של סמנים hematopoietic כגון אנטיגן משותף לויקוציטים (CD45), פוספוגליקופרוטאין transmembrane (CD34), גליקופרוטאין קרום מעוגן גליקוליפיד (CD14), integrin alpha M (CD11b), שרשרת אלפא חלבון משויך קולטן אנטיגן B (CD79α) או B-לימפוציטים פני השטח אנטיגן B4 (CD19) ואנטיגן לויקוציטים אנושי סוג II (HLA-II). יתר על כן, נדרש אפיון פונקציונלי, והתאים צריכים להיות מסוגלים להתמיין לתאי אוסטאובלסט, כונדרובלסטים או אדיפובלסטים²¹.

כאן, אנו מראים כיצד להשיג את MSCs מרקמת שומן אפידידימלית באמצעות דיסוציאציה מכנית ועיכול אנזימטי עבור מחקרי מבחנה והאפיון המורפולוגי שנקבע מראש על ידי ISCT.

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי הנחיות בינלאומיות לאתיקה של בעלי חיים ואושרו על ידי ועדות מוסדיות לטיפול ושימוש מאוניברסיטת המדינה של סנטה קרוז תחת פרוטוקול מספר 021/22. עכברים זכרים שוויצרים (6-8 שבועות) נרכשו מהמעבדה להרבעה, תחזוקה וניסויים בבעלי חיים - מתקן מחקר בעלי חיים של אוניברסיטת סנטה קרוז (LaBIO-UESC), מתוחזקים בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים, ומקבלים מים ומזון עם מחזורי אור / חושך של 12 שעות.

הערה: ניתן להשתמש בשושלת עכברים אחרת; אנו ממליצים על שימוש בעכברים בוגרים (6-8 שבועות) מכיוון שיש להם רקמת שומן מפותחת יותר ותאים עם פעילות שגשוג גבוהה.

1. הכנה

הערה: לפני שתמשיך, הכן את הריאגנטים הבאים המתוארים להלן. עיין בטבלת החומרים לקבלת מידע על מגיבים וספקי חומרים. יש ללבוש ציוד מגן אישי כגון מסכות, כובעים, מעילי מעבדה וכפפות בכל ההליכים המעשיים.

1. מיצוי רקמת שומן אפידידימלית
   1. שמור את חומרי הניתוח: שלושה סטים של פינצטה סטרילית ומספריים, חמש מחטים, וכוס המכילה 200 מ"ל של 70% אתנול.
   2. הכינו חומר הרדמה סופני, תוך ערבוב קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג).
2. תרבות ADSCs
   1. מדיום בסיסי: הכינו את מדיית הגלוקוז הגבוהה Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, 0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B, 100 U/מ"ל פניצילין וסטרפטומיצין 100 מ"ג/מ"ל.
   2. תמיסת עיכול: יש להכין 0.15% של collagenase type II ב-PBS מעוקר במסנן של 0.25 מיקרומטר.
      הערה: אין צורך להשתמש בארבע האנטיביוטיקות המתוארות בתווך הבסיסי. זה יהיה תלוי בתנאי תרבית התא של המעבדה שבה זה מבוצע.
3. אפיון פנוטיפי של ADSCs
   1. הכינו אלבומין בסרום בקר 1% (BSA) ב-PBS.
   2. דללו את הנוגדנים נגד עכברים כפי שמוזכר בטבלה 1.
   3. הכינו פורמלדהיד 2% ב-PBS.
4. התמיינות אוסטאוגנית של ADSCs
   1. מדיום התמיינות אוסטאוגני: הכינו DMEM בתוספת חומצה אסקורבית 5.67 M, 10 ננומטר דקסמתזון, 0.02 M β-גליצרופוספט, 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
   2. לצביעת פון קוסה, הכינו את התמיסות הבאות: 70% אתנול במים, 5% כסף חנקתי במים, מים מזוקקים, 5% נתרן תיוסולפט במים ו-1% אאוסין B במים.
5. בידול אדיפוגני:
   1. מדיום התמיינות אדיפוגני: הכינו DMEM בתוספת 0.5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine, 200 μM indomethacin, 1 μM dexamethasone, 10 μM אינסולין, 10% FBS, ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
   2. לצביעת שמן-אדום, הכינו את התמיסות הבאות: 10% פורמלין במים שעברו דה-יוניזציה, 60% איזופרופנול במים שעברו דה-יוניזציה, ליזוכרום (צבע מסיס בשומן) דיאזו (תמיסת Oil-Red O) ב-60% איזופרופנול, ו-1% המטוקסילין במים שעברו דה-יוניזציה.
6. התמיינות כונדרוגנית:
   1. מדיום התמיינות כונדרוגני: הכינו מדיום כונדרוגני בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
   2. הכינו 10% פורמלדהיד ב-PBS.
   3. לצביעת פרוטאוגליקנים וגליקוזאמינוגליקנים, הכינו את התמיסות הבאות: כתם הטרוגליקן (כחול אלקיאן 1%) בחומצה אצטית, pH 2.5, פרפין, המטוקסילין, דילול סדרת אתנול במים (100%, 96%, 80% ו-70%).

טבלה 1: נוגדנים המשמשים לאפיון פנוטיפי של ADSCs לפי ציטומטר זרימה. רשימת נוגדנים עם פלואורוכרומים, דילולים, שיבוט וריכוז סופי בהתאמה וכן תפקידם בתא המתבטא.

2. שיטות

הערה: רקמת השומן מפוזרת בכל הגוף במקומות תת עוריים או תוך בטניים. בעכברים, רקמות השומן הנפוצות ביותר המשמשות לניסויים כוללות אפידידימלי תת-עורי, מזנטרי ורטרופריטוניאלי²². כאן מוצגים השלבים להשגת רקמת שומן אפידידימלית (איור 1).

איור 1: תכנון ניסויי להשגת תאי גזע שמקורם ברקמת שומן מעכברים שוויצרים. (א) בעזרת מחטים הניחו את בעל החיים על לוח הפקק או הקלקר; (B) להרים את העור באמצעות פינצטה, לבצע חתך במרכז אזור הבטן ולנתק את העור מהצפק; (ג) לזהות את רקמת השומן הלבנה מעל האפידידימיס; (D) להעביר את הרקמה למדיום DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% אנטיביוטיקה, לשטוף את רקמת השומן האפידידימלית ביסודיות עם PBS, ולהעביר את הרקמה לעיכול תמיסה; (E), לפרק את הרקמה ו-(F) לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת תוך ניעור נמרץ כל 10 דקות; (G) לאחר ספירת התאים, לוחים בלוחות בעלי 6 בארות ומתבוננים במורפולוגיית התא תחת מיקרוסקופ הפוך. (F) המורפולוגיה של התא תשתנה מעגולה לדמוית פיברובלסט. סרגל קנה מידה = 22.22 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. מיצוי רקמת שומן אפידידימלית
   הערה: שים לב שכל ההליכים חייבים להתבצע בתנאים סטריליים בארון זרימה למינרי על מנת להבטיח תרבית תאים טהורה ונטולת זיהום.
   1. הרדימו את בעלי החיים באמצעות קטמין ותמיסת קסילזין (100 ו-10 מ"ג/ק"ג, כמתואר בשלב 1.1.2) בדרך תוך צפקית.
      הערה: ניתן להשתמש בשיטות המתת חסד אחרות²³. ודא שהחיה מתה על ידי אישור היעדר פעימת לב.
   2. הניחו את החיה כשהצד הגחוני פונה כלפי מעלה על לוח שעם או קלקר מכוסה ברדיד אלומיניום וקיבעו אותה באמצעות מחטים סטריליות (איור 1A).
      הערה: כדי למנוע זיהום, יש לרסס 70% אלכוהול באזור הבטן. לחלופין, יש לגלח את השיער בעזרת אזמל.
   3. הרימו את העור באמצעות פינצטה במרכז אזור הבטן ובצעו חתך בעזרת מספריים סטריליים.
      הערה: שני סטים של פינצטה סטרילית ומספריים נחוצים כדי למנוע זיהום. הראשון משמש לפתיחת החיה, חיתוך העור ושכבת הצפק; השני משמש להרים את רקמת השומן epididymal. כמו כן, שמור 150 מ"ל של אלכוהול 70% בכוס כדי לנקות מספריים פינצטה בין צעדים.
   4. הכניסו את המספריים מתחת לעור של החיה ופתחו אותה כדי לנתק אותה מהצפק (איור 1B). מרימים את שכבת הצפק באמצעות פינצטה וחותכים במספריים סטריליים.
   5. השתמש קבוצה נוספת של פינצטה סטרילית ומספריים ולזהות את epididymis מעל האשכים ואת רקמת השומן הלבן מעל epididymis. משכו את כל רקמת השומן האפידידימלית באמצעות פינצטה סטרילית, בגודל של כ-2 ס"מ, וחתכו קרוב מאוד לאפידידימיס (איור 1C).
   6. הכניסו את השומן לתוך צינור חרוטי סטרילי בנפח 50 מ"ל שמכיל תווך בסיסי והניחו אותו על קרח (איור 1D). במכסה המנוע, המשך לשלבים הבאים כמתואר להלן.
2. בידוד תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ADSCs)
   הערה: עבד את הדגימות במכסה מנוע זרימה למינרית ביולוגית מסוג II, ועל הצוות ללבוש חלוק מעבדה, כפפות ומסכה כירורגית.
   1. לשטוף את רקמת השומן epididymal ביסודיות עם PBS.
      הערה: שלב זה חיוני כדי להסיר את הדם וחלקיקים אחרים מהדגימה. הדם יכול לעכב אנזים קולגנאז מסוג II ולסכן את הניסוי.
   2. באמצעות טוויטר סטרילי, להעביר את רקמת השומן epididymal לתוך צינור 50 מ"ל המכיל 15-20 מ"ל של פתרון digest, מוכן כמו שלב 1.2.2. שברו את הרקמה באמצעות מספריים סטריליים ודגרו על הרקמה בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת (איור 1E, F).
      הערה: אמבט מים או אינקובטור ב 37 °C (77 °F) ניתן להשתמש בשלב זה. כל 10 דקות, ההשעיה חייב להיות מזועזע במרץ כדי להקל על העיכול. אין להאריך את זמן הדגירה של שעה אחת.
   3. השבת את collagenase על ידי דילול הדגימה 1: 1 בתווך בסיסי צנטריפוגה את המתלה ב 250 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי לקבל את החלק הווסקולרי של סטרומה. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום בזאלי.
   4. בדקו את הכדאיות וספרו את התאים בשיטת הרחקת הצבע הכחול טריפאן בתא נויבאואר באמצעות דילול של 1:10 או 1:100.
      הערה: התשואה הצפויה היא סביב 0.5-1 מיליון תאים/גרם של רקמת שומן מעובדת וכדאיות של 80%.
   5. צלחת את התאים המבודדים (0.3-0.5 מיליון) ב 3 מ"ל של מדיום בסיסי בבאר אחת של צלחת 6 בארות. לדגור על התאים לילה ב 37 ° C עם 5% CO₂.
   6. למחרת: מוציאים את המדיום מהבאר ושוטפים את התאים עם PBS. מוסיפים 3 מ"ל של מדיום בסיסי. חזור על תהליך זה כל יומיים עד שהתאים הופכים למפגש של 90%.
      הערה: תמיד התבוננו במורפולוגיה של התאים מתחת למיקרוסקופ ההפוך, המשתנה מעגול לדמוי פיברובלסט (איור 1H).
3. הרחבת תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ADSCs)
   הערה: ברגע שהתאים גדלים ~ 90% נפגשים, המשך לתת-תרבית כמתואר להלן.
   1. הסר את המדיום מן הבאר ולשטוף את התאים עם PBS. הוסיפו 0.5 מ"ל/באר של טריפסין/EDTA (0.05% טריפסין; 200 מ"ג/ליטר EDTA) ודגרו על הצלחת למשך 3-5 דקות ב-37°C כדי לנתק את התאים.
      הערה: אין לחרוג מ-5 דקות במינון טריפסין/EDTA. יש לאמת את הניתוק המלא של התאים תחת המיקרוסקופ ההפוך. ניתן להאיץ את התהליך על ידי זינוק בזהירות למעלה ולמטה או הקשה על צד הצלחת.
   2. נטרל את האנזים על ידי דילול הדגימה ביחס 1:1 ב-DMEM בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ואנטיביוטיקה 1%.
   3. לפצל את תרחיף התא ל 2 בארות ולהוסיף 3 מ"ל של מדיום בסיסי (DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה). יש לדגור למשך הלילה ב-37°C עם 5% CO₂.
   4. שנה מדיום למחרת, ולאחר מכן כל יומיים עד 90% מפגש.
   5. חזור על התהליך עד לקטע השלישי והמשך לפנוטיפ ואפיון פונקציונלי.
      הערה: שימו לב תמיד למורפולוגיה של התאים מתחת למיקרוסקופ ההפוך, המשתנה מעגול לדמוי פיברובלסט.
4. אפיון תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ADSCs)
   1. אפיון פנוטיפי לפי ציטומטריית זרימה
      1. נתק את התאים באמצעות טריפסין/EDTA, כמתואר בשלבים 2.3.1 עד 2.3.2.
      2. לאסוף את התאים בצינור חרוטי (50 מ"ל) וצנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של PBS.
      3. ספור את התאים כמתואר בשלב 2.2.4 וזרע 0.5-1 x 10⁶ תאים ב 100 μL של PBS בצלחת 96 באר.
         הערה: מספר הבארות יהיה תלוי בצבע של מצומד פלואורוכרום ואת המסננים/לייזרים של הציטומטר.
      4. הוספת נוגדנים (טבלה 1) מדוללים ב-1% BSA ב-PBS.
         הערה: אין צורך להשתמש בבלוק Fc כדי למנוע קשירה לא ספציפית מכיוון שאנו כבר משתמשים ב- BSA כדי לדלל נוגדנים. שמור דגימה של תאים ללא קבלת נוגדנים שישמשו כבקרה של צביעה. ניתן לשלב את הנוגדנים באותה באר בהתאם לצבע הפלואורוכרום ולציטומטר הקיימים במעבדה. ניתן להוסיף את כל הנוגדנים המתוארים בטבלה 1 באותה באר, למעט CD71 FITC ו- CD29 FITC, אשר חייבים להיות בבארות שונות בגלל אותו פלואורוכרום.
      5. לדגור על הצלחת במשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
      6. לשטוף תאים, ולאחר מכן להשלים את נפח ל 200 μL באמצעות PBS, צנטריפוגה את הצלחת ב 252 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C, ולהשליך את supernatant. חזור על שלב זה פעם נוספת.
      7. תקן את התאים על ידי הוספת 200 μL לכל באר של 2% פורמלדהיד ב- PBS. אחסנו את התאים בחושך בטמפרטורה של 4°C עד לניתוח בציטומטר הזרימה.
         הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, רכוש את התאים בציטומטר הזרימה בהקדם האפשרי. בהירות הפלואורסצנטיות של הסמנים דועכת באופן משמעותי לאחר 48 שעות עבור רוב הפלואורוכרומים. אז, לא יעלה על 48 שעות לקרוא את הצלחת. מומלץ לרכוש 30,000 אירועים.
      8. השתמשו באסטרטגיית ה-gating המוצגת באיור 2B כדי לבחור את אוכלוסיית ה-ASC.
   2. אפיון פונקציונאלי: התמיינות אוסטאוגנית
      1. נתק את התאים באמצעות טריפסין/EDTA (כמתואר בשלבים 2.3.1 עד 2.3.2), אסוף וצנטריפוגה את התאים (כמתואר בשלבים 2.4.1.2 ו- 2.4.1.2) וספור אותם (כמתואר בשלבים 2.2.4).
      2. צלחת, במשולש, 2 x 10⁵ תאים לכל באר בצלחות 6 באר במדיאלי בסיסי (DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה); יש לדגור ב-37°C ב-5% CO₂.
         הערה: יהיה צורך בשתי צלחות בנות 6 בארות, אחת לכל זמן בידול (14 ו-21 יום).
      3. למחרת, שנה את המדיום למדיום אוסטאוגני (שלב 1.4.1).
         הערה: שמור 3 בארות להיות בתרבית רק עם המדיום הבסיסי, אשר יהיה הבקרה עבור בידול.
      4. תרבית תאים במשך 14 ו -21 ימים במדיה אוסטאוגנית ובתאי הביקורת, החלפת מדיה כל 3 ימים. המשך לצביעת פון קוסה (שלב 1.4.2) כדי להעריך את הגושים המינרליים בסוף כל תקופת תרבית.
      5. שאפו את המדיום מכל באר ושטפו את התאים פעמיים עם PBS. תקן את התאים עם 2 מ"ל של אתנול 70% לילה בטמפרטורת החדר (RT). שטפו את התאים בזהירות במים זורמים.
      6. הוסף 2 מ"ל של תמיסת חנקת כסף 5% ודגר על הצלחת באור אולטרה סגול למשך שעה אחת. לשטוף את התאים עם מים מזוקקים. מוסיפים 2 מ"ל של 5% נתרן תיוסולפט, ודגרים במשך 5 דקות. יש לשטוף במים מזוקקים.
      7. כתם נגדי עם 2 מ"ל של eosin במשך 40 שניות. יש לשטוף במים מזוקקים עד להסרת תמיסת הצביעה, ולדמיין את הצביעה באמצעות מיקרוסקופ אופטי.
   3. אפיון פונקציונאלי: בידול אדיפוגני
      1. נתק את התאים באמצעות טריפסין/EDTA (כמתואר בשלבים 2.3.1 עד 2.3.2), אסוף וצנטריפוגה את התאים (כמתואר בשלבים 2.4.1.2 ו- 2.4.1.2) וספור אותם (כמתואר בשלבים 2.2.4).
      2. צלחת 2 x 10⁵ תאים לכל באר בצלחות 6 באר במדיאלי בסיסי (DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה); יש לדגור ב-37°C ב-5% CO₂.
         הערה: יהיה צורך בשתי צלחות בנות 6 בארות, אחת לכל זמן בידול (14 ו-21 יום).
      3. למחרת, שנה את המדיום למדיום אדיפוגני (שלב 2.5.1).
         הערה: שמור 3 בארות להיות מתורבת רק עם המדיום הבסיסי כמו בקרה.
      4. תאי תרבית במשך 14 ו -21 יום בתווך אדיפוגני, החלפת מדיה כל 3 ימים. בסוף כל תקופת תרבית, המשיכו לצביעת O אדום שמן (שלבים 2.4.3.5-2.4.3.7), אינדיקטור להצטברות שומנים תוך תאיים.
      5. שאפו את התקשורת מכל באר. שטפו את התאים פעמיים עם PBS. תקן תאים ב 2 מ"ל של 10% פורמלין במשך 1 שעות. יש לשטוף פעם אחת עם PBS, ולאחר מכן פעם אחת עם מים.
      6. יש לצבוע עם 2 מ"ל של תמיסת Oil-Red O באיזופרופנול 60% למשך 5 דקות. יש לשטוף פעם אחת במים מזוקקים.
      7. כתם נגדי עם 2 מ"ל של 1% hematoxylin מדולל 1: 2 במים מזוקקים במשך 1 דקה. יש לשטוף במים מזוקקים עד להסרת תמיסת הצביעה, ולדמיין את הדגימות המוכתמות באמצעות מיקרוסקופ אופטי.
   4. אפיון פונקציונאלי: התמיינות כונדרוגנית
      1. נתק את התאים באמצעות טריפסין/EDTA (כמתואר בשלבים 2.3.1 עד 2.3.2), אסוף וצנטריפוגה את התאים (כמתואר בשלבים 2.4.1.2 ו- 2.4.1.2) וספור אותם (כמתואר בשלבים 2.2.4).
      2. מניחים 5 x 10⁵ ADSCs בארבעה צינורות חרוטי פוליפרופילן וצנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות כדי ליצור כדור. השליכו את הסופרנטנט.
      3. תרבית את הכדוריות בצינור חרוטי בתווך כונדרוגני (שלב 1.6.1) או רק בתווך בסיסי (בקרת התמיינות) במשך 14 ו -21 ימים ב 37 ° C ב 5% CO₂. החליפו מדיום כל 3 ימים והימנעו מהוצאת כדורים.
         הערה: כל כדורית תא מתייחסת לכל זמן תרבית, כמו גם לבקרות בהתאמה שגדלו רק עם מדיום בסיסי.
      4. בסוף כל נקודת זמן בתרבית, אספו את הכדוריות באמצעות פינצטה עדינה והניחו אותן בצלחת בת 24 בארות. המשך לחתך היסטולוגי וצביעה של פרוטאוגליקנים וגליקוזאמינוגליקנים (שלבים 2.4.4.5.-2.4.4.9).
         הערה: כל גלולה מעובדת בבאר נפרדת.
      5. תקן כדורים ב 2 מ"ל של 10% פורמלדהיד חוצץ במשך 30 דקות. השליכו את תמיסת הפורמלדהיד והוסיפו 2 מ"ל אתנול 70%. מוציאים את הגלולה מהצינור החרוטי בעזרת קצה ומטמיעים את הכדוריות בפרפין.
      6. באמצעות מיקרוטום פרפין מסתובב, לעשות 5 מיקרומטר חתכים היסטולוגיים. לדגור על החלקים במשך 15 דקות ב 60 ° C, ולטבול אותם פעמיים xylene (במשך 5 ו 15 דקות).
      7. יש להחזיר לחות לדגימות על ידי טבילת החלקים ההיסטולוגיים באמבטיות אלכוהול בריכוזים יורדים (100%, 96%, 80% ו-70%) למשך 2 דקות כל אחת, ולאחר מכן לשטוף במים נטולי יונים, במשך 5 דקות.
      8. המשיכו להכתים את הדגימות עם Alcian blue 1% בחומצה אצטית, pH 2.5, למשך 30 דקות.
      9. כתם נגדי עם hematoxylin במשך 1 דקות, ולשטוף עם מים מזוקקים. הרכבה עם DPX (mountant עבור היסטולוגיה) או פתרון הרכבה אחר ולהמחיש דגימות באמצעות מיקרוסקופ אופטי.

תאים שחולצו מרקמת השומן על פי הפרוטוקול המוצג כאן הראו מורפולוגיה התואמת את הקריטריונים המינימליים עבור MSCs המוצעים על ידי ISCT. סקירה כללית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1. באופן פנוטיפי, ADSCs הראו היצמדות למורפולוגיה פלסטית ודמוית פיברובלסטים בימים הראשונים של תרבית תאים (איור 2A). בנוסף, הם גדלו הומוגנית ויצרו מושבות. יתר על כן, ADSCs הראו ביטוי נמוך של CD34 (2.12%) ו- CD45 (1.81%), הן סמנים המטופויאטיים, והן ביטוי גבוה של CD71 (42.6%), CD29 (74.2%) ו- CD90 (55.1%), כל סמני התאים המזנכימליים (איור 2B).

איור 2: אפיון פנוטיפי של תאים שמקורם ברקמת שומן. (A) מורפולוגיית ADSCs משתנה מסבב לדמוי פיברובלסט בימים 2, 4 ו-8 של התרבית; סרגל קנה מידה = 22.22 מיקרומטר. (B) היסטוגרמות לסמנים המבוטאים (CD71, CD29 ו- CD90) או לא (CD34 ו- CD45) על ידי ASC. נתון זה שוחזר באישור מירנדה ואחרים 24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מבחינה פונקציונלית, ADSCs הראו רב-עוצמה להתמיין לאוסטאובלסט, אדיפובלסט וכונדרובלסט כאשר תורבתו במדיה מותנית עבור כל שושלת במשך 14 או 21 יום (איור 3). צביעת פון קוסה חשפה גושים מינרליים במטריצה החוץ תאית, האופייניים לתהליך האוסטאוגנזה (איור 3). צביעת O בצבע אדום-שמן העידה על ואקואולות שומנים בציטופלסמה של ADSCs, והצביעה הכחולה של Alcian אישרה את נוכחותו של גליקוזאמינוגליקן במטריצה החוץ תאית (איור 3). יחד, מאפיינים פנוטיפיים ופונקציונליים אישרו את אוכלוסיית התאים שהופקו מרקמת שומן אפידידימלית כ- MSCs.

איור 3: אפיון פונקציונלי של תאים שמקורם ברקמת שומן. פוטנציאל רב-שושלות אוסטאוגני, אדיפוגני וכונדרוגני של ADSC לאחר 14 ו-21 יום בתרבית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (פנל עליון), 100 מיקרומטר (פנלים אמצעיים ותחתונים). נתון זה שוחזר באישור מירנדה ואחרים 24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין מה לחשוף.