כתב יד זה מפרט פרוטוקול חיסון אופטימלי המשתמש בנדן עלי תירס מנותק למחקרים ציטולוגיים, פיזיולוגיים ומולקולריים הניתנים לשחזור של אינטראקציות תירס עם פתוגנים צמחיים פטרייתיים. מעטה העלים מאפשר תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תאיות בין הצמח החי לפטרייה ברקמות לא מקובעות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
נדן תירס מנותק להדמיית תאים חיים של זיהום על ידי פתוגנים פטרייתיים של תירס פוליארי
במאמר זה
סיכום
תקציר
ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול לחיסון נדן עלי תירס עם פטריות פתוגניות המיביוטרופיות ונקרוטרופיות. השיטה שונה משיטה שיושמה במקור על נדן עלי אורז ומאפשרת תצפית מיקרוסקופית ישירה על גדילה והתפתחות פטרייתיות בתאי צמחים חיים. נדני עלים שנאספו משתילי תירס עם שני צווארוני עלים מלאים מחוסנים בטיפות של 20 μL של 5 x 105 נבגים/מ"ל תרחיפים של נבגים פטרייתיים ומודגרים בתאי לחות ב -23 מעלות צלזיוס תחת אור פלואורסצנטי רציף. לאחר 24-72 שעות, רקמה עודפת מוסרת עם סכין גילוח כדי להשאיר שכבה אחת של תאי אפידרמיס, דגימה שקופה אופטית שניתן לצלם ישירות ללא צורך בקיבוע כימי או ניקוי. תאי צמחים ופטריות נשארים בחיים למשך הניסוי וניתן לדמיין אינטראקציות בזמן אמת. נדן יכול להיות מוכתם או נתון פלסמוליזה כדי לחקור את הציטולוגיה ההתפתחותית ואת הכדאיות של תאים מארח פתוגן במהלך זיהום וקולוניזציה. זנים פטרייתיים שעברו טרנספורמציה כדי לבטא חלבונים פלואורסצנטיים יכולים להיות מחוסנים או מחוסנים במשותף על הנדן לקבלת רזולוציה מוגברת וכדי להקל על הערכת אינטראקציות תחרותיות או סינרגטיות. זנים פטרייתיים המבטאים חלבוני היתוך פלואורסצנטיים יכולים לשמש למעקב וכימות הייצור והמיקוד של חלבונים בודדים אלה בצמח. ניתן לחלץ רקמות מעטפת מחוסנות כדי לאפיין חומצות גרעין, חלבונים או מטבוליטים. השימוש בבדיקות נדן אלה קידם מאוד את המחקרים המפורטים של מנגנוני הפתוגנניות הפטרייתית בתירס וגם של חלבונים פטרייתיים ומטבוליטים משניים התורמים לפתוגנים.
מבוא
ניתוחים מרחביים וזמניים ברמה התאית הם קריטיים להבנת הפיזיולוגיה והציטולוגיה של אינטראקציות פטרייתיות-צמחיות. רקמות פוליאריות שקובעו כימית 1,2,3 או נוקו ומוכתמות4, כמו גם קרומים מלאכותיים 5, שימשו בעבר לחקר הציטולוגיה של התפתחות פתוגן עלווה ואינטראקציות צמחיות-פטרייתיות. עם זאת, חקירת אירועי זיהום ברקמות מארחות חיות בזמן אמת ללא קיבוע או ניקוי היא מאתגרת בשל בעיות טכניות הקשורות להכנת דגימות שקופות אופטית להדמיה.
פרוטוקול חיסון נגד נדן עלים מנותק פותח בסוף שנות ה-40 של המאה ה-20 לצורך חקירה מיקרוסקופית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: זרימת העבודה עבור השיטה מוצגת באיור 1.
איור 1: שלבים בפרוטוקול החיסון הממוטב באמצעות נדן עלי תירס מנותק. הכנת תרחיף נבגים, חיסון נדן עלים והכנת דגימה למיקרוסקופ תאים חיים מודגשים בתיבות ירוקות (A), סגולות (B) וכתומות (C), בהתאמה. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הדוגמאות שלהלן מתארות תוצאות מייצגות בעקבות השימוש בשיטת החיסון נגד נדן עלי תירס. דוגמאות אלה מדגימות את הקלות, המהירות והדיוק שבהם ניתן לבצע תצפית והשוואה של אינטראקציות תירס-פטרייה בזמן אמת באמצעות בדיקה אופטימלית זו. הדמיה של תאים חיים מאפשרת גם חילוץ מידע כמותי, ומספקת כלי שימושי למחקרים מולקולריים, ציטולוגיים ופיזיולוגיים השוואתיים. פרטים נוספים ניתן למצוא בפרסומים המקוריים שצוטטו עבור כל בקשה מוצלחת.
נתונים לדוגמה 1: שימוש בכתמים ופלסמוליזה בנדן עלים מחוסנים להערכת מצב פטרייתי וא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטת החיסון האופטימלית של נדן העלים המתוארת כאן שונה מפרוטוקול מקורי שפותח ויושם על נדן עלי אורז 6,8,36. הוא מאפשר תצפיות ישירות ומפורטות על גדילה והתפתחות פטרייתיות בתאי צמח חיים באמצעות מיקרוסקופ רחב או קונפוקלי. הפרוטוקול מתאים לאפיון, השוואה וכימות של מגוון תופעות מיקרוסקופיות במהלך התיישבות תירס, כולל התפתחות פטריות ותגובות פונדקאי במהלך אינטראקציות תואמות לעומת לא תואמות; ייצור והפרשת חלבונים פטרייתיים ספציפיים בצמח
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ואין להם מה לחשוף.
תודות
המחברים מודים למשרד החקלאות האמריקאי על תמיכתם הכספית (מספרי המענקים 2018-67013-28489 ו-2020-70410-32901). כל הדעות, הממצאים, המסקנות או ההמלצות המובעות בכתב יד זה הן אך ורק של המחברים ואינן משקפות בהכרח את השקפותיו של משרד החקלאות האמריקאי. אנו מודים לסטודנטית מברזיל המבקרת ב"מדע ללא גבולות", מיארה דה סילבה, על התמונות שמופיעות באיור 6A ובאיור 7D. אנו מודים גם למחלקה לפתולוגיה של צמחים באוניברסיטת קנטקי על מתן גישה למיקרוסקופים קונפוקליים של אולימפוס.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מצלמת מיקרוסקופ מונוכרום Axiocam | ZEISS | 426560-9010-000 | תואמת למיקרוסקופ Axioplan 2; מספקת רעש קריאה נמוך ומהירות גבוהה להדמיית תאים חיים |
| מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי Axioplan 2 | ZEISS | N/A | מאפשר צפייה חיה וצילום תמונה/וידאו של דגימות ביולוגיות |
| צנטריפוגה ספסלית 24 X 1.5/2 מ"ל | תרמו פישר סיינטיפיק | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; מהירות מקסימלית: 13,300 סל"ד (17,000 x גרם) |
| צלחת פטרי בקטריולוגית פלקון עם מכסה | פישר סיינטיפיק | 08-757-105 | חומר פוליסטירן; משטח הידרופובי |
| נייר סינון | פישר סיינטיפיק | 09-920-115 | Whatman דרגה 1 לתאים לחים של צלחת פטרי |
| FV 3000 מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר | אולימפוס N | / A | להדמיה של טרנספורמטורים פטרייתיים' |
| נייר נביטה | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# משקל כבד עבור תאים לחים בקופסת פלסטיק |
| צלחות פטרי זכוכית | VWR International | 75845-542 | סוג 1 מחלקה A, 33 זכוכית בורוסיליקט הרחבה; סט שלם (כיסוי + תחתון), לתאי לחות לצלחת פטרי |
| צמר זכוכית | כימיקלים מיוחדים בעמק אוהיו | 3350 | ליחידות סינון צמר זכוכית |
| Hemocytometer/Neubauer תא ספירה וכיסוי זכוכית | VWR International | 15170-172 | 0.1 מ"מ עומק תא; מגיע עם שני כיסויי כיסוי 0.4 מ"מ |
| כיסויי מיקרוסקופ | Fisher Scientific | 12-553-457 | זכוכית בורוסיליקט; 100/Pk.; אורך 22 מ"מ, רוחב 22 מ"מ |
| זן תירס זרעי יובל הזהב | זרעי החוף המערבי בע"מ, דלתא, קולומביה הבריטית, קנדה | CN361 | בוגר תוך 95-105 ימים; סוג זרע: |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה F1 | ארה"ב מדעית | 1415-2500 | קיבולת 1.5 מ"ל |
| שקופיות מיקרוסקופ | פישר סיינטיפיק | 12-550-123 | שקופית לשונית לבנה Superfrost; אורך 76 מ"מ, רוחב 25 מ"מ |
| שיבולת שועל אגר (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 גרם |
| לק | Revlon | 43671 | לק שקוף לאיטום שקופיות מיקרוסקופ; צבע 771 |
| צלחת PCR שקופה ללא חצאית 96 בארות | ארה"ב Sientific | 1402-9500 | 100 uL נפח צלחת |
| מזיק לצינורות מיקרוצנטריפוגה | ארה"ב Scientific | 1415-5390 | קצה חרוטי; חומר פוליפרופילן |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM מטרת מים | אולימפוס | 1-UB933 | תואם למיקרוסקופ קונפוקלי אולימפוס FV 3000 |
| תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco תפוחי אדמה דקסטרוז מדיה, BD; 500 גרם |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | מצע גידול פרימיום לשימוש כללי שפותח כדי לספק a איזון אגירת מים וניקוז תקין |
| SC10 קונוסים | חממה מגה-סטור | CN-SS-SC-10B | קוטר 1.5 אינץ', עומק 8.25 אינץ' ונפח 164 מ"ל |
| SC10 מגש חרוטים | חממה מגה-סטור | CN-SS-SCTR98 | אורך 24 אינץ' x רוחב 12 אינץ' x גובה 6.75 אינץ'; מחזיק עד 98 מחזיקי חרוטים SC10 |
| סכין גילוח קצה יחיד | להב Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec; חומר פלדה; להב באורך 38 מ"מ |
| מיכלי אחסון/קופסאות עם סגירת תפס | יעד | 002-02-0405 | קופסאות אחסון ברורות לתא rmoist; מידות חיצוניות: 23 5/8 אינץ' x 16 3/8 אינץ' x 6 1/2 אינץ'; קיבולת של 32 ל' |
מקורות
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
