הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יצירת מודלים של פגיעות רשתית בראשנים של קסנופוס

2.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65771

⸱

13 באוקטובר 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Paris-Saclay Institute of Neuroscience, CNRS, Université Paris-Saclay

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פיתחנו מספר פרוטוקולים לגרימת נזק ברשתית או ניוון רשתית בראשנים מסוג Xenopus laevis . מודלים אלה מציעים את האפשרות לחקור מנגנוני התחדשות רשתית.

תקציר

מחלות נוירודגנרטיביות ברשתית הן הגורמים המובילים לעיוורון. בין אסטרטגיות טיפוליות רבות הנחקרות, גירוי תיקון עצמי התגלה לאחרונה כמושך במיוחד. מקור עניין תאי לתיקון רשתית הוא תא הגליה מולר, הטומן בחובו פוטנציאל תאי גזע ויכולת התחדשות יוצאת דופן באנמניוטים. עם זאת, פוטנציאל זה מוגבל מאוד ביונקים. חקר המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התחדשות הרשתית במודלים של בעלי חיים בעלי יכולות התחדשות אמור לספק תובנות כיצד לפתוח את היכולת הסמויה של תאי מולר של יונקים לחדש את הרשתית. זהו צעד מפתח לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות ברפואה רגנרטיבית. לשם כך פיתחנו מספר פרדיגמות של פגיעה ברשתית בקסנופוס: פגיעה מכנית ברשתית, קו מהונדס המאפשר אבלציה מותנית של קולטני אור בתיווך ניטרורדוקטאז, מודל רטיניטיס פיגמנטוזה המבוסס על נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9, ומודל ציטוטוקסי המונע על ידי זריקות CoCl2 תוך עיניות. הדגשת היתרונות והחסרונות שלהם, אנו מתארים כאן סדרה זו של פרוטוקולים היוצרים מצבים ניווניים שונים ומאפשרים את המחקר של התחדשות הרשתית ב Xenopus.

מבוא

מיליוני אנשים ברחבי העולם סובלים ממחלות ניווניות שונות ברשתית המובילות לעיוורון, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה, רטינופתיה סוכרתית או ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD). נכון להיום, מצבים אלה נותרו במידה רבה בלתי ניתנים לטיפול. הגישות הטיפוליות הנוכחיות הנמצאות בהערכה כוללות ריפוי גנטי, השתלות תאים או רקמות, טיפולים נוירופרוטקטיים, אופטוגנטיקה והתקנים תותבים. אסטרטגיה מתפתחת נוספת מבוססת על התחדשות עצמית באמצעות הפעלת תאים אנדוגניים בעלי פוטנציאל תאי גזע. תאי גליה מסוג מולר, סוג תאי הגליה העיקריים ברשתית, הם בין המקורות התאיים המעניינים בהקשר זה. לאחר פציעה, הם יכולים להתמיין, להתרבות, וליצור נוירונים 1,2,3. למרות שתהליך זה יעיל מאוד בדגי זברה או בקסנופוס, הוא אינו יעיל במידה רבה ביונקים.

עם זאת, הוכח כי טיפולים מתאימים עם חלבונים מיטוגניים או ביטוי יתר של גורמים שונים יכולים לגרום לכניסה מחודשת של מחזור תאי גליה של יונקים, ובמקרים מסוימים, לעורראת מחויבותם לנוירוגנזה 1,2,3,4,5. עם זאת, זה עדיין לא מספיק במידה רבה לטיפולים. לפיכך, הרחבת הידע שלנו על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתחדשות נחוצה כדי לזהות מולקולות המסוגלות להפוך ביעילות תכונות תאים דמויי גזע של מולר לאסטרטגיות טיפוליות תאיות חדשות.

במטרה זו, פיתחנו מספר פרדיגמות פציעה ב - Xenopus המעוררות ניוון תאי רשתית. כאן, אנו מציגים (1) פגיעה רשתית מכנית שאינה ספציפית לסוג התא, (2) מודל אבלציה מותנה והפיך של תאים באמצעות מערכת NTR-MTZ המכוונת לתאי מוט, (3) נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9, מודל של רטיניטיס פיגמנטוזה המעורר ניוון מתקדם של תאי מוט, ו-(4) CoCl2-מודל ציטוטוקסי המושרה שעל פי המינון יכול להתמקד ספציפית בקונוסים או להוביל לניוון רחב יותר של תאי הרשתית. אנו מדגישים את הייחודיות, היתרונות והחסרונות של כל פרדיגמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הטיפול והניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המוסדיים, תחת רישיון מוסדי A91272108. פרוטוקולי המחקר אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים CEEA #59 וקיבלו אישור על ידי Direction Départementale de la Protection des Populations תחת מספר הסימוכין APAFIS #32589-2021072719047904 v4 ו- APAFIS #21474-2019071210549691 v2. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקולים אלה.

1. פגיעה ברשתית מכנית

הערה: פרוטוקול פרדיגמת הפציעה המתואר כאן מורכב מניקוב רשתית מכני של ראשנים משלב 45 ואילך. לכן, הוא אינו מכוון לסוג מסוים של תאי רשתית אלא פוגע בכל עובי הרשתית באתר הניקוב.

  1. הכנת חומר הרדמה לראשנים
    1. הכינו תמיסת מלאי של 10% בנזוקאין. לקבלת נפח כולל של 10 מ"ל, להוסיף 1 גרם של בנזוקאין, 2 מ"ל של dimethyl sulfoxide (DMSO), ו 8 מ"ל של פרופילן גליקול. שמור על תמיסת המלאי למשך מספר חודשים בטמפרטורה של 4°C המוגנת מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
    2. הכינו תמיסת 0.005% בנזוקאין בזמן השימוש על ידי הוספת 25 μL של 10% תמיסת מלאי בנזוקאין ל-50 מ"ל מים לגידול ראשנים (מי ברז מסוננים ונטולי כלור). מערבבים היטב.
      הערה: ריכוז הבנזוקאין נמוך במיוחד מכיוון שהראשנים רגישים מאוד להרדמה בהשוואה למבוגרים.
  2. הכנת סיכות
    1. חברו פין סטרילי בקוטר 0.2 מ"מ למחזיק סיכות מעוקר (איור 1A).
  3. הרדמת ראשנים
    1. השתמש ברשת טבילה כדי לתפוס ראשנים במיכלים שלהם. העבר אותם למיכל חדש המכיל את תמיסת הבנזוקאין 0.005%. המתינו מספר דקות עד שהראשנים יפסיקו להגיב לגירויים (הקשה על המיכל או מגע ישיר).
      הערה: ניתן להרדים מספר ראשנים בו זמנית, אך הזמן המושקע בתמיסת ההרדמה צריך להיות פחות מ -30 דקות.
  4. ניקוב רשתית
    1. השתמשו בכפית כדי לתפוס ראשן אחד והניחו אותו בזהירות על צלחת פטרי קטנה (בקוטר 55 מ"מ) המכילה רקמה רטובה. מקמו את הצד הגבי של הראשנים כלפי מעלה באמצע צלחת הפטרי.
    2. תחת סטריאומיקרוסקופ, נקבו את הרשתית על-ידי החדרה עדינה של הסיכה בצד הגבי של העין, עד שהיא תעבור דרך הרשתית (איור 1A). אם יש צורך במספר חיטוטים, חזור על הליך זה במקומות שונים. לאחר ניקוב עין ימין, סובבו את צלחת הפטרי ב-180 מעלות כדי לנקב את עין שמאל.
    3. מעבירים את הראשנים הפגועים למיכל גדול המכיל 1 ליטר מים לגידול על ידי טבילה זהירה של צלחת הפטרי. עקוב אחר הראשנים עד שהם מתעוררים לחלוטין.

2. אבלציה מותנית של תאי מוט באמצעות מערכת NTR-MTZ

הפרוטוקול נועד לגרום לאבלציה ספציפית של תאי מוט בקו6 המהונדס Xenopus Tg (rho:GFP-NTR), הזמין בשירות הזואוטכני של TEFOR Paris-Saclay, המארח את מרכז המשאבים הצרפתי Xenopus. המערכת הכימוגנטית הזו משתמשת ביכולת של אנזים ניטרורדוקטאז (NTR) כדי להמיר את התרופה מטרונידזול (MTZ) לחומר צילב-קישור ציטוטוקסי של דנ"א, כדי לעבד באופן ספציפי מוטות המבטאים NTR (איור 1B). שני פרוטוקולים מפורטים ליצירת בעלי חיים טרנסגניים Tg (rho:GFP-NTR) או Tg (rho:NTR) ולגרום לניוון פורסמו בעבר 7,8. כאן, אנו פשוט מפרטים את השראת ניוון הרשתית וכיצד לפקח על תהליך הניוון in vivo.

  1. הכנת פתרון metronidazole
    1. הכינו תמיסת MTZ של 10 mM בזמן השימוש על ידי המסת 1.67 גרם אבקת MTZ בבקבוק כהה ב-1 ליטר מים לגידול ראשנים המכילים 0.1% DMSO, באמצעות מוט ערבוב מגנטי ותסיסה מגנטית.
      הערה: MTZ רגיש לאור. פירוק מלא עשוי להימשך עד 10 דקות.
  2. יצירת ראשנים טרנסגניים על ידי הזדווגות טבעית מקו Tg (rho:GFP-NTR)
    הערה: מכיוון שזכרים טרנסגניים מייצגים מלאי יקר, אנו מעדיפים ליצור עוברים באמצעות הזדווגות טבעית כדי לא להקריב את הזכר ולהשתמש בו שוב ושוב.
    1. מתן הורמונים
      1. הזריקו 600 יב"ל של הורמון גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) עם מחטים של 25 גרם לתוך שק הלימפה הגבי של נקבות מסוג Xenopus laevis Wild. להזריק זכרים טרנסגניים עם 100-200 IU של hCG לתוך שק הלימפה הגבי. לניטור חי של ניוון מוטות (שלב 2.4), השתמש בקסנופוס לבקנים ולא בפיגמנטים, כדי לדמיין טוב יותר שינויים פלואורסצנטיים על פני העין של הראשנים הטרנסגניים שנוצרו.
        הערה: נקבות קסנופוס יכולות להיות מוקדנות עם 50 IU של hCG 1 עד 7 ימים לפני הביוץ המתוכנן, אבל זה אופציונלי.
    2. הזדווגות ואיסוף ביצים
      1. מיד לאחר הזרקת hCG, לשים במיכל אחד Tg (rho:GFP-NTR) זכר טרנסגני אחד יחד עם נקבה אחת hCG מוזרק ב 20 ° C עד למחרת. השתמשו בנפח גדול (לפחות 10 ליטר) והוסיפו חפצים קטנים כדי שהביצים יידבקו אליהם, כך שהביצים לא ייפגעו מתנועות הבוגרים. למחרת, כאשר הצפרדעים כבר לא באמפלקסוס, הוציאו את הבוגרים מהמכל ואספו עוברים.
    3. גידול עוברים וראשנים
      1. שלב עוברים וראשנים על פי הטבלה הרגילה של התפתחות קסנופוס 9.
      2. לגדל עוברים במיכל מלא במים לגידול ראשנים. משלב 45, להאכיל ראשנים עם אבקת מזון מטגנים ולחמצן את המים עם bubbler. יש להוסיף מים מדי יום במידת הצורך כדי לפצות על האידוי ולהחליף את כל מי המיכל מדי שבוע.
        הערה: לחלופין, ניתן גם להחליף 50% מהנפח פעמיים בשבוע. פרוטוקול מפורט ניתן למצואב-10.
    4. מיון עוברים טרנסגניים
      1. משלב 37/38, מיין ובחר עוברים טרנסגניים תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות הדמיה ישירה של GFP (איור 1C).
  3. טיפול MTZ ראשנים
    1. העבר ראשנים טרנסגניים Tg (rho:GFP-NTR) למיכל המכיל תמיסת MTZ של 10 mM ומאחוריהם ב 20 ° C בחושך למשך שבוע אחד. השתמשו באחים טרנסגניים שגדלו במים לגידול ראשנים המכילים 0.1% DMSO כאמצעי ביקורת.
    2. החליפו את תמיסת ה-MTZ והבקרה אחת ליומיים במהלך תקופת הטיפול. האכילו את הראשנים כרגיל במהלך טיפול MTZ.
    3. לניטור פלואורסצנטי פרטני (שלב 2.4), הניחו כל ראשנים במיכל הקטן שלו עם 30 מ"ל MTZ או פתרון בקרה משלב 2.3.1 ואילך.
      הערה: טיפול MTZ יכול להתבצע בכל עת משלב 45 ואילך.
  4. ניטור חי של ניוון מוטות
    הערה: ניתן לעקוב אחר הניוון ההדרגתי של המוטות בזמן אמת. לכן, בצע את שלבים 2.4.1. ל-2.4.4. לפני טיפול MTZ ולאחר מכן באופן קבוע לאחר הטיפול.
    1. בצע את השלבים 1.1 ו -1.3 להכנת חומר ההרדמה וההרדמה ראשנים, בהתאמה.
    2. השתמשו בכפית כדי לתפוס ראשן אחד והניחו אותו בזהירות על רקמה רטובה בצלחת פטרי קטנה (קוטר 55 מ"מ). התבונן בפלואורסצנטיות GFP תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי (אורך גל עירור = 488 ננומטר ואורך גל פליטה = 509 ננומטר) וצלם את העין. ירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות משקפת את השפלת המוטות.
      הערה: כדי לבצע השוואות כמותיות, יש לשמור על אותן הגדרות לצורך הדמיה של כל הראשנים.
    3. העבירו את הראשנים המצולמים למיכל גדול המכיל 1 ליטר של מי גידול על ידי טבילה זהירה של צלחת הפטרי. עקוב אחר הראשנים עד שהם מתעוררים לחלוטין.
    4. השווה את עוצמת הפלואורסצנטיות בין עיני ראשנים שטופלו ב- MTZ לבין עיני ראשנים בבקרה כדי לפקח ולהעריך את יעילות תהליך הניוון.

3. ניוון תאי מוט על ידי נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9

הערה: פרוטוקול זה הוקם כדי ליצור מודל של רטיניטיס פיגמנטוזה ב- Xenopus laevis על ידי גרימת ניוון ספציפי של תאי מוט באמצעות נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9. % ההחדרה-מחיקה (indels) ב- F0 מסופק ב-11 והוא ~ 75%. נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9 כזה יכול להתבצע גם בראשנים של Xenopus tropicalis 11.

  1. הכנת פתרונות וריאגנטים
    1. הזמנת crRNA ו-tracrRNA
      1. קנה את ה- CRISPR RNA הסינתטי (crRNA) המכוון לגן רודופסין (rho) ול- crRNA הטרנסאקטיבי הסטנדרטי (tracrRNA). ה-crRNA מורכב מאזור ספציפי למטרה של rho (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) ואזור נוסף (GUUUUAGAGCUAUGCU) שעובר הכלאה ל-tracrRNA.
    2. crRNA:דופלקס tracrRNA (דופלקס rho gRNA)
      1. השהה מחדש את crRNA ואת tracrRNA ב- 100 מיקרומטר במאגר הדו-צדדי נטול הנוקלאז.
      2. הכן את דופלקס gRNA על ידי ערבוב 3 μL של 100 μM rho crRNA, 3 μL של 100 μM tracrRNA, ו 94 μL של חיץ דופלקס. הריכוזים הסופיים הם 36 ng/μL rho crRNA, ו-67 ng/μL tracrRNA.
      3. אנקו את האוליגוס על ידי חימום שלהם ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ומקררים אותם לאט לטמפרטורת החדר. הפוך aliquots ולאחסן אותם ב -20 ° C.
    3. קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9 (כלומר, חלבון דופלקס gRNA/Cas9)
      1. בזמן השימוש, להכין את התערובת של דופלקס gRNA rho ואת חלבון Cas9. עבור 20 μL, הוסף 10 μL של תמיסת דופלקס rho gRNA, 2 μL של חלבון Cas9 (מלאי ב 5 מ"ג / מ"ל), 2 μL של פלואורסצאין ליזין דקסטרן (מלאי ב 10 מ"ג / מ"ל), ו 6 μL של מים ללא RNase.
      2. כדי ליצור את קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין, יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37°C ולתת לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר.
      3. לקבלת 20 μL של תמיסת הבקרה, לערבב 2 μL של חלבון Cas9, 2 μL של פלואורסצאין ליזין דקסטרן, ו 16 μL של מים ללא RNase.
    4. הכנת פתרונות MBS 10x, 1x ו- 0.1x
      1. הכינו את תמיסת מלאי המלח של Barth שונה (10x MBS) על ידי הוספת 11.92 גרם HEPES, 51.43 גרם נתרן כלורי (NaCl), 0.75 גרם אשלגן כלורי (KCl), 2.1 גרם סודיום ביקרבונט (NaHCO3), ו-2.46 גרם מגנזיום גופרתי הפטהידראט (MgSO4, 7 H2O) ב-800 מ"ל מים מסוג II. כוונן את ה- pH ל- 7.8 עם 30% נתרן הידרוקסידי (NaOH). מוסיפים מים מסוג II עד שהנפח הוא 1 L ומעקרים על ידי autoclaving. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
      2. הכינו 1 ליטר של תמיסת 1x MBS על ידי דילול 100 מ"ל של תמיסת מלח 10x MBS ו-7 מ"ל של 0.1 מ"ל סידן כלורי דיהידרט (CaCl 2, 2H2O) במים מסוג II. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
      3. הכן פתרון 0.1x MBS על ידי דילול תמיסת 1x MBS במים מסוג II. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
    5. פתרון בנזוקאין למבוגרים
      1. הכינו תמיסת 0.05% בנזוקאין על ידי הוספת 5 מ"ל של 10% תמיסת מלאי בנזוקאין (ראה שלב 1.1.1.) לליטר אחד של מים לגידול ראשנים. מערבבים היטב.
        הערה: שמור תמיסה זו למשך מספר חודשים בטמפרטורה של 4°C המוגנת מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום. הביאו את התמיסה לטמפרטורת החדר לפני השימוש על בעלי חיים.
    6. תמיסת L-ציסטאין
      1. הכן את תמיסת dejellying בזמן השימוש על ידי הוספת 2 גרם של מונוהידראט הידרוכלורי L-ציסטאין ל 100 מ"ל של תמיסת 0.1x MBS. כוונן את רמת החומציות ל-7.8 עם 30% NaOH.
    7. תמיסת פוליסוכרוז
      1. הכינו את תמיסת הרב-סוכרוז הצפופה על ידי הוספת 3 גרם רב-סוכרוז ל-100 מ"ל של תמיסת 0.1x MBS. אחסן פתרון זה למשך מספר שבועות בטמפרטורה של 4°C.
  2. הפריה חוץ גופית ו dejellying
    הערה: פרטים נוספים על הפריה חוץ גופית של Xenopus ניתן למצוא בפרוטוקול ייעודי מפורטב-12.
    1. מתן הורמונים לנקבות Xenopus laevis לגרימת ביוץ
      1. כ-15 שעות לפני קצירת הביציות, יש להזריק 600 יחב"ל של hCG לשק הלימפה הגבי של הנקבה ולשמור אותו למשך הלילה בטמפרטורה של 18°C.
    2. דיסקציה של האשכים
      1. הרדימו את זכר הקסנופוס במינון קטלני של 0.05% תמיסת בנזוקאין למשך 10-15 דקות. כשיטת המתת חסד משלימה, יש לחתוך את עמוד השדרה מיד אחורית לגולגולת בעזרת מספריים חדים וחזקים. פתחו את חלל הבטן בעזרת מספריים לדיסקציה, גזרו את האשכים החוצה וקצצו את כל השומן והנימים המחוברים. מניחים כל אשך מיד על קרח ב 1 מ"ל של 1x MBS.
    3. הכנת זרע
      1. מרסקים אשך אחד באמצעות מזיק לצינורות מיקרוצנטריפוגות ומדללים את המתלה בצינור 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של 1x MBS. הוסף 10 מיקרוגרם / מ"ל של גנטמיצין לצינור האשכים השני ושמור אותו על 4 ° C למשך כמה ימים לניסויי הפריה נוספים.
    4. הפריה חוץ גופית
      1. עסו בעדינות את גב הנקבה המוזרקת בהורמונים ואספו את הביציות בצלחת פטרי (קוטר 100 מ"מ). מורחים כמה טיפות מתמיסת הזרע על הביציות. המתן 5 דקות וכסה אותם עם 0.1x MBS. המתן 10 דקות לפני שתמשיך עם dejellying.
    5. דג'לינג ביציות מופרות
      1. החלף את תמיסת 0.1x MBS בתמיסת dejellying כדי להסיר את ציפוי הג'לי מהביצים המופרות (~ 5 דקות). שטפו היטב את העוברים 5-6 פעמים עם 0.1x MBS והעבירו אותם לצלחת פטרי חדשה בקוטר 100 מ"מ מלאה ב-0.1x MBS.
  3. הכנת מערכת המיקרו-הזרקה
    1. להשחיז נימי זכוכית עם מושך מיקרופיפטה13.
    2. מלאו נימים מושחזים ב-2-10 מיקרוליטר של קומפלקס ריבונוקלפרוטאין CRISPR-Cas9 או בתמיסת הבקרה באמצעות קצה מיקרו-מטעין והכניסו את הנימים למטפל במיקרו-מזרק.
    3. בהגדלה הגבוהה ביותר של סטריאומיקרוסקופ, נתקו את קצה הנימים בעזרת מלקחיים עדינים, וכווננו את זמן ההזרקה (~400 מילישניות) לקבלת נפח פליטה של 10 nL לכל פולס. הגדר את לחץ הפליטה לסביבות 40 PSI.
  4. מיקרו-הזרקה של עובר בשלב חד-תאי עם קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9
    1. הניחו עוברים חד-תאיים על רשת (רקמת ניילון בקוטר 1 מ"מ) מודבקים בתוך צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ מלאה בתמיסת רב-סוכרוז 3% (איור 1D).
    2. באמצעות המיקרו-מזרק ותחת סטריאומיקרוסקופ, הזריקו 10 nL של קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9 (המתאים ל-500 pg של דופלקס gRNA + 5 ng של חלבון Cas9 לעובר) או תמיסת בקרה ברמת קוטב החי, באזור קליפת המוח, ממש מתחת לקרום הציטופלזמי.
      הערה: פלואורסצאין ליזין דקסטרן הכלול בתמיסה מאפשר מיון לאחר מכן של העוברים המוזרקים.
    3. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי חדשה בקוטר 100 מ"מ המכילה תמיסת פוליסוקרוז נקייה ומניחים אותם בטמפרטורה של 21°C.
    4. ביום הראשון, מיין באופן קבוע את העוברים המפותחים היטב והחלף את תמיסת הרב-סוכרוז ב- 0.1x MBS כ- 5 שעות לאחר מיקרו-הזרקה.
    5. המתינו 24 שעות לאחר ההזרקה כדי למיין ולבחור עוברים פריכים של rho שהוזרקו היטב תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי על-ידי הדמיה של פלואורסצאין ליזין דקסטרן (איור 1E).
      הערה: ככל שהמיקרו-הזרקה לאחר ההפריה מוקדמת יותר, כך הנוקאאוט יעיל יותר.
  5. גידול עוברים וראשנים
    1. יש לגדל עוברים פריכים של רו ב-0.1x MBS בצלחות פטרי עד לשלב 37/38. הסר עוברים מתים מדי יום ושנה את תמיסת 0.1x MBS. משלב 37/38 יש לגדל עוברים במיכל מלא במים לגידול ראשנים, ומשלב 45 להמשיך כמו בשלב 2.2.3.

4. ניוון תאי רשתית על ידי זריקות CoCl 2 תוך עיניות ציטוטוקסיות

הערה: פרוטוקול זה נקבע כדי לגרום לניוון תאי רשתית על ידי הזרקות תוך עיניות של קובלט כלוריד (CoCl2) בראשנים של Xenopus laevis . על פי המינון, זה יכול לעורר ניוון ספציפי חרוט או ניוון רחב יותר14. אנו משתמשים בפרוטוקול זה בראשנים מסוג Xenopus laevis מגיל 48 ואילך. ניתן להשתמש בו גם בראשנים מסוג Xenopus tropicalis .

  1. הכנת חיץ וריאגנטים
    1. הכינו תמיסת בנזוקאין 0.005% בזמן השימוש כמו בשלב 1.1.
    2. הכן תמיסת מלאי CoCl2 של 100 מ"מ על ידי הוספת 118.5 מ"ג עד 5 מ"ל של 0.1x MBS (ראה שלב 3.1.4 להכנת 0.1x MBS). שמור על תמיסת מלאי זו למשך מספר חודשים ב- 4 ° C, מוגן מפני אור עם רדיד אלומיניום.
      אזהרה: CoCl2 מסווג כתרכובת רעילה לחיי אדם ובעלי חיים. בצע בקפידה את ההוראות לטיפול, אחסון וסילוק פסולת בגיליון נתוני הבטיחות.
    3. עבור ניוון ספציפי לחרוט, הכן פתרון CoCl2 של 10 mM בזמן השימוש מתמיסת מלאי של 100 mM המדוללת ב- 0.1x MBS. לניוון רחב יותר של תאי הרשתית, הכינו תמיסת CoCl2 של 25 mM.
  2. הכנת מערכת ההזרקה
    1. להשחיז נימי זכוכית עם מושך מיקרופיפטה 13.
    2. מלא נימים מושחזים עם 2-10 μL של 10 או 25 mM תמיסת CoCl2 או פתרון הבקרה (0.1x MBS) באמצעות קצה microloader והנח את הנימים לתוך המטפל microinjector.
    3. בהגדלה הגבוהה ביותר של סטריאומיקרוסקופ, נתקו את קצה הנימים בעזרת מלקחיים עדינים, וכווננו את זמן ההזרקה (כ-100 מילישניות) לקבלת נפח פליטה של 15-40 nL לכל פולס. הגדר את לחץ הפליטה ל~40 PSI.
      הערה: יש להתאים את גודל הטיפה לשלב הראשנים ולגודל העין שלהם. לדוגמה, בשלבים 48-49, גודל הטיפה הוא ~ 15-20 nL, בעוד שהוא 30-40 nL בשלבים 52-56. מבחינה ויזואלית, גודל הטיפה מעט גדול יותר מגודל העדשה.
  3. CoCl2 הזרקות תוך עיניות
    1. השתמש ברשת טבילה כדי לתפוס ראשנים במיכלים שלהם. העבר אותם ל 50 מ"ל של תמיסת בנזוקאין 0.005%. המתינו מספר דקות עד שהראשנים יפסיקו להגיב לגירויים.
      הערה: ניתן להרדים מספר ראשנים בו זמנית, אך זמן ההרדמה צריך להיות פחות מ-30 דקות.
    2. השתמשו בכפית כדי לתפוס ראשן אחד והניחו אותו בזהירות בכלי פטרי קטן (קוטר 55 מ"מ) המכיל רקמה רטובה. מקמו את הצד הגבי של הראשנים כלפי מעלה במרכז צלחת הפטרי (איור 1F,G).
    3. השתמש במיקרו-מזרק תחת סטריאומיקרוסקופ כדי להזריק תוך עינית את תמיסת CoCl2 . הכנס בעדינות את הנימים לעין מעל העדשה. כאשר קצה הנימים נמצא בתוך העין, יש להוציא שתי טיפות לכל עין. לאחר הזרקת עין ימין, סובבו את צלחת הפטרי ידנית ב-180 מעלות כדי להזריק לעין שמאל.
      הערה: יש לוודא כי ההזרקה נעשית בתוך העין, כך שיש לראות נפיחות קלה של העין לאחר כל פליטה של התמיסה. הראשנים צריכים להישאר מחוץ למים כמה שפחות. ההזרקה של שתי העיניים צריכה לקחת פחות מ 1 דקה.
    4. העבירו את הראשנים המוזרקים למכל גדול שמכיל 1 ליטר של מים לגידול על-ידי טבילתם בזהירות בצלחת הפטרי (איור 1H). עקוב אחר הראשנים עד שהם מתעוררים לחלוטין.

5. צביעה להערכת נזק ברשתית או ניוון רשתית

  1. קיבוע ראשנים והתייבשות
    1. הכן תמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) על ידי דילול 100 מ"ל של תמיסת PFA 32% ל-700 מ"ל של PBS אחד. כוונן את ה- pH ל- 7.4 עם NaOH. Aliquot פתרון מלאי זה ולשמר אותו במשך מספר חודשים ב -20 ° C.
    2. הרדימו את הראשנים ב-0.01% בנזוקאין והעבירו אותם לבקבוקון המכיל 4% PFA למשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם תסיסה או לילה ב-4°C. יש לשטוף 3 x 5 דקות ב-PBS אחד.
    3. מייבשים בהדרגה ראשנים על ידי דגירות רצופות של 30 דקות באתנול 70% ו-95% אתנול (מדולל במים מסוג II), ולאחר מכן שלוש דגירות נוספות של שעה אחת באתנול 100%. אחסנו את ראשי הראשנים בשלב זה בטמפרטורה של -20°C או העבירו אותם ישירות ל-100% בוטנול למשך הלילה לצעדים נוספים.
  2. חתך פרפין
    1. החליפו 100% בוטנול בפרפין מומס למשך שעתיים ב-62°C. החלף את הפרפין במשך 2 x 2 שעות של דגירות נוספות ב 62 ° C.
    2. מעבירים את ראשי הראשנים בתבניות הטבעה חד פעמיות של פרפין ומכוונים אותם כך שעיניהם מיושרות היטב, ואז מאפשרים לפרפין להתקשות. אחסנו את הבלוקים בטמפרטורת החדר.
    3. חתכו את עודפי הפרפין והרכיבו את הבלוק עם הראשנים המוטבעים על תמיכת המיקרוטום.
    4. חותכים את הבלוק עם מיקרוטום בעובי המתאים (10-12 מיקרומטר). העבירו את הסרטים עם מקטעים בשקופית שכוסה בעבר באלבומין גליצרין 3% (מדולל במים).
    5. הניחו את המגלשה על מגלשה חמה יותר בטמפרטורה של 42°C למשך מספר דקות ולאחר מכן הסירו את עודפי אלבומין הגליצרין. תנו למגלשות להתייבש לילה בתנור ב-37°C.
    6. ניתן לטבול את המגלשות במשך 2X15 דקות בצנצנת קופלין מלאה ב-100% קסילן. התייבשו מחדש את החלקים עם סדרת אתנול מדורגת: 100% פעמיים, 70%, 50% (מדולל במים מסוג II), ~ 5 דקות כל אחד, ואחריו 2 x 5 דקות במים.
  3. תיוג Immunofluorescence
    1. הכן תמיסת מלאי נתרן ציטראט (CiNa) של 100 מ"מ על ידי הוספת 29.4 גרם של נתרן ציטראט מלח טריסודיום דיהידרט (C6H5Na3O7, 2H2O) ל 1 ליטר של מים מסוג II; כוונן את ה- pH ל- 6 עם חומצה הידרוכלורית (HCl). יש לעקר על ידי אוטוקלאבינג ולאחסן בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים. הכן את פתרון הסרת המסיכה בזמן השימוש על ידי הוספת 25 מ"ל של 100 מ"ל תמיסת מלאי CiNa ל 225 מ"ל של מים מסוג II. מוסיפים 125 μL של Tween-20 ומערבבים היטב (הריכוז הסופי הוא 10 mM CiNa, 0.05% Tween-20).
    2. הכן תמיסת מלאי Hoechst ב 10 מ"ג / מ"ל על ידי הוספת 100 מ"ג של bisBenzimide H 33258 ל 10 מ"ל של מים מסוג I. שמור על תמיסת מלאי זו למשך מספר חודשים ב- 4 ° C, מוגן מפני אור עם רדיד אלומיניום. הכן את תמיסת Hoechst ב-7.5 מיקרוגרם/מ"ל על ידי הוספת 300 מיקרוליטר של תמיסת מלאי Hoechst ל-400 מ"ל של 1x PBS.
      הערה: ניתן להשתמש בתמיסה זו עד 10 פעמים ולשמר אותה למשך כ-6 חודשים בטמפרטורה של 4°C, כשהיא מוגנת מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
    3. לאחר הסרת החלקים יש לבצע שליפת אנטיגן על ידי הרתחת החלקים בתמיסת הסרת המסכה למשך 9 דקות. תנו לתמיסה להתקרר במשך 20 דקות.
    4. יש לשטוף פעם אחת במים מסוג II ופעם אחת ב-1x PBS. הניחו את המגלשות שטוחות בתא לח והוסיפו 400-600 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לכל שקופית (דילול נוגדנים + 0.2% טריטון X100) למשך 30 דקות.
    5. החלף את פתרון החסימה ב- 200 μL לכל שקופית של הנוגדן העיקרי המדולל בתמיסת החסימה. השתמש ב- coverslip כדי לפזר את התמיסה על פני המקטעים, הימנעות היווצרות בועות. יש לדגור למשך הלילה ב-4 °C (75 °F) בתא לח.
    6. מעבירים את המגלשות לצנצנת Coplin ושוטפים במשך 3 x 10 דקות ב-1x PBS בתוספת 0.1% Triton X100. הניחו את המגלשות שטוחות, הוסיפו 400 מיקרוליטר לכל שקופית של הנוגדן המשני המדולל בתמיסת חסימה, והשאירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בתא לח.
    7. העבירו את המגלשות לצנצנת Coplin ושטפו במשך 3 x 5 דקות עם PBS אחד בתוספת 0.1% Triton X100.
    8. גרעיני תאים נגד כתמים עם תמיסת Hoechst למשך 10 דקות ושטפו 3 x 5 דקות עם 1x PBS.
    9. הניחו את הכיסויים מעל מגלשות באמצעי הרכבה מימי שתוכנן במיוחד לשימור פלואורסצנטיות. הניחו למגלשות להתייבש במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4°C.
    10. דמיינו את השקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  4. צביעת Hematoxylin ו-eosin (H&E) להערכת נזק לרשתית
    הערה: במקום לתייג סוג תא מסוים על ידי immunostaining, היסטולוגיה רשתית כללית ניתן להעריך עם צבע H&E.
    1. לאחר הסרת השעווה, יש לבצע תיוג חומצות גרעין על ידי טבילת שקופיות בתמיסת המטוקסילין למשך 2 דקות. יש לשטוף היטב במי ברז.
    2. בצע תיוג ציטופלסמה על ידי טבילת שקופיות בתמיסת eosin 1% למשך דקה אחת. יש לשטוף במהירות במים.
      הערה: אאוסין מסיס מאוד; אם המגלשות נשארות זמן רב מדי במים, כל הצבע נעלם.
    3. יש לשטוף 2 x 5 דקות באתנול 100% ו-2 x 5 דקות בקסילן.
    4. מתחת למכסה המנוע, הניחו את הכיסויים מעל המגלשות ב-4-5 טיפות של מדיום הרכבה. תנו לשקופיות להתייבש מתחת למכסה המנוע ודמיינו למחרת עם מיקרוסקופ.
  5. איתור תאים אפופטוטיים
    1. לאחר הסרת שעווה (ראה סעיף 5.2.6), פעל לפי פרוטוקול יצרן הערכה כדי לזהות פיצול DNA אפופטוטי.
    2. בצע צביעת גרעינים על ידי טבילת שקופיות בתמיסת Hoechst (ראה סעיף 5.3.8) והרכבה עם אמצעי הרכבה מימי שתוכנן במיוחד לשימור פלואורסצנטיות. הניחו למגלשות להתייבש במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4°C.
    3. דמיינו את השקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פגיעה מכנית ברשתית
קטעי רשתית של ראשנים הנתונים לפגיעה המכנית המתוארת בפרוטוקול סעיף 1 מראים שהנגע ברשתית מקיף את כל שכבות הרקמה תוך שהוא נשאר מוגבל לאתר הניקוב (איור 2A,B).

אבלציה מותנית של תאי מוט באמצעות מערכת NTR-MTZ
העיניים של ראשנים טרנסגניים מורדמים Tg (rho:GFP-NTR) שטופלו בטיפול MTZ, כמתואר בסעיף 2 של פרוטוקול, נותחו תחת הסטריאומיקרוסקופ (איור 3A,B

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יתרונות וחסרונות של פרדיגמות שונות של פגיעה ברשתית בראשנים של קסנופוס

פגיעה מכנית ברשתית
פציעות כירורגיות שונות של הרשתית העצבית פותחו בראשנים של קסנופוס. הרשתית העצבית יכולה להיות מוסרת לחלוטין15,16 או נכרתה רק חלקית 16,17. הפגיעה המכנית המוצגת כאן אינה כרוכה בכריתת רשתית אלא ניקוב עין פשוט שפיתחנו בעבר בראשנים מסוג Xe...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מענקים ל- M.P. מהאגודה Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) ו- UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) בשיתוף עם ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,2-פרופנדיול (פרופיל ואגרייב; ne glycol)Sigma-Aldrich398039
אתנול מוחלט ו-GE; 99.8%כימיקלים VWR20821-365
נוגדן נגד קספאז 3 שסוע (ארנב)איתות תאים9661Sדילול 1/300
נוגדן נגד GFP (עוף)AveslabsGFP-1020דילול 1/500
נוגדן נגד M-Opsin (ארנב)Sigma-AldrichAB5405דילול 1/500
נוגדן משני נגד עכבר, Alexa Fluor 594 (עז)Invitrogen Thermo ScientificA11005דילול 1/1,000
נוגדן Anti-Otx2 (ארנב)AbcamAb183951דילול 1/100
נוגדן משני נגד ארנב, Alexa Fluor 488 (עז)Invitrogen Thermo ScientificA11008דילול 1/1,000
נוגדן משני נגד ארנב, Alexa Fluor 594 (עז)Invitrogen Thermo ScientificA11012דילול 1/1,000
נוגדן נגד התאוששות (ארנב)סיגמא-אולדריץ'AB5585דילול 1/500
נוגדן נגד רודופסין (עכבר)סיגמא-אולדריץ'MABN15דילול 1/1,000
נוגדן נגד S-Opsin (ארנב)סיגמא-אולדריץ'AB5407דילול 1/500
ערכת זיהוי אפופטוטיס (מערכת TUNEL פלואורמטרית ללא מוצא)PromegaG3250
בנזוקאין Sigma-AldrichE1501פתרון מלאי 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)Sigma-AldrichB2883תמיסת מלאי 10 מ"ג/מ"ל
בוטאנול-1 ≥ 99.5%כימיקלים VWR20810.298
סידן כלוריד דיהידראט (CaCl2, 2H2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.02382שימוש ב-0.1 מ'
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)New England BiolabsM0646T
קלארק זכוכית נימית דגם GC100TF-10Warner Instruments (Harvard Device)30-0038
קובלט (II) כלוריד הקסהידראט (CoCl2, 6H2O)Sigma-AldrichC8661תמיסת מלאי 100 מ"מ
Coverslip 24 x 60 מ"מVWR631-1575
Dako REAL ab מדלל AgilentS202230-2
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma-AldrichD8418
מיקרוטום סיבובי אלקטרוניThermo ScientificMicrom HM 340E 
אאוזין 1% אבחוןRAL312740
פלואורסצאין ליזין דקסטרן   Invitrogen Thermo ScientificD1822
סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטיOlympusSZX 200
GentamycinEuromedexEU0410-B
גליצרין אלבומין acc. MalloryDiapathE0012שימוש ב-3% במים
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)RAL Diagnostics320550
HEPES מלחאשלגןSigma-AldrichH0527
הורמון גונדוטרופין כוריוני אנושיMSD בריאות בעלי חייםChorulon 1500
אידוי חומצה הידרוכלורית, 37% (HCl)סיגמא-אולדריץ' (SAFC)1.00314
L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראטסיגמא-אולדריץ'C7880שימוש ב-2% ב-0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
מגנזיום סולפט הפטהידראט (MgSO4, 7H< תת>2O)סיגמא-אולדריץ' (סופלקו)1.05886
מטרונידזול סיגמא-אולדריץ' (Supelco)M3761השתמש בקצות מיקרו-מטען של 10 מ"מ
חולץ מיקרופיפטה5242956003
(P-97 Flaming/Brown)Sutter Instrument Co.דגם P-97תוכנית: חום 700 / משיכה 100 / וול 75 / זמן 90 / לא נעול p = 500
מדיום הרכבה לשימור פלואורסצנטיות, מגיב FluorSaveMillipore345789
מדיום הרכבה, EukittChem-LabCL04.0503.0500
MX35 להב Ultra MicrotomeEpredia3053835
מחט Agani 25 G x 5/8''TerumoAN*2516R1
מחזיק סיכה מצופה ניקלכלי מדע עדינים26016-12
רקמת סינון ניילון (בד ניפוי) NITEX, פתח רשת 1,000 ומיקרו; mSefar06-1000/44
שעוות היסטו-פרפין ללא DMSOHistolab00403
תמיסת פרפורמלדהיד (32%)מדעי מיקרוסקופ אלקטרוניםEM-15714-Sשימוש ב-4% ב-1x PBS pH 7.4
תבניות הטבעה חד פעמיות מתקלפות בכיווןEpredia2219
PestleVWR431-0094
צלחת פטרי 100 מ"מקורנינג גוסליןSB93-101
צלחת פטרי 55 מ"מקורנינג גוסליןBP53-06
תמיסת מלח מאגר פוספט (PBS) 10xEuromedexET330-A
מערכת מיקרו-הזרקה פיקו-שפריצרמוצרי מכשור פארקרפיקו שפריצר III
פינים Fine Science Tools26002-20
פוליסוכרוז (Ficoll PM 400)Sigma-AldrichF4375שימוש ב-3% ב-0.1x MBS
אשלגן כלורי (KCl)Sigma-AldrichP3911
אבקת מזון מטוגן: sera Micron Naturesera45475 (00720)
דיסקציה מספרייםFine Science Tools14090-09
Slide Superfrost   קניטל זכוכיתVS11171076FKA 
מכשירי קונץמחממי שקופיותHP-3
נתרן כלורי (NaCl)Sigma-AldrichS7653
נתרן ציטראט מלח טריסודיום דיהידראט (C6H5Na3O7, 2H2O)VWR כימיקלים27833.294
נתרן מימן פחמתי (NaHCO3)סיגמא-אולדריץ' (Supelco)1.06329
נתרן הידרוקסיד 30% תמיסה מימית (NaOH)כימיקלים VWR28217-292
סטריאומיקרוסקופZeissStemi 2000
מזרקים Omnifix-F מזרקים חד פעמיים סולו 1 מ"לB-BRAUN9161406V
crRNA טרנס-אקטיבי (tracrRNA)טכנולוגיות DNA משולבות
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
Tween-20Sigma-AldrichP9416
X-Cite 200DC Fluorescence IlluminatorX-Cite 200DC
קסילן ≥ 98.5% כימיקלים VWR28975-325
מימי אפנדורף1072533

מקורות

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
  3. García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
  4. Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).
  5. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
  6. Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
  7. Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
  8. Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
  9. Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
  10. McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
  11. Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807(2022).
  12. Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
  13. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
  14. Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
  15. Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
  16. Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
  17. Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
  18. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CRISPR
יצירת מודלים של פגיעות רשתית בראשנים של קסנופוס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.