מאמר שיטה

מידול טרשת נפוצה בשני המינים: MOG35-induced ניסיוני אוטואימוני אנצפלומיאליטיס

2.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65778

⸱

13 באוקטובר 2023

 ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית היא אחד המודלים הנפוצים ביותר של טרשת נפוצה. בפרוטוקול הנוכחי, עכברי C57BL/6J משני המינים מחוסנים בפפטיד גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין, וכתוצאה מכך בעיקר פרזיס עולה של הזנב והגפיים. כאן אנו דנים בפרוטוקול של אינדוקציה והערכה של EAE.

תקציר

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה דלקתית אוטואימונית כרונית המשפיעה על מערכת העצבים המרכזית (CNS). היא מאופיינת בשכיחות שונה בין המינים, המשפיעה על יותר נשים מגברים, ותוצאות שונות, המראות צורות אגרסיביות יותר אצל גברים מאשר אצל נשים. יתר על כן, טרשת נפוצה היא הטרוגנית מאוד במונחים של היבטים קליניים, רדיולוגיים ופתולוגיים. לכן, יש צורך לנצל מודלים בעלי חיים ניסיוניים המאפשרים חקירה של היבטים רבים ככל האפשר של הפתולוגיה. אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) מייצגת את אחד המודלים הנפוצים ביותר של טרשת נפוצה בעכברים, המדמה תכונות מחלה שונות, החל מהפעלת מערכת החיסון ועד נזק למערכת העצבים המרכזית. כאן אנו מתארים פרוטוקול להשראת EAE בעכברי C57BL/6J זכריים ונקביים כאחד באמצעות חיסון מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין פפטיד 35-55 (MOG35-55), מה שמוביל להתפתחות צורה כרונית של המחלה. אנו גם מדווחים על הערכת התוצאה הקלינית היומית והביצועים המוטוריים של עכברים אלה במשך 28 ימים לאחר החיסון (28 dpi). לבסוף, אנו מדגימים כמה ניתוחים היסטולוגיים בסיסיים ברמת מערכת העצבים המרכזית, תוך התמקדות בחוט השדרה כאתר העיקרי של נזק הנגרם על ידי מחלה.

מבוא

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה דלקתית אוטואימונית כרונית המשפיעה על מערכת העצבים המרכזית (CNS). זה מראה את נוכחותם של חדירה perivascular של תאים דלקתיים, demyelination, אובדן אקסונלי, gliosis1. האטיולוגיה שלה נותרה לא ידועה, וההיבטים הקליניים שלה, המאפיינים הרדיוגרפיים והפתולוגיים מצביעים על הטרוגניות יוצאת דופן במחלה2.

בשל האטיולוגיה והמורכבות הלא ידועות שלה, נכון לעכשיו, אף מודל של בעלי חיים אינו משחזר את כל התכונות הקליניות והרדיולוגיות המוצגות בטרשת נפוצה 3,4 אנושית. עם זאת, מודלים שונים של בעלי חיים משמשים לחקר היבטים שונים של טרשת נפוצה 3,4. במודלים אלה, התחלת המחלה היא בדרך כלל מלאכותית ביותר, ומסגרת הזמן של הופעת סימנים קליניים שונה בין בני אדם לעכברים. לדוגמה, בבני אדם, התהליכים הפתופיזיולוגיים העומדים בבסיס המחלה אינם מזוהים במשך שנים לפני הופעת הביטויים הקליניים. לעומת זאת, הנסיינים יכולים לזהות תסמינים במודלים של בעלי חיים בתוך שבועות או אפילו ימים לאחר השראת טרשת נפוצה4.

שלושה מודלים בסיסיים של בעלי חיים מייצרים את התכונות של דה-מיאלינציה האופייניות לטרשת נפוצה: אלה המושרות על ידי וירוסים (למשל, וירוס האנצפלומיאליטיס מורין של טיילר), אלה המושרים על ידי חומרים רעילים (למשל, cuprizone, lysolecithin), והגרסאות השונות של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE)5. כל מודל מסייע לחקור היבטים ספציפיים של המחלה, אך אף אחד מהם אינו משכפל את כל התכונות של MS6. לכן, קריטי לבחור את המודל הנכון בהתחשב בצרכים הניסיוניים הספציפיים ובשאלות המדעיות שיש להתייחס אליהן.

הודות להליכי חיסון נגד אנטיגנים שמקורם במיאלין, EAE נגרם על ידי הפעלת תגובה אוטואימונית לרכיבי CNS בעכברים רגישים. יחסי הגומלין בין מגוון רחב של מנגנונים אימונופתולוגיים ונוירופתולוגיים גורמים להתפתחות תכונות פתולוגיות עיקריות של טרשת נפוצה (כלומר, דלקת, דמיאלינציה, אובדן אקסונלי וגליוזיס) בעכברים המחוסנים 7,8. עכברים מתחילים להראות תסמינים קליניים סביב השבוע השני לאחר החיסון ובדרך כלל מראים שיתוק עולה מהזנב לגפה ולגפה הקדמית. הציון הקליני (כלומר, כימות הצטברות של ליקויים הקשורים למחלה) מוערך בדרך כלל באמצעות סולם7 בן 5 נקודות.

חיסון פעיל עם חלבון או פפטיד או העברה פסיבית של תאי T אנצפליטוגניים יכול לשמש כדי לגרום EAE בעכברים עם רקע גנטי שונה (למשל, SJL/J, C57BL/6, ועכברים שאינם שמנים סוכרתיים (NOD). חלבון פרוטאוליפיד מיאלין (PLP), חלבון בסיסי מיאלין (MBP) וגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG) הם דוגמאות לחלבונים במערכת העצבים המרכזית העצמית שמהם מיוצרים בדרך כלל אימונוגנים. בפרט, עכברי SJL/J שחוסנו באפיטופ החיסוני הדומיננטי של PLP (PLP139-151) מפתחים מהלך מחלה התקפי-הפוגתי (RR), בעוד שעכברי C57BL/6J שחוסנו בפפטיד MOG35-55 החיסוני הדומיננטי מראים EAE בעל אופי כרוני1. למרות מגבלות מסוימות, כגון מתן מידע מועט מאוד על התקדמות טרשת נפוצה, תפקידם של תאי B במחלה, מנגנוני האינסייד אאוט, או קשיים בחקר רמיאלינציה, המודלים של EAE תרמו רבות להבנת תהליכים אוטואימוניים ונוירו-דלקתיים, הגדילו את הידע בתחום הטרשת הנפוצה ובכך אפשרו פיתוח גישות טיפוליות חדשניות למחלה זו4, 6.

בעבודה הנוכחית התמקדנו בצורה מסוימת של EAE פעיל, פפטיד הגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין 35-55 (MOG35-55) המושרה בצורה 9,10,11,12. מודל EAE המושרה על ידי MOG35-55 הוא צורה כרונית של טרשת נפוצה. לאחר החיסון, העכברים עוברים שלב א-סימפטומטי בשבוע הראשון לאחר החיסון, לאחר מכן המחלה מופיעה בדרך כלל בשבוע השני לאחר החיסון, ואילו בין השבוע השלישי לרביעי לאחר החיסון, המחלה הופכת כרונית, ללא אפשרות להחלמה מלאה מהגירעונות המצטברים 7,8,13. באופן מעניין, ברוב המחקרים הקיימים בספרות14 לא נצפים הבדלים בין זכרים לנקבות בשכיחות, בהתפרצות המחלה, במהלכם או בהתקדמותה, גם אם פחות מחקרים משווים את המחלה בזכרים ובנקבות.

לעומת זאת, אצל בני אדם, פרמטרים אלה ידועים כדימורפיים מאוד מבחינה מינית2. טרשת נפוצה משפיעה על יותר נשים מאשר גברים; עם זאת, גברים בדרך כלל לפתח צורה אגרסיבית יותר של המחלה2. ראיות אלה הצביעו על תפקיד חיוני, כמו גם מורכב, של הורמוני הגונדל15; עם זאת, תפקידם ומנגנון הפעולה של הורמוני המין בפאתולוגיה נותרו לא ברורים. יתר על כן, נתונים ממודלים של בעלי חיים תומכים ברעיון שגם אסטרוגנים וגם אנדרוגנים מפעילים השפעות חיוביות על חלקים שונים של הפתולוגיה באופן ספציפי למין16,17.

מחקרים מסוימים מציעים גם השפעות נוירופרוטקטיביות, פרומיאלינטיות ואנטי דלקתיות של פרוגסטרון18 , ואף על פי שהראיות בחולי טרשת נפוצה הן נדירות18, סטרואידים נוירואקטיביים (כלומר, סטרואידים מסונתזים דה נובו על ידי מערכת העצבים, כגון פרגננולון, טטרהידרופרוגסטרון ודיהידרופרוגסטרון) עשויים להשפיע גם על הקורס הפתולוגי19. באופן קולקטיבי, נתונים אלה תומכים ברעיון כי הורמוני מין המיוצרים הן באופן היקפי והן בתוך מערכת העצבים המרכזית יש תפקיד חשוב וספציפי למין בהתפרצות המחלה והתקדמותה. לכן, בעבודה הנוכחית, אנו קוראים לאיסוף נתונים נפרדים הן מבעלי חיים זכריים והן מנקבות.

מנקודת מבט היסטופתולוגית, החומר הלבן של חוט השדרה משמש כאתר העיקרי של פגיעה במערכת העצבים המרכזית במודל זה, המאופיין באזורים רב-מוקדיים, מתמזגים של חדירה דלקתית חד-גרעינית ודמיאלינציה8. לכן, בתיאור פרוטוקול זה להשראת EAE המושרה על ידי MOG35-55-induced EAE בעכברי C57BL/6J, ניקח בחשבון את תוצאות המחלה בשני המינים ונספק כמה תובנות היסטופתולוגיות לגבי חוט השדרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הטיפול והטיפול בבעלי חיים בעבודה הנוכחית בוצעו בהתאם לדירקטיבת מועצת האיחוד האירופי מיום 22בספטמבר 2010 (2010/63/UE); כל ההליכים שדווחו במחקר הנוכחי אושרו על ידי משרד הבריאות האיטלקי (407/2018-PR) ועל ידי הוועדה האתית של אוניברסיטת טורינו (פרויקט מס' 360384). אנו מציעים להתאים את התכנון הניסויי להנחיות ARRIVE שפורסמו במקור על ידי Kilkenny et al. בשנת 201020. לפני שתתחיל, ודא שהחומרים הדרושים זמינים (ראה טבלת חומרים). לעקר את כל כלי הזכוכית והכלים המשמשים להכנת תחליב MOG35-55 באוטוקלאב. סיכום של הליכי הניסוי מיוצג באיור 1.

1. הכנת תחליב MOG35-55

הערה: כדי להכין את התחליב נדרשים MOG35-55, אדג'ובנט פרויד לא שלם (IFA), זן שחפת Mycobacterium H37Ra (MT) ופתרון פיזיולוגי (ראה טבלת חומרים).

אזהרה: MT שנהרג בחום עלול לעורר את התגובה החיסונית המולדת. יש להימנע משאיפה, בליעה ומגע עם העור והעיניים באמצעות ציוד מגן אישי מתאים ושקילת MT באיזון מדויק מכוסה מתחת למכסה המנוע.

תמיסההרכבהערות
2 מ"ג/מ"ל MOG35-55 תמיסת פפטידפפטיד MOG35-55 מדולל בתמיסה פיזיולוגית בריכוז של 2 מ"ג/מ"לשמור על הפתרון כבר מדולל ב -80 ° C.
תמיסת PT של 5 מיקרוגרם/מ"לPT מדולל בתמיסה פיזיולוגית בריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל.שמור על הפתרון כבר מדולל ב -80 ° C.
אמולסיההנפח הכולל של תחליב הדרוש לכל עכבר כדי להיות מחוסן הוא 300 μL מחולק כדלקמן:כדי למנוע שינויים או זיהום, להכין את תחליב ביום החיסון.
200 מיקרוגרם / עכבר של MOG35-55 , כלומר, 100 מיקרוליטר של MOG35-55 2 מ"ג / מ"ל תמיסה.
50 μL של פתרון פיזיולוגי
150 μL של IFA
4 מ"ג/מ"ל MT, כלומר, 1.2 מ"ג/עכבר
פתרון פיזיולוגינתרן כלורי 0.9% מדולל במים מזוקקים.

טבלה 1: הרכב הפתרונות המשמשים להליך החיסון.

  1. הכינו את התמיסה בכד זכוכית, הוסיפו תחילה את הרכיב הנוזלי ולבסוף את MT.
    הערה: הנפח הכולל של תחליב הדרוש לכל עכבר כדי להיות מחוסן הוא 300 μL, מחולק כפי שמצוין בטבלה 1. התחליב צמיג ועבה מאוד, כך שבמהלך הליך ההכנה וההזרקה, עלול להיות אובדן מסוים, במיוחד בעת הכנת התמיסה למספר עכברים. אנו מציעים לחשב את נפח התחליב הסופי הדרוש על ידי הערכת יתר של מספר העכברים שיש לחסן לפחות פי 1.5-2.
  2. מניחים את הכד בקרח ומשתמשים במזרק הזכוכית עם מחט 18 גרם כדי להתחיל להתחלב את התמיסה.
    הערה: ניתן להכין את האמולסיה גם באמצעות אסטרטגיות אחרות, לדוגמה, על ידי חיבור שני מזרקי זכוכית ללא אוויר עם סטופקוק תלת-כיווני וערבוב התמיסה על ידי דחיפת הבוכנות קדימה ואחורה21,22.
  3. תחליב את הפתרון במשך 15 דקות לפחות; באופן כללי, 30 דקות של תחליב מספיק. כדי לבדוק את איכות התחליב מוסיפים טיפת תחליב במיכל שקוף מלא מים: אם הטיפה שומרת על המבנה שלה ונשארת שלמה, התחליב מוכן.
  4. הניחו את התחליב ישירות בתוך מזרקי 1 מ"ל שישמשו לחיסון ואחסנו אותם ב +4 מעלות צלזיוס עד לשימוש כדי לשמור על עובי התחליב ולמנוע שינויים או זיהום.

2. בחירת בעלי חיים וחיסון

  1. ברירה של בעלי חיים
    1. בחר עכברי C57BL/6J בוגרים משני המינים בגיל 8-10 שבועות עם משקל גוף אופטימלי של ~20 גרם. הקפידו לבחור עכברים תואמי גיל ומין לקבוצות ניסוי שונות מכיוון שהרגישות למחלות יכולה להשתנות עם הגיל והמין.
      הערה: עכברים צריכים להיות בעלי משקל גוף דומה ביום החיסון מכיוון שההליך הנוכחי מותאם לטווח משקל גוף מסוים (17-25 גרם).
    2. שכן בעלי חיים חד מיניים בקבוצות (n = 4-5 / כלוב) כדי למנוע בידוד חברתי בתנאים סטנדרטיים בכלובי עכבר פוליפרופילן בגודל 45 ס"מ x 25 ס"מ x 15 ס"מ ב 22 ± 2 ° C, תחת מחזור אור / חושך 12: 12 (אורות דולקים בשעה 08:00 בבוקר). לספק מזון ומים עד ליביטום.
      הערה: בסופו של דבר, כדי להגביל עוד יותר את השונות הפוטנציאלית של מהלך המחלה בבעלי החיים המחוסנים, אנו מציעים גם ליצור קבוצות ניסוי רבות מספיק. ישנם גם מחקרים 8,23 המתארים את עיתוי החיסון כמצב הקובע שונות בתוצאות EAE. לכן, אנו מציעים לבצע את החיסון בערך באותה שעה בכל בעלי החיים, רצוי בשעות האור של מחזור האור / חושך היומי23. כדי להגביל את הלחץ, עדיף לתפעל את בעלי החיים לפני יום החיסון ולסמן אותם כדי לזהות אותם בקלות להערכה יומית, למשל, גזיזת אוזניים או תג.
  2. הליך החיסון
    הערה: ודא כי ההליך מבוצע על ידי חוקר מנוסה כדי למזער את הלחץ עבור בעלי חיים ולייעל את החיסון. לפני תחילת החיסון, יש לבחור את שיטת ההרדמה בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולאתיות. המעבדה שלנו משתמשת בהרדמה קצרה עם איזופלורן.
    1. הרדמת העכבר: 4% איזופלורן להשראת הרדמה ו-1.5-2% איזופלורן לתחזוקת הרדמה. המתן עד שההרדמה תהיה יעילה והשתמש בצביטה בבוהן כף הרגל האחורית והקדמית כדי להעריך את רמת ההרדמה. כדי למנוע יובש בעיניים בזמן שהעכבר נמצא תחת הרדמה, יש להשתמש במשחת עיניים מאושרת על ידי וטרינר.
    2. הזרקת PT תוך ורידי בווריד הקאודלי לרוחב: חבר את זנב העכבר בעדינות עם תמיסת אתנול, הפועלת כמרחיב כלי דם, כדי להציג את הוורידים. התמקדו באחד משני הוורידים הצדיים של הזנב, ובעזרת מזרק 0.5 מ"ל המצויד במחט 30 גרם, הזריקו 500 ננוגרם של PT (כלומר, 100 מיקרוליטר של PT מדולל בתמיסה פיזיולוגית בריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל).
    3. הזרקה תת עורית של תחליב MOG35-55 : באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 26 גרם, לבצע שלוש זריקות תת עוריות של תחליב מוכן בעבר: שניים מתחת לחלק הרוסטרלי של האגפים ואחד בבסיס הזנב. נפח התחליב המוזרק בכל אתר הוא 100 μL, לנפח כולל של 300 μL תחליב המוזרק בכל עכבר.
      הערה: יום החיסון נרשם כיום 0 לאחר החיסון (dpi); 48 שעות מאוחר יותר (כלומר, ב 2 dpi), יש צורך לבצע הזרקה נוספת תוך ורידי של PT שווה לזה שבוצע בעבר. ניתן לבצע את ההזרקה ללא הרדמה, באמצעות ריסון עכבר. ההליך המתואר כאן נועד לגרום ולשמור על הרדמה של העכברים במהלך הליך החיסון כדי למנוע אי נוחות ותנועות אפשריות של בעלי החיים או סיכונים הן לעכברים והן לחוקרים. לכן, אין הליכים כירורגיים. עם זאת, כדי לייעל את תהליכי הניסוי, חשוב לשמור על תנאים סטריליים מתאימים במהלך שלבים אלה ולעקוב אחר מצבו של העכבר לאחר הליכים אלה.
    4. כדי לוודא שהעכבר התאושש מהזריקות, הניחו אותו בכלוב נקי לאחר ההליכים והמתינו עד שיחזור להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה. לאחר שהעכבר התאושש לחלוטין, החזירו אותו לכלוב הביתי עם בעלי חיים אחרים.

3. מעקב EAE

  1. משקל גוף וצריכת מזון
    1. עקוב מדי יום אחר משקל הגוף (BW) של בעלי החיים, באמצעות איזון מדויק אלקטרוני, מכיוון שהירידה ב- BW היא אינדיקטור להתקדמות המחלה.
      הערה: ירידה זו לא תעלה על אחוז מסוים, בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית והאתית לטיפול בבעלי חיים. בדרך כלל, אם בעל חיים מאבד יותר מ -20% ממשקל הגוף ההתחלתי (כלומר, המשקל שנרשם ב 0 dpi), יש להקריב אותו כיישום של נקודת הקצה האנושית. שיטות המתת החסד כוללות הרדמה עמוקה ובלתי הפיכה לשאיפה (למשל, 5% איזופלורן) ואחריה עריפת ראש.
    2. עקוב אחר צריכת המזון (FI) - המזון שנאכל על ידי בעל חיים ביום (g∙day-1∙animal-1), שקילת כמות המזון במיכל הספציפי לפחות פעם בשבוע, וחלוקת כמות המזון הנאכל עבור הימים שחלפו בין שתי מדידות עוקבות ומספר בעלי החיים הנמצאים בכלוב.
      הערה: מדידה זו מאפשרת להעריך את צריכת המזון הממוצעת. בגלל המראה וההצטברות של סימני מחלה קליניים, הכוללים שיתוק של הגפיים, אנו מציעים להניח מעט מזון מושקה על רצפת הכלוב כאשר בעלי החיים אינם מסוגלים לעמוד בחוזקה על גפיהם האחוריות ולהגיע למיכל המזון או לבקבוק המים. כדי להעריך את צריכת המזון במהלך תקופת המעקב בצורה מדויקת ככל האפשר, מדדנו גם את המשקל היבש של מזון זה לפני שהרטבנו אותו עבור העכברים.
  2. הערכה של מחזוריות ייחום במהלך EAE
    1. בדוק את מחזור הייחום במשך שני מחזורים לפחות, והערכת מריחות הציטולוגיה של הנרתיק כפי שתוארו על ידי McLean et al.24. לסווג את השלב של מחזור הייחום בהתבסס על נוכחותם של שלושה סוגי תאים ראשוניים - תאי אפיתל גרעין, תאי אפיתל קשקש cornified, ו leukocytes - בדגימות כתם הנרתיק, כדלקמן:
      1. מסווגים כפרוסטרוס בהתבסס על נוכחות כמעט בלעדית של אשכולות של תאי אפיתל עגולים ומעוצבים היטב.
      2. לסווג כמו ייחום מבוסס על נוכחות דומיננטית של אשכולות צפופים של תאי אפיתל קשקש cornified.
      3. לסווג כמו metestrus מבוסס על נוכחות דומיננטית של לויקוציטים מוכתמים כהה קטנים נוכחות מינורית של תאי אפיתל קשקש cornified.
      4. לסווג כמו diestrus מבוסס על נוכחות דומיננטית מאוד של לויקוציטים מוכתמים כהים קטנים תאי אפיתל קשקש נדיר cornified יחד עם המראה האפשרי של תאי אפיתל גרעין.
        הערה: בעת הערכת המחלה בשני המינים, חשוב לבדוק את השונות בנקבות עקב מחזור הייחום. אנו מציעים להתמקד בהערכת מחזור הייחום, במיוחד בין השבוע הראשון והשני לאחר החיסון (כלומר, בשלב החריף של EAE). הוכח בעבר כי הליך החיסון גורם לשינויים הבולטים ביותר של מחזור הייחום בשלבזה 25. יתר על כן, חשוב לקחת בחשבון כי ביצוע המריחה כאשר בעל החיים מגיע לציון קליני גבוה (במיוחד >3) קשה בשל paresis האחורי ואת חוסר טונוס בגפיים האחוריות.
  3. ציון קליני
    1. בקש מחוקר עיוור להעריך את הציון הקליני של בעלי החיים מדי יום. הקצו לכל בעל חיים ציון מדורג מ-0 עד 5 (ראו טבלה 2) כדי להעריך את מהלך המחלה26 כפי שמתואר על ידי Racke7.
      הערה: בדומה לירידה במשקל הגוף, גם נקודת קצה הומנית נחוצה לעלייה בציונים הקליניים, בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית והאתית לטיפול בבעלי חיים. באופן כללי, אם בעל חיים אינו מסוגל עוד להאכיל את עצמו באופן אוטונומי (זה קורה בדרך כלל כאשר בעל חיים מגיע לפחות לציון 4, על פי הסולם שבו אנו משתמשים), יש להקריב אותו כיישום של נקודת הקצה ההומאנית.
  4. הערכת ביצועים מוטוריים על ידי מבחן רוטרוד
    הערה: הערכה של התקדמות EAE מתבצעת בדרך כלל על ידי הקצאת הציון הקליני מדי יום, אשר נעשה על ידי חוקר עיוור מאומן לחלוטין. עם זאת, זה יכול להיות שימושי כדי לאגף אותו עם הערכה כמותית ואובייקטיבית יותר של התקדמות המחלה. במחקר קודם26, מבחן רוטרוד שימש למדידת הביצועים המוטוריים של בעלי החיים המחוסנים. כפי שתואר על ידי ואן דן ברג ואחרים 27, כדי לקבל הערכה קלינית כמותית ומדויקת יותר של מהלך המחלה, הערכת הביצועים המוטוריים על ידי מבחן רוטרוד יכולה לתמוך בהערכת הציון הקליני. לתיאור מפורט ראו Van den Berg et al.27.
    1. תנו לעכברים לעבור רוטרוד מדי יום, החל מ 1 dpi עד הקורבן (כלומר, 28 dpi). כל סשן מורכב מהפעלה אחת של 300 שניות שבמהלכה יש להגדיל את מהירות המוט באופן ליניארי מ-4 ל-40 סל"ד.
    2. רשום את הציון של החיה. כאשר העכבר אינו מסוגל לשמור על שיווי משקלו ונופל מהמכשיר, הוא נופל על הקרקע ומפעיל חיישן, והזמן (ים) נרשם. לפיכך, הביצועים מנוקדים כהשהיה ליפול (ים).

כיתהסימן קליניתיאור
0בריאלא נצפה סימן קליני. החיה מראה טון רגיל ותנועה של הזנב. הוא הולך בלי למעוד.
0.5שער פגוםהחיה מטיילת תוך כדי הליכה על גריל.
1זנב צולעכאשר החיה מורמת על ידי בסיס הזנב, הזנב צונח (זנב רפוי).
1.5זנב רפוי ושער לקויהחיה מראה זנב רפוי, והיא מטיילת תוך כדי הליכה על גריל.
2אטקסיהבעל החיים מתקשה לעמוד לאחר שהופנה על גבו.
2.5אטקסיה ופרזיס של הגפיים האחוריותמפגני החיות אינם יכולים לעמוד על רגליהם לאחר שהופנו על גבם, והם מאבדים את הטון של אחת מגפיהם האחוריות.
3שיתוק הגפיים האחוריותהחיה מאבדת את הטון של שתי הגפיים האחוריות.
3.5שיתוק של הגפיים האחוריות ו/או פרזיס של הגפה הקדמיתהחיה מאבדת את הטון של שתי הגפיים האחוריות וחלקית של הגפיים הקדמיות. למעשה, זה מראה על אובדן כוח באחיזה של הגפיים הקדמיות.
4טטרה פרזיסהחיה מאבדת לחלוטין את טון איבריה.
4.5טטרה פרזיס וירידה בטמפרטורת הגוףהחיה מאבדת לחלוטין את טון איבריה, והיא מראה ירידה בטמפרטורת הגוף (היא קרה).
5גוסס או מתהחיה גוססת (היא אינה מגיבה לשום גירוי) או מתה.

טבלה 2: מערכת ניקוד קלינית המשמשת להערכת התקדמות EAE.

4. הערכה של סימנים היסטופתולוגיים הנגרמים על ידי EAE ברמת חוט השדרה

הערה: כאן, אנו מדווחים בקצרה על ההליך להקריב את בעלי החיים ולאסוף את חוט השדרה כדי לבצע ניתוח היסטופתולוגי; לקבלת תיאור מפורט, עיין בהפניות אלה 10,26,28,29.

  1. קיבוע ודגימת רקמות
    הערה: לקבלת תיאור מפורט, עיין בהפניות אלה 10,26.
    1. להקריב את בעלי החיים ב 28 dpi במהלך השלב הכרוני של המחלה.
      1. מרדימים את העכברים בהרדמה עמוקה ובלתי הפיכה (הזרקה תוך צפקית של זולאזפם וטילטמין 80 מ"ג/ק"ג/קסילזין 10 מ"ג/ק"ג).
      2. יש לנקב את העכברים באמצעות תמיסת מלח ואחריה תמיסת פרפורמלדהיד (PFA) 4%.
        הערה: שימו לב בעת השימוש ב-PFA: מכיוון שהוא רעיל, הימנעו משאיפה, בליעה ומגע עם העור והעיניים באמצעות ציוד מגן אישי מתאים. שוקלים את האבקה, מכינים את התמיסה ומבצעים את הזילוח מתחת למכסה המנוע.
    2. הסר את חוט השדרה מעמוד השדרה30.
    3. אחסן את חוט השדרה בתמיסת 4% PFA למשך 24 שעות.
    4. בצע מספר שטיפות במאגר פוספט מי מלח 0.01 M (PBS).
    5. הטמע את חוטי השדרה בגושי פרפין30.
  2. הליכים היסטולוגיים
    הערה: לקבלת תיאור מפורט, ראה Montarolo et al.10.
    1. השתמש במיקרוטום כדי לחתוך קטעי חוט שדרה רוחביים בעובי 10 מיקרומטר ולאסוף אותם על שקופיות מצופות ג'לטין. כוון את מישור החתך כך שיתאים לציורים המתאימים לחלקים הרוחביים של אטלס חוט השדרהשל העכבר 31.
    2. לבצע את deparaffinization של סעיפים32.
    3. מכתימים את הקטע עם Hematoxylin ו Eosin32.
    4. לייבש את הסעיפים32.
    5. מכסים את החלקים באמצעי הרכבה ומניחים להם להתייבש בטמפרטורת החדר מתחת למכסה מנוע כימי.
      הערה: צביעת Hematoxylin-Eosin מאפשרת זיהוי של נוכחות של חדירות דלקתיות perivascular (PvIIs)26, אשר מוערך כסימן של המחלה28.
  3. ניתוח כמותי של חלקי חוט השדרה
    1. קבל תמונות של החלקים המוכתמים עם מיקרוסקופ אופטי מחובר למצלמה דיגיטלית עם מטרה 20x29.
    2. נתח את התמונה שנרכשה כדי לקבל את מספר PvIIs, מבוטא כמספר הסתננויות למ"מ2.
      הערה: לניתוח התמונות שנרכשו, כדאי לנצל את תוכנת ניתוח התמונות. ממצאים נוירופתולוגיים המוצגים בעבודה זו מכומתים ב-10 חתכים שלמים של חוט השדרה לכל עכבר (n = 8/קבוצה) המייצגים את כל רמות חוט השדרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מעקב EAE לאחר החיסון
זה הוערך כמתואר להלן.

משקל גוף וצריכת מזון
הניתוח הדו-כיווני של השונות (ANOVA) (מין וזמן כמשתנים בלתי תלויים) מראה ירידה ב-BW של חיות EAE משני המינים, במיוחד בשבוע השני לאחר האינדוקציה (F(1,57) = 4.952, p < 0.001; איור 2A). אולם הדימורפיזם המיני ב-BW נשמר תמיד (איור 2A). במונחים של אחוז BW (F(1,57) = 23.935, p <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול EAE המושרה על ידי MOG35-55 שתיארנו הוביל לפיתוח צורה כרונית של טרשת נפוצה בעכברי C57BL/6J 7,8,13. בתוצאות מייצגות אלה, דיווחנו כי בעלי חיים משני המינים שעברו את הליך החיסון פיתחו צורה כרונית של המחלה (כלומר, הם אינם מחלימים לחלוטין לאחר הופעת המחלה, הם צוברים גירעונות, ושומרים על ניתוח קיסרי לפחות של 1.5 בשלב הכרוני).

גם אם מחקרים רבים אינם מדווחים על הבדלים בין זכרים ונקבות במודל<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לאף אחד מהמחברים אין ניגודי עניינים להצהיר ביחס למחקר, למחבר ו/או לפרסום של מאמר זה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 ו- 2023-2027 למחלקה למדעי המוח ריטה לוי מונטלצ'יני; קרן קאבליירי-אוטולנגי, אורבסאנו, איטליה. BB היה עמית של INFRA-P, אזור פיימונטה (n.378-35) (2022-2023) ו-PRIN 2020-20203AMKTW. אנו מודים ל-Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) על התמיכה. דמי הפרסום נתמכו על ידי התרומה הנדיבה של Distretto Rotaract 2031, ובמיוחד, Rotaract Club Torino Nord-Est. אנו מודים לאיליין מילר על ההגהה של כתב היד שלנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
18 גרם x 1 ו-frac12; “ מחט 1.2 x 40 מ"מ למזרק הזכוכית TerumoTER-HYP-18G-112-PIN
המחוברת למיקרוסקופ האופטימצלמה דיגיטלית
איזון דיוק אלקטרוניMerckMod. Kern-440-47N, רזולוציה 0.1 גרם
Eosin YSigma-AldrichHT110216
צינור מזרק זכוכית " אולטרה אספט" 10 מ"לסאקו סיסטם 
כלי זכוכית (כלומר, בקר להכנת האמולסיה)VWR213-1170, 213-1172
המטוקסילין (מאייר s)מסנן Sigma-AldrichMHS32לפני השימוש בו. 
תוכנה לניתוח תמונותפיג'י
פרוינד לא שלם s adjuvant (IFA)חנות Sigma-AldrichF5506ב +4 °C. 
איזופלורןוולונה פארמהתרופה זו משמשת כחומר הרדמה בשאיפה.
עכברי C57BL/6J זכר ונקבהמעבדת ג'קסון, גיל Envigo8-10 שבועות, משקל גוף אופטימלי של ~20 גרם. 
MicrotomeLeica HistoCore BIOCUT R
מדיום הרכבה Merck107961
Mouse RotarodUgo Basile #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), זן H37Ra מעבדות דיפקו בע"מ 231141לאחסן ב-+4 מעלות צלזיוס.
מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין פפטיד 35-55 (MOG35-55)EspikemEPK1יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות; C מדולל (2 מ"ג/מ"ל) בתמיסה פיזיולוגית; להכין אותו ביום החיסון כדי למנוע, ככל האפשר, שינויים או זיהומים.
מיקרוסקופ אופטיNIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich158127Store ב-+4 ° C מדולל (4%) במאגר פוספט.
רעלן שעלת (PT)Duotech PT.181חנות ב-80 מעלות; C מדולל (ריכוז 5 ומיקרו; g/mL) בתמיסה פיזיולוגית 
תמיסה פיזיולוגית (תמיסת נתרן כלורי 0.9%)B. EurospitalA 032182038לאחסן בטמפרטורה של +4 מעלות; C נפתח פעם אחת.
מאגר פוספט מלוח (PBS)Thermo ScientificJ61196.
לרכישת תמונות  מזרקי NIS-Element AR 2.10
U-100 0.5 מ"ל עם 30 גרם x 5/16 אינץ' (0.30 x 8 מ"מ) במחט קבועה  מזרקי NiproSYMS-0.5U100-3008B-EC
U-100 1 מ"ל עם 26G x ½ ” (0.45 x 12.7 מ"מ) במחטPIC20,71,26,03,00,354
משחה וטרינרית לעינייםLacrilube, Lacrigel Europhta
XylazineRompunתערובת זו של תרופה משמשת כחומר הרדמה והרגעה להזרקה.
Zolazepam ו-TiletamineZoletil  100תרופה זו משמשת כחומר הרדמה, הרגעה, מרפה שרירים ומשכך כאבים
מצלמה דיגיטלית NIKON DS-U1L003465תוכנת AP

מקורות

  1. Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
  2. Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
  3. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185(2021).
  4. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  5. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), Zurich, Switzerland. 123-137 (2017).
  7. Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , Chapter 9, Unit 9.7 (2001).
  8. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  9. Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
  10. Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791(2014).
  11. Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831(2021).
  12. Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151(2021).
  13. Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058(2022).
  14. McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It's complicated. Front Immunol. 13, 1059833(2022).
  15. Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
  16. Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
  17. Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
  18. Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
  19. Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
  20. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412(2010).
  21. Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778(2012).
  22. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  23. Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
  24. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389(2012).
  25. Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4(2014).
  26. Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
  27. vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  28. Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
  29. Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida--a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
  30. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  31. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Chapter 16 - Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. , Academic Press. 308-379 (2009).
  32. Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084(2021).
  33. Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
  34. Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
  35. Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
  36. Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50(2020).
  37. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
  38. Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924(2021).
  39. Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
  40. Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
  41. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון


Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 2/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

תגיות

MOG 35 55C57BL 6JRotarod

מאמרים קשורים