מחקר ניסיוני על תרדמת חורף של חיפושית תפוחי אדמה בקולורדו בתנאים טבעיים

חיפושית תפוחי אדמה מקולורדו Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) היא מזיק חשוב של צמחי Solanaceae, בעיקר תפוח אדמה Solanum tuberosum L. הטווח הגיאוגרפי של מין זה הוא יותר מ -16 מיליון ק"מ² ומתרחב כל הזמן¹. ל- CPB יש דיאפאוזה חורפית פקולטטיבית, ותרדמת חורף היא חובה באזור הממוזג. הדיאפאוזה נגרמת על ידי פוטופריוד קצר של יום ומווסתת על ידי טמפרטורה¹. חיפושיות אלה חורפות בשלב הבוגר על ידי התחפרות באדמה. עם קווי רוחב הולכים וגדלים, משך תקופת תרדמת החורף מתארך. באזור הממוזג, במיוחד בשטחים הצפוניים של טווח התפוצה שלו, החורף נמשך עד 9 חודשים: מאוגוסט-ספטמבר עד מאי-יוני (Noskov et al., תצפיות אישיות). במהלך תקופה זו, CPB - בדיוק כמו כל חרק אחר באזור ממוזג - חשוף לתנאי חורף שליליים חייב להגביר את סובלנותו לקור. יחד עם זאת, מגע של החיפושיות עם הקרקע מגביר את הסיכון לזיהום על ידי מיקרואורגניזמים אופורטוניסטיים ופתוגניים שונים². לכן, חיפושיות אלה צריכות לשמור על רמה מסוימת של פעילות מערכת החיסון במהלך תרדמת החורף, שגם היא יקרה מבחינה אנרגטית. עם זאת, גם אם החרק שורד זיהום, המחלה עשויה להפחית את קשיות הקור שלו³. יש לציין כי טמפרטורה נמוכה אינה הסיבה היחידה לתמותה בחורף של CPB. תפקיד חשוב הוא גם שיחק על ידי חוסר חמצן, ובתנאים מסוימים, זה יכול להיות הגורם העיקרי של תמותה החורף ^4,5.

ידוע כי תמותה טבעית בחורף של CPB יכולה להיות גבוהה מאוד, ולהגיע ל -100% בקרקעות חרסיתיות⁶. לכן, חורף יתר הוא אחת התקופות המכריעות ביותר במחזור החיים של CPB. עם זאת, נתונים על הפיזיולוגיה, פעילות מערכת החיסון, הישרדות ופרמטרים אחרים של תרדמת CPB בתנאים טבעיים עדיין מוגבלים. ישנם מחקרים על ביטוי גנים דיפרנציאלי ופרמטרים פיזיולוגיים שונים במבוגרים CPB במהלך הדיאפאוזה ובתגובה להלם קור 7,8,9,10,11,12; עם זאת, ניתוחים אלה בוצעו בעיקר על ידי השראת דיאפאוזה או לחץ קר בתנאי מעבדה ללא תנודות טבעיות של טמפרטורה, לחות ועומס פתוגן טבעי. עם זאת, יש חשיבות למחקר על הפיזיולוגיה של חיפושיות אלה שנאספו בחפירה מהקרקע בתנאים טבעיים. היבטים שונים של CPB חורף בתנאים טבעיים נחקרו באופן פעיל בשנות השבעים והשמונים 13,14,15,16,17,18. מצד שני, מחקרים אלה לא כללו חפירת CPB מהאדמה בחורף. בנוסף, טכניקה לתרדמה מבוקרת של CPB ותיאור הכלובים אינם מסופקים בפירוט. לפיכך, יש צורך לחקור את הפיזיולוגיה של CPBs החורפים בסביבה טבעית¹⁹.

מטרת מחקר זה הייתה לפתח ולבדוק שיטה לתרדמה מבוקרת של מבוגרים CPB בתנאים טבעיים. השיטה המוצעת מאפשרת להשיג מספר רצוי של אנשים CPB עבור בדיקות מיקרוביולוגיות, אימונולוגיות ואחרות במהלך תרדמת החורף בתנאי שדה של אקלים יבשתי. שיטה זו ניתנת להתאמה וליישום על מיני חרקים אחרים החורפים באדמה תחת שלג.

1. תיאור הכלובים לתרדמת חורף

הערה: בהתאם למטרות הניסוי, מספר הכלובים משתנה. יש להשתמש לפחות בשלושה כלובים בכל תאריך דגימה. כדי להעריך את מספר החיפושיות שיצאו, הכינו לפחות שלושה כלובים נוספים, שלא יוצאו מהאדמה עד האביב.

1. השתמשו בכלובים העשויים מסגרת עץ קשיחה בגודל 25 × 25 × 40 ס"מ (L × W × H).
2. לבניית מסגרת לכלוב יש להשתמש בלוחות עץ בעובי 2 ס"מ לפחות וברוחב 4 ס"מ.
3. כסו את פנים הכלוב ברשת נירוסטה בגודל פתחים שאינו עולה על 5 מ"מ × 3 מ"מ. השתמש מהדק עץ כדי לתקן את הרשת.
4. קבע את רשת הנירוסטה לחלק החיצוני של התחתית באמצעות המהדק.
5. רפדו את פנים הכלוב בגיאוטקסטיל סינתטי שחור בצפיפות של 60 גרם/מ"ר².
   הערה: הגיאוטקסטיל משמש מחסום נוסף למניעת בריחת החיפושיות. אין להשתמש בו בניסויים הקשורים לתנועה פעילה של אנטומופתוגנים וטפילים.
6. חברו בחוזקה צינור של בד סינתטי שקוף ונושם בגובה של כ-60 ס"מ לחלק העליון של הכלוב.
7. חוצים ומקבעים שני חבלים חזקים לתחתית הכלוב כדי למשוך אותו מהאדמה בעת הצורך.

2. התקנת הכלובים

1. חופרים בור בעומק 40 ס"מ באדמה ומניחים את הכלוב בתוכו.
2. הניחו דשא יבש או חציר על החור.
3. הניחו את הכלוב בתוכו כך שהחציר או העשב היבש יהיו בין דפנות הכלוב לאדמה.
4. מלאו את הכלובים באדמה מאותו שדה תפוחי אדמה שבו נאספים החרקים.
5. התקינו אוגרי נתוני טמפרטורה ולחות עמידים למים בכלובים בעומקים הנדרשים.
   הערה: ניתן להשתמש באוגרי נתונים מכל יצרן ועליהם להיות מסוגלים לפעול בטמפרטורות נמוכות.
6. שתול שתילי תפוחי אדמה בתוך כל כלוב 3-4 שבועות לפני כניסת החיפושיות והשקו אותם במתינות.
7. מקבעים צינור בד סינטטי במאונך למקל מכל חומר המותקן בצד החיצוני של הכלוב.

3. גידול חרקים לפני חורף

1. אספו ידנית חיפושיות בוגרות בשדות תפוחי אדמה ללא חומרי הדברה לקראת סוף צמחיית תפוחי האדמה.
   הערה: חיפושיות בוגרות שונות באופן מהותי מהזחלים ומאופיינות באליטה מפוספסת, בעוד שהזחלים אדומים.
2. שמרו את החיפושיות שנאספו בדליים מפלסטיק של 15-20 ליטר (מקסימום 200 פרטים לכל דלי) המכילים צמרות תפוחי אדמה להאכלת החרקים לפני הכנסתם לכלובים.
3. מכסים את הדליים בבד נושם.
   הערה: אין להחזיק חרקים בדליים במשך יותר מ-12 שעות. השתמשו בצמרות תפוחי אדמה גדולות מספיק כדי למנוע הצטברות של חיפושיות בתחתית הדליים.
4. הניחו לא יותר מ-200 CPB על צמחי תפוחי האדמה המכוסים ברשת הבד הסינתטי.
5. לאחר צריכת צמרות תפוחי האדמה, הוסיפו את הטריות המונחות בצנצנת פלסטיק המכילה מים והחליפו את צמרות תפוחי האדמה מדי יום לאחר מכן.
   הערה: כדי לתקן גבעולים בצנצנת, השתמש בצמר גפן ופרפילם. בדוק בזהירות גבעולים ישנים עבור החיפושיות בעת הסרתם.
6. לאחר שכל החיפושיות מתחפרות באדמה לחורף, התירו את צינור הבד הסינתטי מהמקל והניחו את הבד.

4. איסוף חרקים בעונת החורף

1. יש להסיר שלג מעל פני הכלוב.
2. שחררו את הכלוב מכל צד עם חפירה חזקה.
3. משכו את הכלוב מהאדמה בעזרת החבלים.
4. הביאו את הכלוב למעבדה.
   הערה: בהתאם למטרות הניסוי, חיפושיות בתרדמת חורף עשויות להיות לא פעילות לפני הניתוח. במקרה זה, הטמפרטורה במעבדה במהלך בידוד של חיפושיות מן הקרקע צריך להיות ~ 2-5 ° C.
5. מוציאים את האדמה מהקופסה במנות קטנות, מפרקים בזהירות חתיכות אדמה גדולות ומבודדים חיפושיות באמצעות פינצטה.
6. להפריד חיפושיות חיות מגופות. חיפושיות חיות ובריאות יוצרות סביבן אדמה קומפקטית, יוצרות חלל אוויר (מה שנקרא עריסה), ולכן הן מופרדות בקלות מהאדמה. חיפושיות שנהרגות על ידי פטריות נחנטות או שיש להן תפטיר גלוי על פני השטח. חרקים המתפרקים חיידקים הם כהים.
7. לנפות את הקרקע דרך מסננת כדי לוודא שכל החיפושיות מבודדות ולא ניזוקו.
8. מניחים גופות עם תסמינים של זיהום פטרייתי או פירוק חיידקי בצינור צנטריפוגה סטרילי בודד של 15 מ"ל לזיהוי עתידי.
9. אחסנו חיפושיות חיות במקרר בטמפרטורה של 0-2 מעלות צלזיוס עד לניתוח במיכל מאוורר סגור המכיל כדור צמר גפן לח.

5. הכנת דגימות איברים ורקמות

1. כדי לאסוף hemolymph, לעשות נקב בחלק הצדדי של הבטן תחת אליטרה באמצעות מחט אינסולין.
   הערה: במהלך החורף, כמות ההמולימפה מופחתת באופן משמעותי, מה שמקשה על איסוף נוזל זה.
2. כדי לבודד את המעיים, חתכו את קפסולת הראש, סחטו את כל התוכן לתוך צלחת פטרי עם חיץ פוספט, הפרידו את המעי ונקו אותו משומן וכלי דם מלפיגיים.
3. הפרידו בין החלק הרצוי של המעי, כמו המעי הקדמי, המעי האמצעי או המעי האחורי.
4. כדי לבודד את גוף השומן, להפריד אותו מרקמות אחרות לאחר בידוד של המעיים.
   הערה: הרקמות המבודדות יכולות לשמש למדידת הפעילות של אנזימים נוגדי חמצון ומסלקי רעלים (דוגמה: איור משלים 1), ניתוח של ויסות גנים של מסלול איתות חיסוני (דוגמה: איור משלים 2), או מטא-ברקוד של תכולת מעיים של חרקים וכו'.

6. בידוד מיקרואורגניזמים מן הגופות

1. כדי לבודד פטריות אנטומופתוגניות מהגופות, הכניסו את החרקים החנוטים לתא לחות סטרילי.
2. יש להשתמש בקונידיה אווירית (אם קיימת) או בסקלרוטיה מהתוכן הפנימי של החיפושיות לציפוי על אגר דקסטרוז Sabouraud עם 0.4% חומצה לקטית.
   הערה: השתמש בחיפושיות עם תפטיר וקונידיה לציפוי באופן מיידי (מבלי למקם אותן בתאי לחות).
3. לבודד חיידקים מן הגופות עם סימפטומים של פירוק חיידקים.
4. חתכו את ראשה של החיפושית, סחטו את התכולה הפנימית ואספו אותה לצינורות לציפוי הבא על מצע לחיידקים (אגר לוריא-ברטאני, אגר אנדו ואגר אסקולין מרה).
   הערה: השתמש במיקרוסקופ ובשיטות מולקולריות כדי לזהות סוגים ומינים של פתוגנים. במידת הצורך, ניתוח לנוכחות של טפילים אחרים ניתן לבצע.

התוצאות להלן על CPB חורף מראות טמפרטורת קרקע, הישרדות וזיהומים.

דינמיקה של טמפרטורת הקרקע.
טמפרטורות מתחת לאפס בכלובים בעומק של 30 ס"מ נרשמו מסוף נובמבר עד תחילת אפריל (איור 1). הטמפרטורה הממוצעת בתקופה זו הייתה מינוס 3.3 ± 0.1 °C (75 °F) (ממוצע ± שגיאת תקן). הטמפרטורה הנמוכה ביותר שנרשמה הייתה מינוס 7.9 °C (75 °F) באמצע פברואר.

הישרדות של CPB חורף.
תמותת חרקים נצפתה במהלך תרדמת החורף והגיעה למקסימום באביב לפני הופעתם. המספר הראשוני של חיפושיות היה 2000, מתוכם 1470 פרטים שרדו עד סוף מאי. שיעור ההישרדות של החיפושיות במהלך תרדמת החורף היה 61% (איור 2).

זיהומים ב- CPB חורף.
ניתוח של 530 חיפושיות מתות הראה שבמהלך תקופת תרדמת החורף, ל-53% מהן היו תסמינים של פירוק חיידקים, ול-25% היו תסמינים של זיהומים פטרייתיים (איור 3). בווריה שלטה (45 מבודדים) בין התרבויות המבודדות של פטריות אנטומופתוגניות. Metarhizium, Cordyceps (=Isaria) ו Lecanicillium היו הרבה פחות נפוצים (שני מבודדים כל אחד). בין החיידקים שבודדו מהגופות עם תסמינים של פירוק חיידקים (n = 30), זוהו מינים השייכים לסוגים Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella ו - Glutamicibacter (טבלה משלימה 1).

איור 1: דינמיקת טמפרטורת הקרקע. דינמיקת טמפרטורת הקרקע כפי שנמדדה על ידי אוגר נתוני טמפרטורה עמיד למים המותקן בעומק של 30 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הישרדות של חיפושיות תפוחי אדמה חורפיות בקולורדו בתקופות שונות של תרדמת חורף. הכלובים נחפרו, והחיפושיות ששרדו והמתות נספרו בנובמבר, ינואר, אפריל ומאי. ברים מייצגים את מספר החיפושיות ששרדו. שפם מציין שגיאת תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: זיהומים בגופות חיפושיות תפוחי אדמה בקולורדו בחורף יתר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

חומרים משלימים: לחץ כאן כדי להוריד את הקבצים המשלימים שלהלן.

תרשים משלים 1. פעילות של אסטראזות לא ספציפיות באמצע המעי של CPB במהלך תרדמת החורף. שפם מציין שגיאת תקן. אותיות שונות מצביעות על הבדלים משמעותיים בין נקודות הזמן (מבחן דאן, P < 0.05).

איור משלים 2: שינויים בביטוי גורם השעתוק NFkB (מסלול IMD) במעיים ובגוף השומן של CPB במהלך תרדמת החורף. הנתונים מוצגים כשינויי קיפול ביחס לנקודת זמן של אוגוסט. Rp4, Rp18 ו-Arf19 שימשו כגני ייחוס. שפם להציג שגיאת תקן.

טבלה משלימה 1: זיהוי משוער של רצפי גנים 16S rRNA (~800 bp) של חיידקים שבודדו מ-CPB מת במהלך תרדמת החורף.

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.