הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת תרחיף חד-תאי מעורקי התרדמה של העכבר לריצוף חד-תאי

3.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65863

⸱

19 בינואר 2024

 ,  ,  ,  , 
1Cyrus Tang Hematology Center, Cyrus Tang Medical Institute, Soochow University, 2Collaborative Innovation Center of Hematology of Jiangsu Province, Soochow University, 3Suzhou Key Laboratory of Thrombosis and Vascular Biology, Soochow University

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים פרוטוקול עיכול תאים דו-שלבי להכנת תרחיף חד-תאי של עורקי התרדמה של עכברים.

תקציר

עורקי התרדמה הם כלי דם מרכזיים בצוואר המספקים דם וחמצן למוח, אך היצרות התרדמה מתרחשת כאשר עורקי התרדמה נסתמים על ידי פלאק. חשיפת ההרכב התאי של עורק התרדמה ברמת התא הבודד חיונית לטיפול בטרשת עורקים של התרדמה. עם זאת, אין פרוטוקול מוכן לשימוש להכנת מתלים חד-תאיים מעורקי התרדמה. כדי לקבל פרוטוקול מתאים לדיסוציאציה של עורקי התרדמה הרגילים ברמת התא הבודד עם פחות נזק לתאים, תכננו שיטת עיכול דו-שלבית על ידי שילוב תהליך העיכול של collagenase/DNase וטריפסין. ספירת פלואורסצנטיות כפולה של Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) שימשה לזיהוי כדאיות התא וריכוזו, ונמצא כי התרחיף החד-תאי עונה על הדרישות לריצוף תא יחיד, עם כדאיות של תאים מעל 85% וריכוז תאים גבוה. לאחר עיבוד נתונים של תא בודד, חציון של ~2500 תעתיקים לכל תא זוהו בכל תא עורק התרדמה. יש לציין כי מגוון סוגי תאים של עורק התרדמה התקין, כולל תאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs), פיברובלסטים, תאי אנדותל (ECs), מקרופאגים ותאים דנדריטיים (Mφ/DCs), היו ניתנים לגילוי בו זמנית. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם להכנת תרחיף חד תאי של כלי דם מרקמות אחרות עם שינויים מתאימים.

מבוא

טרשת עורקים היא מחלה דלקתית כרונית הקשורה לגורמי סיכון כגון לחץ דם גבוה, היפרליפידמיה, והמודינמיקה1. התפצלויות בעורק התרדמה מועדות לשינויים המודינמיים ומובילות להיווצרות רובד התרדמה. ההצגה הקלינית של טרשת עורקים קרוטיד יכולה להיות חריפה כגון שבץ מוחי ואיסכמיה מוחית חולפת, או כרונית כגון איסכמיה מוחית חולפת חוזרת ודמנציה וסקולרית2. מבחינה מכנית, רובד התרדמה הוא תוצאה של אינטראקציה בין תאי דופן כלי דם שונים ותאי דם שונים בתנאים פתולוגיים. לכן, חשיפת האטלס החד-תאי של כלי התרדמה בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים חשובה במיוחד למניעה וטיפול בהתפתחות פלאק התרדמה.

ריצוף RNA חד-תאי הוא אחת הטכנולוגיות החזקות ביותר של המחקר הביולוגי בגלל הרזולוציה הגבוהה במיוחד שלו וזיהוי הטרוגניות התא מאותו סוג תא של אורגניזמים 3,4. חוקרים השתמשו בריצוף RNA חד-תאי כדי לערוך מחקרים בתחומים רבים, כגון מחלות לב וכלי דם5 וסרטן6. עם זאת, הפרדה מהירה ומדויקת של רקמות לתאים בודדים היא עדיין אחד האתגרים העיקריים. דיסוציאציה אנזימטית היא שיטה נפוצה הכוללת בעיקר קולגנאז, פפאין, טריפסין, DNase והיאלורונידאז. בפרט, collagenases הם מיני האנזימים העיקריים לעיכול של תא יחיד, בעיקר הידרוליזה של רכיבי קולגן ברקמות חיבור. סוגים שונים של collagenase ישימים לדיסוציאציה של רקמות שונות, כגון בלוטת החלב7, גלומרולוס8, זווית אירידוקרנית9, מפרק הברך 10, אבי העורקים11 וריאה12. בשל התכונות הפיזיולוגיות הייחודיות של רקמות שונות, דיסוציאציה באותה שיטה עלולה לגרום לבעיות רבות ברכישת תאים בודדים, כגון כדאיות נמוכה של תאים, מספר תאים נמוך ופסולת תאים גדולים. לכן, המצאת שיטות העיכול לרקמות שונות חיונית להכנת תרחיפים חד-תאיים באיכות גבוהה.

פרוטוקול זה נועד לפתח שיטת עיכול תאים דו-שלבית להכנת תרחיף חד-תאי של עורק התרדמה של עכברי בר. בהתאם למאפיינים של עורק התרדמה, שילבנו collagenase/DNase עם טריפסין כדי לקבל תרחיף חד-תאי באיכות גבוהה של עורק התרדמה של עכבר, מכיוון ש-collagenase יכול לבצע הידרוליזה של קולגן ברקמות התרדמה, אשר התעכל עוד יותר על-ידי טריפסין לתרחיף חד-תאי. ספירת פלואורסצנטיות כפולה של Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) שימשה לזיהוי כדאיות התא וריכוזו, ונמצא כי התרחיף החד-תאי עונה על הדרישות לריצוף תא יחיד, עם כדאיות של תאים מעל 85% וריכוז תאים גבוה. לאחר עיבוד נתונים של תא בודד, ארבעה סוגי תאים, כולל תאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs), פיברובלסטים, תאי אנדותל (ECs), מקרופאגים ותאים דנדריטיים (Mφ/DCs), זוהו בעורקי התרדמה הרגילים של עכברים לאחר העיכול. היתרונות של פרוטוקול זה הם: 1) ניתן לזהות סוגי תאים מרובים בעורק התרדמה, 2) כדאיות התא נשמרת היטב, 3) ניתן לחזור עליו בקלות ללא ציוד מיוחד. פרוטוקול זה מתאים לחוקרים המעוניינים לחקור מולטיומיקה חד-תאית של עורקי התרדמה בעכבר. פרוטוקול זה עשוי גם להיות מועיל בדיסוציאציה של כלי דם אחרים עם שינויים מתאימים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל נהלי בעלי החיים המתוארים להלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סוצ'ו.

1. ריאגנטים והכנת חומרים

  1. השתמשו ב-1x PBS ללא סידן ומגנזיום וב-2.5 U/mL הפרין נתרן מלח להכנת תמיסת הזילוח. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C, ולהתקרר מראש על קרח בעת השימוש.
  2. הכינו מגיב דיסוציאציה A המכיל 125 CDU/mL collagenase II ו-60 U/mL DNase I על ידי דילול 1250 CDU/mL collagenase II ו-3000 U/mL DNase I עם HBSS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
  3. הכינו מגיב דיסוציאציה B המכיל ריכוז סופי של 0.12% טריפסין על ידי דילול 1 מ"ל של 0.25% טריפסין ללא EDTA (ללא פנול אדום) לתוך 1 מ"ל של 1x PBS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
  4. הכינו 10 מ"ל של 1.5% FBS ו-10 מ"ל של 5% FBS ב-1x PBS. יש להשתמש ב-1.5% FBS לבריכות עורקי התרדמה ולשמור על קרח לפני השימוש. השתמש ב-5% FBS כדי לנטרל את העיכול ולאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
  5. קבל את החומרים הניסיוניים, כולל מזרקים 1 מ"ל, מזרקים 20 מ"ל עם מחטים 26-G, צלחות תרבית תאים שש בארות, צינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל, מסננות תאים סטריליים 40 מיקרומטר ומכלי קרח.

2. הכנת ציוד

  1. לעקר את כל ציוד הניתוח, כולל מיקרוסקופ סטריאוסקופי, מספריים מנתחים, מספריים לניתוח מיקרו ומלקחיים עדינים.
  2. הפעל את מונה התאים האוטומטי ותחזק אותו ב- RT.
  3. הפעל את אמבט המים ל 37 מעלות צלזיוס מראש.
  4. מצננים מראש את המיקרוצנטריפוגה ל-4°C לפני השימוש.

3. בידוד עורק התרדמה של העכבר

  1. מרדימים את העכבר באמצעות 1.25% tribromoethanol על ידי הזרקה intraperitoneal (0.24 מ"ל עבור כל 10 גרם של משקל גוף) ולהפוך את העכבר כדי לבדוק אם יש רפלקס ימין לאחר 3 דקות. לאחר מכן, להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם ולהניח אותו על גבו. רססו את עור העכבר ב-75% אלכוהול.
  2. השתמש מספריים ניתוח מעוקר כדי לפתוח את העור ולחשוף את חלל החזה. פתח את הסרעפת.
  3. ממשיכים לחתוך כלפי מעלה ללסת התחתונה ומסירים בזהירות עודפי רקמות חיבור ושומן, תוך חשיפת עורק התרדמה.
  4. חותכים את הווריד הנבוב התחתון של העכבר כדי לגרום לדם לזרום מתוך מחזור הדם הסגור.
  5. להזריק 20 מ"ל של פתרון זילוח prechilled לתוך החדר השמאלי עם מזרק לאט וברציפות.
    הערה: אם הזלוף מצליח, איברים עשירים בדם כגון הכבד, הטחול והכליות יהפכו אפורים-לבנים.
  6. מקלפים את כל השומן ורקמות החיבור סביב עורק התרדמה בעזרת מספריים לניתוח מיקרו תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.
    הערה: שלב זה צריך להיעשות לאט ובזהירות כדי למנוע נזק לעורק התרדמה.
  7. בודדו את עורק התרדמה מהעכבר, שטפו עם 1x PBS כדי לשטוף שוב את הדם, והעבירו לצלחות של שש בארות המכילות 1.5% FBS על קרח.

4. עיכול עורק התרדמה לתרחיף חד תאי

  1. השתמש מספריים micro-dissecting לנתח את עורק התרדמה לאורך, ושכב שטוח על צלחת תרבית תאים אחרת 6 בארות המכילה 1 מ"ל של 1.5% FBS על קרח.
  2. שטפו את האינטימה בזהירות עם 1.5% FBS כדי להסיר את שאריות הדם.
    הערה: השטיפה צריכה להיות עדינה ואיטית כדי למנוע פגיעה בתאי אנדותל.
  3. חתכו כל עורק התרדמה לכ-2 מ"מ2 חתיכות רקמה באמצעות מספריים מיקרו-דיסקרטיים ב-1.5% FBS.
  4. מעבירים את חתיכות הרקמה הללו לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם קצוות נשא ברוחב 1 מ"ל, צנטריפוגה ב 400 x גרם למשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לשקוע את הרקמות לתחתית.
  5. להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את הרקמות ב 500 μL של מגיב דיסוציאציה A.
  6. הניחו את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת. פיפטה בעדינות עם פיפטה 1 מ"ל כל 10 דקות.
  7. הוסף 500 μL של 5% FBS לתוך הצינור ומערבבים היטב עם פיפטה 1 מ"ל.
  8. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים סטרילית בגודל 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל וצנטריפוגה במהירות 400 x גרם למשך 5 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
  9. הסר את supernatant בזהירות להשעות מחדש את גלולת התא ב 200 μL של מגיב דיסוציאציה B.
  10. הכניסו לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C ועיכלו במשך 5 דקות נוספות. יש למרוח פיפטה בעדינות כל 2 דקות במהלך העיכול כדי לנתק לחלוטין לתרחיף חד-תאי.
  11. השתמש 200 μL של 5% FBS כדי לסיים את תגובת העיכול, וצנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  12. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר של 1x PBS על קרח.

5. בדיקת תרחיף תאים וריצוף RNA חד-תאי

  1. הוסף 10 μL של תמיסת AO/PI לתוך 10 μL של תרחיף חד-תאי וערבב בעדינות עם פיפטה של 20 μL.
  2. פיפטה 20 μL של התערובת לתוך שקופית התא ולחכות 1 דקה.
  3. טען את השקופית במכשיר מונה התאים האוטומטי.
  4. בחר את בדיקת הכדאיות של AO/PI ולאחר מכן המתן לדוח האיכות.
  5. השתמש בערכת מגיב 3ʹ חד-תאי כדי ליצור חרוזי ג'ל חד-תאיים בתחליב על בקר חד-תאי ולהגביר את cDNA המקודד במחזור תרמי בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    הערה: כאן, Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3 שימש.
  6. בצע רצף על רצף עם אסטרטגיית קריאה של 150 bp (PE150) מקצה זוגי. השתמש ביישום תוכנה (Cell Ranger) כדי להמיר קבצי קריאת בסיס גולמיים לקבצי fastq באמצעות צינור mkfastq . לאחר מכן, השתמש בצינור הספירה של Cell Ranger לביצוע יישור, סינון, ספירת ברקוד וספירת מזהים מולקולריים ייחודיים (UMI) כדי ליצור מטריצות ברקוד13.
  7. בצע הפחתת ממדיות נתונים והדמיה חזותית עם חבילת R Seurat14.
    1. ראשית, הפונקציה Read10X() של Seurat קוראת בפלט של צינור Cell Ranger ולאחר מכן משתמשת במטריצת הספירה כדי ליצור אובייקט Seurat. לאחר מכן, סנן את התאים עם ביטוי של <200 או >4000 גנים או יחס גנים מיטוכונדריאלי שהיה יותר מ -10% על ידי תת-קבוצה () פונקציה של Seurat.
    2. השתמש ב- NormalizeData () וב- FindVariableFeatures() כדי לנרמל את הנתונים ולזהות 2000 תכונות משתנות מאוד, בהתאמה.
    3. בצע ניתוח רכיבים ראשי (PCA) על הנתונים שקנה המידה שלהם השתנה, וקבץ את התאים באשכולות עם dims = 30 ורזולוציה = 0.5. לבסוף, השתמש בפונקציה RunUMAP () כדי להציג באופן חזותי את ערכות הנתונים של תא בודד ובפונקציה FindAllMarkers() כדי למצוא כל סמן ביולוגי של אשכול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר שיטת עיכול תאים דו-שלבית להכנת תרחיף חד-תאי של עורקי התרדמה של עכברים (איור 1). שיטת עיכול תאים דו-שלבית זו משלבת collagenase/DNase עם טריפסין כדי לנתק ביעילות את דופן כלי התרדמה של העכבר כדי להשיג מתלים חד-תאיים באיכות גבוהה לריצוף תא יחיד. לאחר הדיסוציאציה, ריכוז התא ויכולת הקיום של התא חושבו על ידי מונה תאים אוטומטי. השדה הבהיר הראה את המורפולוגיה של תאי כלי התרדמה לאחר העיכול, וצביעה פלואורסצנטית כפולה של AOPI זיהתה בו זמנית את כדאיות התאים (איור 2A,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט להכנת תרחיף חד-תאי איכותי מעורק התרדמה של עכברי בר, שבו נבנתה שיטת עיכול דו-שלבית המשלבת את תהליך העיכול של collagenase/DNase וטריפסין. לאחר בדיקת האיכות של ההשעיה של תא בודד, מצאנו כי הוא עונה על הדרישות לריצוף תא בודד, עם כדאיות של תאים מעל 85% וריכוז תאים גבוה. יתר על כן, מגוון סוגי תאים בעורק התרדמה, כולל VSMCs, פיברובלסטים, ECs ו- Mφ / DCs, זוהו בהצלחה לאחר עיבוד נתונים של תא יחיד.

השיטות הנוכחיות להכנת תרחיפים חד-תאיים של התרדמה עדיין נדירות. Depuydt et al. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן למדעי הטבע של סין (82070450 ל- C.T.and 82170466 ל- L.Z.) ומלגת הקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (7121102223 ל- F.L).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין נטול EDTABeyotimeC0205מדלל 1 מ"ל של 0.25% טריפסין נטול EDTA ל-1 מ"ל של 1x PBS.
תמיסת מלח NaCl 0.9%BeyotimeST341לדלל את תמיסת הנתרן הפרין לריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל
מזרקים של 1 מ"לnbsp; SKJYLEANsk-r009לביצוע זלוף לב
צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"לKIRGENKG2211Wלצנטריפוגה של חתיכת הרקמה ותרחיף התאים
מזרקים של 20 מ"לSKJYLEANsk-r013לביצוע זלוף לב
40 ומיקרו; מסננת תאיםm JETBIOFILcss010040לסינון שברי רקמות לא מעוכלות
ערכת AO/PIHengrui BiologicalRE010212לזהות אם התא חי או מת
מונה תאים אוטומטיCountstarMira FLלנתח את מורפולוגיה התא ואת כדאיות התאים של תאי כלי דם צוואר מעוכלים
תוכנת Cell Ranger10 פעמים; גנומיקה3.0.2לעבד פלט RNA-seq של תא יחיד של כרום ולבצע אשכולות וניתוח ביטוי גנים
ערכות ריאגנט של תא יחיד כרום 3'Reagent v310× גנומיקה1000075להכין ספריות RNA-seq חד-תאיות של תרחיף חד-תאי
קולגנאזII סיגמא-אולדריץ'C6885לדלל עם HBSS לריכוז סופי של 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease IWorthingtonLS002140לדלל עם HBSS לריכוז סופי של 60 U/mL
סרום בקר עוברי HyCloneSH30088.03סיום תגובת העיכול
תמיסת המלח המאוזנת של האנק Gibco14175095 חנות בחדר טמפרטורה
מלח נתרן הפריןSolarbio Life ScienceH8060לדלל עם 0.9% NaCl לריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל
מיקרוצנטריפוגהתרמו פישר75002560מיושם לספינינג הרקמות וכדורי התאים
NovaSeq 6000 IlluminaN/ASequencer
מי מלח עם פוספטSolarbio Life ScienceP1000משמש לזלוף לב והשעיה מחדש של תאים
חבילת Seurat- RSatija Lab3.1.2לביצוע הפחתת מימדות, הדמיה וניתוח של נתוני ריצוף scRNA
לוחות תרבית תאים עם שש בארותNEST703002מקם את רקמת כלי הדם
אמבט מיםJinghongDK-S22שמור על טמפרטורת העיכול על 37 מעלות; ג
&

מקורות

  1. Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56(2019).
  2. Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56(2019).
  3. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694(2022).
  4. Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death Discovery. 7 (1), 180(2021).
  5. Rohlenova, K., et al. Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis. Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).
  6. Ren, X., et al. Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment. Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).
  7. Sun, H., Xu, X., Deng, C. Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands. Bio-Protocol. 10 (4), e3530(2020).
  8. Korin, B., Chung, J. -J., Avraham, S., Shaw, A. S. Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis. Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).
  9. Thomson, B., Quaggin, S. Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle. Bio-Protocol. 12 (10), e4426(2022).
  10. Leale, D. M., et al. A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321(2022).
  11. Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta. Bio-Protocol. 6 (11), e1832(2016).
  12. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator. Journal of Visualized Experiments. 29, e1266(2009).
  13. You, Y., et al. Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows. Genome Biology. 22 (1), 339(2021).
  14. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  15. Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).
  16. Gao, X. -F., et al. Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152(2021).
  17. Kumar, S., et al. Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments. Journal of Visualized Experiments. 176, e63128(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

עורק הקרוטידדיסוציאציית רקמהעיכול דו-שלביעיכול בקולגנאזעיכול בטריפסיןחיוניות תאיםתאי שריר חלק כלי דםתאי אנדותל
הכנת תרחיף חד-תאי מעורקי התרדמה של העכבר לריצוף חד-תאי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.