אופטימיזציה של תרבית תאי אפיתל בעדשה הראשית של עכבר: מדריך מקיף לטריפסיניזציה

סיכום

כתב יד זה מתאר פרוטוקול וידאו מפורט לגידול תאי אפיתל ראשוניים של עדשה (LECs), במטרה לשפר את יכולת השחזור ולסייע במחקר בקטרקט ובפסיפיקציה של קפסולה אחורית (PCO). הוא מציע הוראות שלב אחר שלב על דיסקציה של עדשות, בידוד LECs ותיקוף, ומשמש כמדריך רב ערך, במיוחד עבור מצטרפים חדשים בתחום.

תקציר

תאי אפיתל עדשה (LECs) ממלאים תפקידים חשובים רבים בשמירה על ההומאוסטזיס ותפקוד תקין של העדשה. LECs קובעים את צמיחת העדשה, התפתחותה, גודלה ושקיפותה. לעומת זאת, LECs לא מתפקדים יכולים להוביל להיווצרות קטרקט ו opacification קפסולה אחורית (PCO). כתוצאה מכך, הקמת מערכת תרבית LEC ראשונית חזקה חשובה לחוקרים העוסקים בפיתוח עדשות, ביוכימיה, טיפולי קטרקט ומניעת PCO. עם זאת, טיפוח LECs ראשוניים הציב זה מכבר אתגרים בשל זמינותם המוגבלת, קצב ההתרבות האיטי ואופיים העדין.

מחקר זה מתמודד עם מכשולים אלה על ידי הצגת פרוטוקול מקיף לתרבות LEC ראשונית. הפרוטוקול כולל שלבים חיוניים כגון גיבוש מדיום תרבית אופטימלי, בידוד מדויק של קפסולות עדשה, טכניקות טריפסיניזציה, נהלי תת-תרבית, פרוטוקולי קציר והנחיות לאחסון ומשלוח. לאורך כל תהליך התרבית, המורפולוגיה של התא נוטרה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.

כדי לאשר את האותנטיות של LECs בתרבית, נערכו בדיקות immunofluorescence כדי לזהות את הנוכחות ואת ההתפלגות התת-תאית של חלבוני עדשה קריטיים, כלומר αA ו-γ-crystallins. פרוטוקול מפורט זה מצייד את החוקרים במשאב רב ערך לטיפוח ואפיון LECs ראשוניים, ומאפשר התקדמות בהבנת הביולוגיה של העדשה ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות להפרעות הקשורות לעדשות.

מבוא

עדשת העין ממלאת תפקיד מכריע בראייה על ידי מיקוד האור הנכנס על הרשתית. הוא מורכב ממבנה שקוף, אווסקולרי המורכב מתאים מיוחדים, ביניהם תאי אפיתל עדשה (LEC) הם שחקני מפתח. LECs ממוקמים על פני השטח הקדמיים של העדשה והם אחראים על שמירה על שקיפותה, ויסות מאזן המים, והשתתפות בצמיחה ופיתוח העדשה ^1,2. LECs הם סוג ייחודי של תאים הממוקמים בחלק הקדמי של העדשה, וממלאים תפקיד קריטי בשמירה על בהירות העדשה ותפקודה על ידי ייצור רציף של סיבי העדשה לאורך כל החיים.

קטרקט מאופיין על ידי עכירות מתקדמת של העדשה, וכתוצאה מכך עיוות ופיזור של אור, המוביל ראייה לקויה ^3,4. המנגנונים המדויקים העומדים בבסיס היווצרות הקטרקט הם מורכבים ורב-גורמיים, וכוללים תהליכים תאיים ומולקולריים שונים כגון קרינת UV, נזקי חמצון וסכרור ^5,6. LECs נמצאו לתרום באופן משמעותי להתפתחות של קטרקט, מה שהופך אותם מוקד חיוני של מחקר 1,2,7,8,9.

יתר על כן, אחד הנושאים הדחופים ביותר ברפואת עיניים כיום הוא שכיחות גבוהה יחסית של opacification קפסולה אחורית (PCO), הידוע גם בשם קטרקט משני. PCO נותר הסיבוך השכיח ביותר לאחר ניתוח קטרקט, המשפיע על עד 20-40% מהמטופלים המבוגרים ו -100% מהילדים בתוך 5 שנים לאחר הניתוח¹⁰. PCO נגרמת בעיקר על ידי LECs שיורית שנותרו בשקית הקופסית לאחר מיצוי קטרקט. תאים אלה עוברים טרנספורמציה פתופיזיולוגית רבת פנים הכוללת לא רק מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) אלא גם התמיינות של LECs לסיבי עדשה, וכתוצאה מכך אוכלוסיית תאים שהיא תערובת של LECs, סיבים ומיופיברובלסטים 11,12,13. התאים שעברו טרנספורמציה מתרבים ונודדים על פני קפסולת העדשה האחורית, מה שמוביל לליקוי ראייה. הבנת ההתנהגות ומנגנוני הבקרה של LECs במודלים של תרבות יכולה לספק תובנות חשובות לגבי מניעה וניהול של PCO. לכן, פרוטוקול זה של טיפוח LECs מציג כלי חיוני לחוקרי עיניים שמטרתם ללמוד, להבין ובסופו של דבר להילחם בסיבוך נפוץ זה לאחר הניתוח.

כדי לפענח את המורכבויות של ביולוגיית LEC ואת תפקידה בהיווצרות קטרקט ו- PCO, חיוני להקים מערכות חזקות וניתנות לשחזור במבחנה של תרביות תאים ראשוניות. תרבית LEC ראשונית מספקת לחוקרים סביבה מבוקרת לחקר הפונקציות, האיתות והמאפיינים המולקולריים של LECs. יתר על כן, הוא מאפשר לחקור תהליכים תאיים ואת ההשפעות של תנאי ניסוי שונים, ומספק תובנות יקרות ערך על הפיזיולוגיה והפתולוגיה של העדשה.

מחקרים קודמים העשירו את הבנתנו של טכניקות תרבות LEC 14,15,16,17,18,19,20. למרות שמחקרים אלה השתמשו במתודולוגיות שונות והניבו ממצאים משמעותיים על התנהגות ומאפייני LEC, פרוטוקול הקלטת וידאו מקיף ונגיש לטיפוח LECs נעדר בספרות הנוכחית. מגבלה זו עלולה לעכב את יכולתם של חוקרים מתחילים לשחזר במדויק את הטכניקות ועלולה להוביל לחוסר עקביות ושינויים בתוצאות הניסוי. על ידי מתן פרוטוקול הקלטת וידאו, מאמר מחקר זה נועד לגשר על פער זה ולספק משאב סטנדרטי שיכול לשפר את יכולת השחזור ולהקל על העברת ידע בתחום תרבות LEC.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות האגודה לחקר הראייה והעיניים לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. אישור פרוצדורלי ניתן על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות באוניברסיטת צפון טקסס (מספר פרוטוקול: IACUC-2022-0008). עכברי C57BL/6J צעירים, בדרך כלל מתחת לגיל שבועיים, שימשו במחקרים אלה.

1. הכנת מדיום תרבית ודיסקציה של עדשה

1. הכן מדיום תרבית על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) ו 0.1 מ"ל של 50 מ"ג / מ"ל גנטמיצין ל 450 מ"ל של DMEM.
2. המתת חסד אנושית של עכברי C57BL/6J מתחת לגיל שבועיים.
   הערה: ביצענו המתת חסד בשיטת שאיפת_CO2 . קצב זרימה אופטימלי עבור מערכות המתת חסד CO₂ צריך להזיז 30% עד 70% מנפח התא או הכלוב לדקה.
3. הסירו בעדינות את העפעפיים באמצעות מספריים כירורגיים והפעילו לחץ עדין עם פינצטה מעוקלת משני הצדדים של ארובת העין, מה שגורם לעין לבלוט החוצה. בצעו חתך זהיר בקרנית באמצעות סכין הקטרקט וחלצו בזהירות את העדשה באמצעות פינצטה מעוקלת, כדי להבטיח שלא ייגרם נזק לעדשה או לקפסולה שלה.
   הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת ביצוע שלבים אלה כדי לשמור על שלמות כמוסת העדשה. בשל האופי העדין של העדשה, חשוב להשתמש בכלי ניתוח עם קצוות מעוקלים וקהים כדי למזער את הסיכון לנזק לעדשה.
4. השתמשו בפינצטה מעוקלת עם קצוות קהים כדי להעביר את העדשות לצלחת תרבית רקמת פלסטיק בקוטר 60 מ"מ המלאה בתמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) מחוממת מראש וסטרילית של Dulbecco המכילה 10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין.
5. שטפו בעדינות את העדשות בתמיסת DPBS המכילה 10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין כדי להסיר לכלוך או מזהמים פוטנציאליים, להכין את העדשות להמשך עיבוד ולשמור על סביבת תרבית סטרילית.
6. כדי לקבל מספר מספיק של LECs, אגרו ארבע עדשות עבור צלחת תרבית של 24 בארות ושש עדשות עבור צלחת תרבית של 6 בארות.

2. בידוד LECs

1. לאחר השלמת תהליך השטיפה, הניחו את העדשה על פיסת נייר פילטר ואפשרו לה להתייבש.
2. לאחר שהעדשה יבשה מספיק, העבירו אותה בזהירות לכיסוי של צלחת פטרי כהכנה להסרת קפסולת העדשה.
3. סובבו את העדשה כלפי מעלה, וודאו שהמקטע הקדמי פונה כלפי מעלה. בעת השימוש בפינצטה כדי להחזיק את הקפסולה הקדמית, השתמש במלקחיים capsulorhexis ביד הדומיננטית כדי ליצור קרע קטן בכמוסה. משוך בעדינות את שני הכלים בכיוונים מנוגדים כדי להסיר את הקפסולה והכנס אותה ל- DPBS עד להשלמת כל נתיחות העדשה.
   הערה: כדי למנוע אי התאמות, החוקרים צריכים לנתח מיד כל כמוסת אפיתל עדשה ולאחסן אותם באופן זמני ב- DPBS. רק לאחר השלמת כל הדיסקציות מועברות הכמוסות באופן קולקטיבי לטריפסין הנשמר בטמפרטורה של 37°C, מה שמבטיח חשיפה מסונכרנת ואחידה.
4. מעבירים בזהירות את קפסולת העדשה לצלחת בעלת 6 בארות. הוסף 1 מ"ל של תמיסת טריפסין 0.05% לכל באר כדי להתחיל את תהליך העיכול האנזימטי.
5. בעדינות לעורר את תמיסת הטריפסין כדי להבטיח חלחול אחיד. מניחים את הצלחת באינקובטור תרבית תאים ומניחים לקפסולה להתעכל במשך 8-10 דקות בטמפרטורה של 37°C.
   הערה: שלב זה מקל על פירוק רקמת כמוסת העדשה ושחרור לאחר מכן של תאי אפיתל בודדים.
6. לאחר הדגירה, טחנו בזהירות את קפסולת העדשה המעוכלת באמצעות מספריים מנתחים כדי לפרק את גושי הרקמה שנותרו ולקדם את הפרדת התאים.
   הערה: מודגשת יסודיות בטחינת רקמות כדי להבטיח שחרור תאים יעיל מקפסולות העדשה המעוכלת.
7. הוסף 0.5 מ"ל של מדיום התרבית המכיל 10% FBS כדי להרוות את טריפסין. מעבירים את דגימות הרקמה לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות.
8. הסר בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא. השתמש 1 מ"ל של מדיום תרבית כדי להשעות מחדש את התאים ולזרוע את התאים בצלחת 24 בארות.
9. שנה את מדיום התרבות כל 2-3 ימים.

3. תת-תרבות LECs

1. ברגע שהתאים מגיעים למפגש, מוציאים את המדיום מצלחת התרבית. המשך לשטוף את התאים 2x עם 1 מ"ל של DPBS.
2. הוסף 200 μL של תמיסת טריפסין-EDTA ומקם את התאים באינקובטור למשך 5 דקות.
3. לאחר הדגירה, מוציאים את התאים מהאינקובטור ובודקים אותם תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהם התנתקו מצלחת התרבית והחלו לצוף.
4. מוסיפים 1 מ"ל מדיום תרבית ומפיפטים בעדינות את התאים פי 3-5 כדי לנתק את כל התאים.
5. מעבירים את התאים לצינורות צנטריפוגות וצנטריפוגות ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות.
6. בזהירות להסיר את supernatant ו resuspend את התאים במדיום הצמיחה המלא.
7. במידת הצורך, ספור את מספר התא באמצעות המוציטומטר.
8. חלק את תרחיף התא ביחס של 1:2 או 1:3 למטרות תת-תרבית.
9. כאשר התרבות הופכת שוב למשתלבת, חזור על ההליכים הנ"ל.
   הערה: LECs פורחים בתנאי תרבות בצפיפות גבוהה. הימנע דילול יתר על המידה את התאים, כמו זה עלול לעכב את הצמיחה שלהם.

4. אחסון ומשלוח

הערה: מספר התא האידיאלי לאחסון הוא ~ 1 × 10⁶.

1. ביסודיות לשטוף את התאים 3x עם 1 מ"ל של DPBS. לאחר שטיפה, להוסיף 1 מ"ל של פתרון trypsin-EDTA ומניחים את התאים באינקובטור במשך 5 דקות.
2. מוסיפים 2 מ"ל של מדיום תרבית שלם ומעבירים את מתלה התא לצינור הצנטריפוגה ולצנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות.
3. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים בתווך הקפאה המורכב מ-90% FBS ו-10% DMSO, במטרה להגיע לצפיפות תאים של 1 × 10⁶ תאים/מ"ל. העבר את תרחיף התא לקריוביאל.
4. העבירו מיד את התאים לסביבה של -20°C למשך שעה אחת, ולאחר מכן 80°C למשך הלילה, לפני אחסון קבוע בחנקן נוזלי.
   הערה: אם חנקן נוזלי אינו זמין, ניתן לאחסן את התאים ב -80 °C לאחר שעה ראשונית ב -20 °C.
5. אם נדרש משלוח, שלח את התאים בהקפאה בחבילה עם קרח יבש למשלוח בן לילה.
6. עם קבלת התאים יש להבטיח החלמה מהירה ולמקם את התאים בתת-תרבית. אם תרבית מיידית אינה אפשרית, העבירו את התאים לחנקן נוזלי לאחסון ממושך.
   הערה: אם רוצים לשלוח את התאים, ודא שהדגימות קבורות עמוק בקרח היבש כדי למנוע נזק פוטנציאלי מתנודות טמפרטורה.

5. אימות LECs

1. לוחים את ה-LEC לצלחות תרבית בקוטר 35 מ"מ עם כוסות כיסוי ומזנקים אותן בתרבית במשך כ-48 שעות.
2. לשטוף את התאים 2x עם PBS ולתקן את התאים עם מתנול קר במשך 10 דקות ב -20 ° C.
3. שטפו את התאים הקבועים במשך 3 x 5 דקות עם PBS ודגרו על התאים הקבועים עם מאגר חוסם למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי למנוע קשירה לא ספציפית.
4. לאחר החסימה, יש לדגור על התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C כאשר הנוגדנים הראשוניים (αA-crystallin, γ-crystallin ו-PROX1) מדוללים בנפרד ביחס של 1:50 במאגר מדלל.
5. לשטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם PBS ולדגור את התאים עם נוגדן משני מדולל 1:100 בחיץ מדלל במשך 1 שעות.
6. שטפו את התאים במשך 3 x 5 דקות עם PBS והכתימו את התאים עם 5 מיקרוגרם / מ"ל Hoechst 33342 ב- PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לדמיין את הגרעינים.
7. שטפו את התאים במשך 2 x 5 דקות עם PBS כדי להסיר תמיסת כתמים עודפת וללכוד תמונות פלואורסצנטיות של התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות ערוץ DAPI עבור גרעינים וערוץ FITC עבור αA, γ-crystallins ו-PROX1.

תוצאות

כפי שניתן לראות באיור 2, על-ידי ביצוע פרוטוקול זה, LECs ראשוניים מעכברי C57BL/6J נצמדו לצלחות בתוך פרק זמן של 4 שעות. יש לציין כי נמצאו שרידים גלויים של רקמות אחרות כגון חלקים של הקפסולה האחורית ותאי סיבי העדשה. עם זאת, אלמנטים לא מכוונים אלה לא נצמדו למנה ולכן ניתן היה להסיר אותם על ידי שינוי מדיום התרבות. לאחר מכן, בין היום השלישי לחמישי, החלו ה-LECs בשלב ההתפשטות שלהם. צמיחה מהירה, האופיינית לשלב ההתפשטות הלוגריתמית, ניתן היה לראות בין היום השביעי ליום העשירי. במקרים בהם התאים אינם מתקדמים לשלב הגדילה המהירה, מומלץ לשלב תוספי גדילה, כגון EpiCGS-a, במדיום התרבית. יתר על כן, ראינו כי תאים מפגינים קצב צמיחה מהיר יותר בתווך המכיל 20% FBS לעומת 10% FBS. ריכוז FBS נמוך יותר בדרך כלל מטפח צמיחה איטית יותר, המשקפת את התכונות של האפיתל המרכזי של העדשה, בעוד ריכוז FBS של 20% משכפל את התכונות של אזור ההתרבות של העדשה.

לדברי רדי ואחרים ואנדלי ואחרים, שפיתחו את קו תאי האפיתל של העדשה האנושית האימורטלית B3, צפוי כי LECs צריכים לבטא חלבונים ספציפיים שונים לעדשה כגון αA ו- γ-crystallins ^2,21. לכן, במחקר זה, השתמשנו αA ו γ-גבישים כסמנים תאיים כדי לאמת את הזהות של התאים כמו LECs. LECs בשלושת המעברים הראשונים תורבתו על כיסויי זכוכית. הנוגדנים העיקריים הספציפיים ל-αA ול-γ-crystallins שימשו לדגירת התאים במהלך הלילה. כפי שניתן לראות באיור 3, התאים האלה הפגינו ביטוי חזק של גבישי αA ו-γ, מה שסיפק ראיות חד-משמעיות לכך שהם תאי אפיתל שמקורם בעדשה. בנוסף, השתמשנו ב-PROX1 כסמן מבוסס היטב עבור תאי סיבים כדי לסמן את ה-LECs העיקריים. הנתונים הצביעו על כך שתאי LEC אלה הראו צביעה שלילית עבור PROX1, מה שמאשר כי תאים אלה הם תאי אפיתל ועדיין לא עברו התמיינות לתאי סיבים.

איור 1: זרימת עבודה שלב אחר שלב עבור תרבות LEC. האיור מתאר את השלבים העוקבים המעורבים בתרבית של תאי אפיתל עדשה ראשוניים. שלב 1 כרוך ביצירת קרע קטן בקפסולה הקדמית. שלב 2 כרוך בהסרה עדינה של קפסולת העדשה. בשלב 3, קפסולת העדשה מועברת בזהירות לצלחת בעלת 24 בארות ומודגרת עם תמיסת טריפסין 0.05% בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, כמוסת העדשה המעוכלת נטחנת באמצעות מספריים מנתחים כדי לקדם את הפרדת התאים. שלב 4 כולל הרוויה של הטריפסין על ידי הוספת 0.5 מ"ל של מדיום תרבית המכיל 20% FBS לצינור הצנטריפוגה וצנטריפוגה של דגימות הרקמה ב -1,000 × גרם למשך 5 דקות. שלב 5 דורש השעיה מחדש של התאים ב 1 מ"ל של מדיום תרבית וזריעתם בצלחת של 24 בארות. לבסוף, שלב 6 כולל שינוי אמצעי התרבית כל 2-3 ימים כדי לתמוך בצמיחת התאים ותחזוקתם לאורך כל הניסוי. קיצורים: LECs = תאי אפיתל עדשה; FBS = נסיוב בקר עוברי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דפוס הצמיחה של LECs לאורך זמן. השינויים המורפולוגיים של תאי אפיתל ראשוניים בעדשה בנקודות זמן שונות במהלך גדילתם תועדו במיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה. התמונות שצולמו בימים 1, 2, 3, 5, 7 ו-10 מתארות את המורפולוגיה המתפתחת של התא, ומספקות תובנה לגבי התפתחותם והתנהגותם של תאי אפיתל עדשה לאורך זמן. חץ אדום המציין את מיקומם של תאי אפיתל עדשה המתרבים באופן פעיל. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצור: LECs = תאי אפיתל עדשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: אימות של LECs. (A) צביעה חיסונית של αA-crystallin ב-LECs של עכברים. mLECs ראשוניים הוכתמו בנוגדן Hoechst 33342 (כחול) ונוגדן αA-crystallin (ירוק). (B) צביעה חיסונית של γ-קריסטלין ב-LECs של עכברים. (C) אימונוסטיין של PROX1 ב-LECs של עכברים. mLECs ראשוניים הוכתמו בנוגדן Hoechst 33342 (כחול) ונוגדן PROX1 (ירוק). פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצור: LECs = תאי אפיתל עדשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

הפרוטוקול המוצג במאמר זה מספק מדריך מקיף, שלב אחר שלב, לבידוד, תרבות ותת-תרבות מוצלחים של LECs ראשוניים, יחד עם תיעוד וידאו נלווה. המדריך החזותי המפורט לצד ההוראות הכתובות משפר את הבהירות והנגישות של הפרוטוקול, ומקדם את השימוש בו ואת יכולת השחזור שלו בקרב חוקרים בתחום. המטרה הסופית היא לתרום לגוף הידע המתרחב סביב תפקידם של LECs בהיווצרות קטרקט ו- PCO, סיבוך שכיח לאחר ניתוח קטרקט.

כאשר משווים LECs ראשוניים עם קווי תאי אפיתל עדשה, כגון HLE-B3 ו- SRA01/04, כל אחד מהם מציג יתרונות ואתגרים ייחודיים בהקשר מחקרי. קו התאים HLE-B3, יחד עם SRA01/04, מייצגים קטגוריה של קווי תאים, שלמרות היותם קלים לטיפול ועמידים, לעתים קרובות מציגים שינויים גנטיים ופנוטיפיים עקב שכפול מתמשך שלהם ותנאי תרבית ממושכים. זה יכול להוביל להבדלים משמעותיים מהפונקציה של LECs המקורי, ובכך להפחית את האותנטיות של התגובות שלהם. לעומת זאת, LECs ראשוניים, המבודדים ישירות מרקמה חיה מחולים או חיות מחקר, משקפים בצורה מדויקת יותר את הסביבה התאית הטבעית ואת התגובות הטבועות של העדשה in vivo. למרות המורכבות הנוספת של המיצוי והתרבות שלהם, הם מועדפים לעתים קרובות במחקרים הדורשים רלוונטיות פיזיולוגית גבוהה, שכן הם מספקים תוצאות מדויקות ואמינות יותר.

יש לקחת בחשבון כמה נקודות מפתח בעת ביצוע פרוטוקול זה. עכברי C57BL/6J צעירים, בדרך כלל מתחת לגיל שבועיים, שימשו במחקרים אלה. ראינו כי LECs שנקצרו מעכברים צעירים אלה הפגינו צמיחה נמרצת יותר בהשוואה ל-LECs מעכברים בני חודשיים ומעלה. זה מצביע על מתאם שלילי בין גיל העכברים לבין גדילת תאים.

נתיחת העדשה מעין עכבר היא משימה עדינה, המחייבת שימוש זהיר בכלי ניתוח לשמירה על שלמות העדשה והקפסולה שלה. ההליך המתואר בסעיף 1 של הפרוטוקול מבטיח שהעדשה תחולץ בהצלחה עם נזק מינימלי. בעוד ששמירה על הבריאות והשלמות של קפסולת העדשה היא מאתגרת, לא ניתן להמעיט בחשיבותה מכיוון שכל נזק עלול להשפיע על האיכות והכמות של LECs מבודדים. ראוי לציין כי רוב חלוקות התאים מתרחשות בדרך כלל באזור הנביטה ליד האזור המשווני בעדשה, אזור שאינו נגיש בקלות לתרבית. לדברי Zetterberg et al., למרות שהחלק המרכזי של אפיתל העדשה מציג פעילות מיטוטית מינימלית בנסיבות רגילות, ניסויים המשתמשים בתיוג תימידין משולש (³H-Tdr) סימנו את תאי אפיתל העדשה במיקום מרכזי אלה כתאי גזע פוטנציאליים^17,22. תאי גזע מפגינים מאפיינים ברורים, כגון יכולת התפשטות בלתי מוגבלת למרות קצב התרבות נמוך בתנאים סטנדרטיים. ככזה, החלק המרכזי של אפיתל העדשה עשוי לספק ייצוג טוב יותר של יכולת ההתרבות של LECs מאשר אזור הנבט.

בידוד ה-LECs, כמפורט בסעיף 2 לפרוטוקול, מהווה צעד מכריע בהליך ניסיוני זה. פעולות אינטגרליות הכוללות הסרת כמוסת העדשה, עיכול אנזימטי ופיצול רקמות מבוצעות בקפידה כדי להפריד תאי אפיתל בודדים מהקפסולה. אחד המרכיבים הקריטיים בתהליך זה הוא משך העיכול של טריפסין. מומלץ להגדיר את תקופת העיכול בין 8 ל 10 דקות. אם פרק זמן זה מתקצר לפחות מ-5 דקות, הדבר עלול לגרום להפרדת תאים חלקית. לעומת זאת, הארכת יתר של מסגרת זמן זו עלולה לפגוע באופן משמעותי בכדאיות התא. הבחירה האסטרטגית של שימוש בטריפסין-EDTA כמגיב דיסוציאציה של תאים, בשילוב עם מדיום תרבית DMEM בתוספת 20% FBS ו-10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, מייעלת את שחרור התאים ואת התפשטות התאים לאחר מכן תוך הפחתת סיכוני זיהום פוטנציאליים.

אנטיביוטיקה משמשת לעתים קרובות כדי למנוע זיהום חיידקי במהלך תרביות LEC ראשוניות. עם זאת, הבחירה של אנטיביוטיקה צריך להיעשות בזהירות. אנטיביוטיקה נפוצה כגון פניצילין וסטרפטומיצין, כמו גם סוכנים אנטי פטרייתיים, יש פוטנציאל להשפיע על הכדאיות של LECs. כחלופה, מומלץ להשתמש בתמיסת גנטמיצין בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל לגידול LEC אופטימלי.

יתר על כן, שמירה על צפיפות תאים גבוהה היא גורם מכריע נוסף להצלחת תרבית LEC ראשונית. שלא כמו קווי תאים מבוססים, LECs ראשוניים זקוקים לצפיפות תאים גבוהה יותר לצמיחה אופטימלית. זאת בעיקר בשל הסתמכותם על תקשורת בין-תאית יעילה, המתאפשרת על ידי מגע ישיר או איתות פרקריני, המסייע לשמור על מצב ההבחנה והתפקוד שלהם. צפיפות תאים גבוהה גם ממתנת את ההשפעות השליליות של "הלם תרבית", מצב שחווים תאים ראשוניים כאשר הם מבודדים ומוכנסים לסביבה במבחנה שונה באופן משמעותי ממקורם in vivo ²³. על ידי חיקוי סביבה דמוית in vivo, צפיפות תאים גבוהה מגדילה את שיעורי ההישרדות. בנוסף, צפיפות זו מסייעת לבסס שיפוע ריכוז של גורמי גדילה וציטוקינים התומך בגדילה ובתפקוד של תאים. בהתחשב בכך שתאים ראשוניים רבים תלויים בעגינה, ודורשים היצמדות לפני השטח לצורך התפשטות, צפיפות תאים גבוהה מציעה מספר מספיק של תאים שכנים להידבקות, ובכך מקדמת צמיחה בריאה. כתוצאה מכך, ויסות צפיפות התאים הוא שיקול מכריע בגידול תאים ראשוניים בשל השפעתו המשמעותית על תקשורת התא, הישרדותו והתפשטותו. מומלץ לבחור במנות תרבות קטנות יותר, כגון צלחות 24 או 6 בארות, כדי ליצור סביבה אידיאלית עבור LECs. ביצוע פרוטוקול זה בדרך כלל גורם LECs להגיע למצב מפגש ~ 10-14 ימים לאחר הטיפוח. אנו ממליצים להשתמש ב-LECs במספר נמוך של מעברים, באופן אידיאלי בין P0 ל-P6, כדי להבטיח את ההתנהגות הטבעית ביותר בניסויים. מעבר ל-7-10 מעברים, LECs עשויים להציג צמיחה מופחתת ועשויים שלא להגיב לתנאי ניסוי באותו אופן כמו תאים במעברים נמוכים יותר.

ריכוז הסרום קשור ישירות לקצב צמיחת התאים. רמות נמוכות יותר של FBS נוטות יותר לגרום לצמיחה איטית יותר, בדומה למאפיינים של האפיתל המרכזי. לעומת זאת, רמות FBS גבוהות יותר מחקות את התנאים של אזור ההתפשטות. אם צמיחת התאים איטית, כפי שעלול להתרחש כאשר LECs צריך להיות מבודד מבעלי חיים מבוגרים או מהונדסים גנטית, זה עשוי להיות מועיל להגדיל FBS ל 20% או להוסיף תוסף גדילה כמו EpiCGS-a (5 מ"ל, ראה טבלה של חומרים) למדיום התרבית. העשרת הסרום והתוספים יכולה להגביר את התרבות התאים ולקדם צמיחה אופטימלית של תאי אפיתל.

פרוטוקול האחסון והמשלוח (פרוטוקול סעיף 5) בוחן את האתגרים הקשורים לשימור והובלה של תאים חיים. הבחירה באמצעי הקפאה היא קריטית להישרדותם של LECs במהלך אחסון והובלה. התנסינו במדיומים שונים של הקפאה, כולל 70% מדיום תרבית שלם + 20% FBS + 10% DMSO; 90% FBS + 10% DMSO; ומדיום הקפאה ללא DMSO וסרום. ראיות מהניסויים שלנו מצביעות על כך שתמיסה הכוללת 10% DMSO ו-90% FBS מפגינה ביצועים מעולים בשימור כדאיות התא. תוך שימוש בנוסחה ספציפית זו, שמרנו בהצלחה על LECs ראשוניים באחסון בטמפרטורה של -80°C למשך פרקי זמן העולים על 10 שנים, מה שמדגים את החוסן של גישה זו ואת יכולתה להקל על תחיית תאים לאחר אחסון.

αA-crystallin ו-γ-crystallin שימשו כסמנים עבור LECs. PROX1 שימש כסמן לתאי סיבי עדשה. סמנים נוספים כגון PAX6, FOXE3 ו- E-cadherin עשויים לשמש גם כדי לאפיין את פנוטיפ LEC. אם חוקרים מעוניינים לחקור EMT, αSMA צריך לשמש כסמן. חיוני להתאים את זמני הדגירה והדילולים בהתאם לדרישות הספציפיות של הניסוי ולהמלצות שניתנו עבור הנוגדנים המתאימים המנוצלים.

בעוד מחקר זה מציג מתודולוגיה חזקה לטיפוח LECs ראשוניים, חשוב להכיר במגבלותיה. בעוד התאים שבודדו בתחילה הם LECs ראשוניים, כל הליכי תת-תרבית, טריפסיניזציה והנפשה מחדש יובילו לשינויים במצבם. הפרוטוקול שעיצבנו משתמש בעיקר בעדשת עכבר כמקור ל-LEC; עם זאת, LECs יכול גם להיות בתרבית ממשאבים אחרים, כולל דגימות חולה קטרקט, עיני בנק העין, או חולים עם מחלות עיניים שונות כולל גלאוקומה רטינופתיה סוכרתית^17,24. LECs שנקצרו מאנשים מבוגרים או אלה עם בעיות עיניים ספציפיות עשויים שלא לעמוד בפרוטוקול באותה יעילות כמו תאים מעמיתים צעירים ובריאים יותר. גידול LECs מאנשים מבוגרים או מהונדסים גנטית או בעלי חיים עשוי לדרוש אופטימיזציה של מדיום התרבות, פוטנציאלית על ידי הגדלת FBS ל -20% או שילוב גורמי גדילה נוספים. בנוסף, מחקרים קודמים של מנקו ואחרים, שנערכו על תרביות תאי אפיתל ראשוניים של עדשת אפרוח עוברית, הדגימו התמיינות ספונטנית המתרחשת לאחר היום השני לתרבית²⁵. לכן, על החוקרים לנקוט משנה זהירות ולשקול את ההבדלים במתודולוגיות, במיוחד אם חקר הבידול הוא מטרת המחקר העיקרית שלהם.

ניתן להשתמש בשיטות שונות לתרבית LECs ראשוניים. לדוגמה, שיטות שפותחו על ידי Ibaraki et al., Sundelin et al., ו- Andjelic et al., כוללות גידול LECs ראשוניים ישירות על צלחת פטרי באמצעות החלק הקדמי של קפסולת העדשה שנאסף במהלך ניתוח קטרקט 16,17,19,20. גישה זו שומרת על מגעים טבעיים בין תאים ועל המטריצה החוץ תאית, ומספקת רלוונטיות פיזיולוגית גבוהה החיונית למצבים כמו PCO. לחילופין, שיטת עציץ העדשה, כפי שהותוותה על ידי Zelenka et al. משמרת את ארכיטקטורת הרקמה המקורית, ומאפשרת מחקרים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית, מועילים במיוחד לחקר ההתמיינות הסופית של LECs, אינטראקציות תאיות ותהליכי התפתחות עדשות, ומעניקים הבנה מפורטת של אירועים תאיים ומולקולריים רציפים במהלך התמיינות²⁶.

לעומת זאת, שיטת הטריפסיניזציה המתוארת בפרוטוקול זה מייצרת תרחיף אחיד של תא בודד, המפשט זריעה אחידה וספירת תאים מדויקת, דבר המהווה יתרון לניסויים מסוימים כגון בדיקות כדאיות ושגשוג תאים, סינון תרופות וניתוח מסלולי איתות תאי. עם זאת, חשוב להכיר בכך שבעוד ששיטה זו מאפשרת מחקרים מבוקרים ומדויקים בשל אוכלוסיית התאים האחידה שלה, היא עלולה לשנות את ההתנהגות התאית ולפגוע ברלוונטיות הפיזיולוגית הנראית בשיטות האקספלנט והתרבית הישירה עקב עיבוד אנזימטי. עבור חוקרים המתמקדים אך ורק בחקר תאי אפיתל, שיטה זו הוכחה כישימה ונוחה ביותר, ומציעה תובנות אמינות לגבי המאפיינים וההתנהגויות של תאים אלה. עם זאת, עבור אלה אשר חקירות מדעיות להרחיב התמיינות תאית, זה הופך להיות חיוני כדי לשקול שיטות חלופיות כגון טכניקות explants, או להתאים ולייעל את הנוכחי כדי להקיף היבטים אלה.

בסך הכל, פרוטוקול זה תוכנן תוך התחשבות זהירה בצרכים ובדרישות הספציפיות של LECs. כל שלב, החל מדיסקציה ועד אימות, מתוכנן בקפידה כדי לשמור על הכדאיות והפונקציונליות של התאים. כתוצאה מכך, זה יכול להיות מדריך רב ערך עבור חוקרים החוקרים LECs ואת תפקידם בפיזיולוגיה ופתולוגיה של העין. מחקרים עתידיים יכולים להתאים ולשנות פרוטוקול זה כדי לחקור היבטים שונים של ביולוגיה LEC, מתן פלטפורמה להתקדמות נוספת בהבנה של מחלות הקשורות לעדשות ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות למניעת קטרקט ו- PCO.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.05% טריפסין-EDTA	תרמו פישר	#25300054	לדיסוציאציה של LECs
Alexa Fluor 488 נוגדן משני	Jackson ImmunoResearch	#715-545-150	לאימות תאים
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-605-003	לאימות תאים
מאגר דילול נוגדנים	Licor	#927-60001	לאימות תאים
סכין בטיחות	Beaver-Visitec International	#3782235	לדיסקציה
של עדשותחסימת חיץ	Licor	#927-60001	לאימות תאים
מלקחיים Capsulorhexis	Titan Medical Instruments	TMF-124	לבידוד קפסולת עדשות
DMEM	Sigma Aldrich	D6429	למדיום תרבית LECs
DMSO	Sigma Aldrich	#D2650	להכנת מדיום הקפאה
תמיסת מלח פוספט בופר של Dulbecco	תרמו פישר	#J67802	לדיסקציה של עדשות
פינצטה דומונט	מכשיר כירורגי Roboz	RS-4976	לבידוד קפסולת עדשות
EpiCGS-a (אופציונלי)	ScienCell	4182	למדיום תרבית LECs
FBS	Sigma Aldrich	F2442	למדיום תרבית LECs
ג'נטמיצין (50  מ"ג / מ"ל)	Sigma-Aldrich	G1397	עבור מדיום תרבית LECs
תמיסת Hoechst 33342	תרמו פישר	#62249	לאימות תאים
מספריים מיקרו ניתוח	מכשיר כירורגי Roboz	RS-5983	לדיסקציה של עדשות
פינצטה מיקרו ניתוח	מכשיר כירורגי Roboz	RS5137	לדיסקציה של עדשות
נוגדן PROX1	Thermo Fisher	11067-2-AP	לאימות תאים
Vannas מספריים קפיציים מיקרו-ניתוחי	Roboz מכשיר כירורגי	RS-5608	לבידוד קפסולת עדשות
ואלפא; נוגדן א-קריסטלין	סנטה קרוז	sc-28306	לאימות תאים
γ-נוגדן גבישי	סנטה קרוז	sc-365256	לאימות תאים