הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

לכידת תסיסה מבוססת שלד של גרעין ביצית העכבר על פני קני מידה מרחביים

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65976

⸱

12 בינואר 2024

 ,  ,  , 
1Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Collège de France, CNRS, INSERM, Université PSL, 2Department of Developmental and Stem Cell Biology, Institut Pasteur, Université de Paris Cité, CNRS, 3Centre for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתיעוד ההשפעה הפיזית של השלד הציטו-שלד על הצורה הגרעינית ועל האברונים חסרי הקרום הפנימי במערכת הביציות של העכבר. ניתן להתאים את המסגרת לשימוש בסוגי תאים ובהקשרים אחרים.

תקציר

אתגר מרכזי בהבנת הגורמים לאי פוריות נשית הוא להבהיר מנגנונים השולטים בהתפתחות תאי נבט נקביים, הנקראים ביציות. התפתחותם מסומנת על ידי צמיחת תאים וחטיבות עוקבות, שני שלבים קריטיים המכינים את הביצית לאיחוי עם הזרע כדי ליזום אמבריוגנזה. במהלך הגדילה, הביציות מארגנות מחדש את הציטופלסמה שלהן כדי למקם את הגרעין במרכז התא, אירוע המנבא התפתחות מוצלחת של ביציות בעכברים ובבני אדם, ובכך את הפוטנציאל האמבריוגני שלהן. בביציות עכבר, ארגון מחדש ציטופלזמי זה הוכח כמונע על ידי השלד הציטופלזמה, שפעילותו יוצרת כוחות מכניים המתסיסים, ממקמים מחדש וחודרים לגרעין. כתוצאה מכך, העברת כוח ציטופלזמית לנוקלאופלזמית זו מכווננת את הדינמיקה של אברוני עיבוד RNA גרעיניים הידועים כמעבים ביומולקולריים. פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתעד, ברזולוציה טמפורלית גבוהה, את השפעת השלד על הגרעין על פני קני מידה מרחביים בביציות עכבר. הוא מפרט את שלבי ההדמיה וניתוח התמונה והכלים הדרושים כדי להעריך א) פעילות ציטו-שלד בציטופלסמה של הביצית, ii) תסיסה מבוססת שלד של גרעין הביצית, ו-iii) השפעותיה על דינמיקת עיבוי ביומולקולרית בנוקלאופלזמה של הביצית. מעבר לביולוגיה של הביציות, ניתן להתאים את השיטות המתוארות כאן לשימוש בתאים סומטיים כדי לטפל באופן דומה בכוונון מבוסס שלד של דינמיקה גרעינית על פני קני מידה.

מבוא

מיקום גרעיני חיוני עבור פונקציות תאיות והתפתחותיות מרובות 1,2,3,4,5. תאי נבט נקביים של יונקים בשם ביציות מעצבים מחדש את הציטופלסמה שלהם כדי למקם את הגרעין במרכז התא למרות שהם עוברים חלוקה אסימטרית בגודל, אשר מסתמכת על כרומוזום עוקב מחוץ למרכז6 (איור 1). מרכוז זה של הגרעין מנבא התפתחות ביציות מוצלחת בעכברים ובבני אדם 7,8, ולפיכך את הפוטנציאל האמבריוגני שלהן (איור 1).

עיצוב מחדש ציטופלזמי בביציות עכבר מונע בעיקר על-ידי שלד ציטומיוזין9 (איור 2). פעילותו מייצרת כוחות מכניים שמתסיסים, ממקמים מחדש וחודרים לגרעין10 (איור 2). כתוצאה מכך, העברת הכוח הציטופלזמי לנוקלאופלזמי הזה מכווננת את הדינמיקה של אברוני עיבוד רנ"א שליח גרעיני שנקראים גרעיניכתמים 11, אחד מכמה אברונים חסרי קרום בגרעין שידועים כמעבים ביומולקולריים 12,13,14,15,16 (איור 2).

הדמיה חיה הייתה מכרעת בפענוח ההשלכות התפקודיות של תסיסה גרעינית. סרטים של הגירה גרעינית לאורך שעות, כמו גם סרטים ברזולוציה טמפורלית גבוהה של רשת האקטין והציטופלזמה בתפזורת, תרמו במידה רבה להרחבת מודל תיאורטי למיקום גרעיני, המקשר בין טווחי זמן שונים9. כמו כן, סרטים ברזולוציה טמפורלית גבוהה של הציטופלסמה, קווי המתאר הגרעיניים ורכיבים גרעיניים כגון כרומטין ועיבוי גרעיני, הדגישו את התפקיד של תסיסה מבוססת שלד של הגרעין על עיבוד RNA וביטוי גנים בביציות עכבר, גישור על קני מידה מרחביים-זמניים שונים בתוך התא10,11. בסך הכל, גישה כזו של חציית קנה מידה המבוססת על הדמיה חיה סיפקה את הרציונל הראשון הקושר בין תסיסה ציטו-שלדית של הגרעין להצלחה התפתחותית של ביציות.

הפרוטוקול מספק את צינור ההדמיה וניתוח התמונה המשמש לחקר העברת כוחות ציטופלזמיים (הנוצרים בעיקר על ידי F-אקטין ובחלקם על ידי מיקרוטובולים) לגרעין ולמרכיביו הפנימיים בביציות עכבר. התוצאה של ניסויים אלה היא ללכוד את רצף הכוחות על פני קני מידה מרחביים, מהשלד הציטופלזמה בציטופלסמה ועד לפנים הגרעין באמצעות סרטים ברזולוציה טמפורלית גבוהה כפי שמוצג בשני מחקרים עדכניים10,11, שביססו את הקשר בין תנועות פעילות ציטופלזמיות, תנודות של קווי המתאר הגרעיניים, כמו גם תנועה ותנודות פני השטח של סוג יחיד של עיבוי ביומולקולרי גרעיני: כתמים גרעיניים. גישה דומה עשויה להיות מיושמת במערכות מודל אחרות שבהן כוחות ציטופלזמיים צפויים להשתנות, כגון בהקשר של תאים סרטניים ממאירים17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הקהילה האירופית ואושרו על ידי משרד החקלאות הצרפתי (אישור מס' 75-1170) ועל ידי Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; הסכם GMO מספר DUO-5291). עכברים שוכנו במתקן בעלי החיים במחזור אור / חושך של 12 שעות, עם טמפרטורת סביבה של 22-24 מעלות צלזיוס ולחות של 40%-50%. עכברים המשמשים כאן כוללים נקבה OF1 (Oncins France 1, 8 עד 12 שבועות) ונקבה C57BL/6 (10 עד 14 שבועות).

1. איסוף ביציות והכנתן

  1. אספו ביציות מעכברים בני 8 עד 14 שבועות כמתוארב-18 וב-19.
    1. בקצרה, יש לחלץ תחילה שחלות מעכברים כמוב-18 לאלבומין מחומם מראש (37°C) M2+Bovine Serum Albumin (BSA) עם תוספת של 1 מיקרומטר Milrinone19, המונע את חידוש המיוזה בביציות.
    2. נקב זקיקי שחלות עם מחטים כירורגיות כדי לשחרר ביציות גדלות מזקיקים אנטראליים (סוף צמיחת ביציות20).
    3. אספו ביציות בגודל הדרוש לניסויים (גידול ו/או גידול מלא של ביציות) עם מיקרופיפטה המתמחה באיסוף ביציות, לפני שטיפה ומעבר לכלים עם מדיום טרי תחת שמן מינרלי.
  2. נתקו באופן מכני ביציות מתאי זקיקים אנטראליים על ידי פיפטציה למעלה ולמטה והשאירו לייצב למשך שעה אחת באינקובטור ב -37 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך בשלבי הניסוי הבאים.
    הערה: הביציות נשמרות בטמפרטורה של 37°C במהלך כל שלבי הניסוי. עבור פרוטוקול זה, הביציות הגדולות ביותר, שהן אלה שגדלו במלואן, נאספו.

2. מיקרו-הזרקת ביציות

הערה: כדי ללכוד פעילות מבוססת שלד בציטופלסמה, נעשה שימוש בהדמיה חיה של brightfield. לכן אין צורך במיקרו-הזרקה של סמנים פלואורסצנטיים, וניתן לחדש את הפרוטוקול בשלב 3. כדי לצלם את המתווה הגרעיני נעשה שימוש ברנגו (Rango), גשושית המציגה תג YFP במסוף N שלה ותג CFP במסוף C21,22. כאשר הוא מצולם בביציות ב-488 ננומטר, הוא מסמן את הגרעין כולו, למעט גרעין23, ומציג מתאר גרעיני חד מאוד. כדי להמחיש כתמים גרעיניים, נעשה שימוש ב-SRSF2-GFP (NM_011358), סמן של כתמים גרעיניים11. אותו מדיום משמש לאיסוף ביציות, מיקרו-הזרקה, תרגום RNA משלים והדמיית תאים חיים.

  1. פלסמיד רנגו ליניארי עם SfiI או פלסמיד SRSF2-GFP עם אנזימי הגבלת AgeI.
  2. סינתטי RNA משלים (cRNA) עם ערכת השעתוק החוץ-גופית המתאימה בהתאם למקדם (T3 עבור Rango ו-T7 עבור SRSF2-GFP) וטיהר אותם באמצעות ערכת טיהור עמודות, כפי שתואר קודם לכן24.
    הערה: Polyadenylate SRSF2-GFP RNA באמצעות ערכת polyadenylation כדי להגביר את יציבות cRNA. שני מקדמים שונים משמשים בשל הבדלים בעמוד השדרה פלסמיד.
  3. מדידת ריכוזי cRNA באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
  4. לדלל את Rango cRNA ל-1000 ng/μL ואת SRSF2-GFP cRNA ל-600 ng/μL ב-dH2O.
  5. צנטריפוגה cRNA aliquot ב 4 ° C לפחות 60 דקות ב 25,000 x גרם לפני מיקרו הזרקה.
  6. הזריקו cRNAs המקודדים עבור YFP-Rango או SRSF2-GFP כמתוארב-11,25 לתוך הציטופלסמה של הביציות בתווך M2+ BSA + Milrinone בטמפרטורה של 37°C באמצעות מיקרו-מזרק.
  7. לדגור על ביציות במשך שעתיים לפחות בתרבית בינונית בטמפרטורה של 37°C לצורך תרגום cRNA.
  8. הפקידו ביציות בטיפות בינוניות קטנות (5 מיקרוליטר) בתרבית על צלחת תרבית רקמה בקוטר 35 מ"מ עם תחתית זכוכית מכוסה בשמן מינרלי. הניחו ביצית אחת בכל טיפה כדי למנוע הלבנה של ביציות שכנות.

3. הדמיה של תאים חיים

הערה: ביציות עכבר חיות נבדקו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך המצויד במטרה לטבילה בשמן Plan- APO 40x/1.25 NA, סיפון סריקה ממונע, תא דגירה (37°C), מצלמת CCD המוצמדת לגלגל פילטר ודיסק מסתובב. תמונות ברזולוציה טמפורלית גבוהה נרכשות באמצעות Metamorph (להלן תוכנת ההדמיה) במצב רכישת זרם.

  1. פתח את החלון רכישה של תוכנת ההדמיה.
  2. הגדר את זמן החשיפה ל- 500 אלפיות השנייה, אזור המצלמה ב - Full Chip ו- Binning ב- 1.
  3. בכרטיסיה רכישה , הגדר תאורה עבור הערוץ הנדרש. כדי לדמות פעילות ציטופלזמית, להאיר ביציות עם אור מועבר. כדי לדמיין את הגרעין המסומן עם YFP-Rango או SRSF2-GFP, האר ביציות עם אורך גל עירור של 491 ננומטר.
  4. עבור ערבוב ציטופלזמי או ניסויי YFP-Rango, התמקדו בגרעין הביציות שניתן לצפות בו בקלות באמצעות אור מועבר (איור 3A). מטוס אחד בודד יירכש. עבור ניסויים בכתמים גרעיניים, התמקדו בטיפות SRSF2-GFP (איור 3C).
  5. בכרטיסייה מיוחד , הגדר פרמטרים על מנת לייעל את מהירות הרכישה כמפורט להלן.
    תריס מצלמה: פתוח לחשיפה
    מצב ברור: נקה רצף מוקדם
  6. פתח את החלון Stream Acquisition של תוכנת ההדמיה. הגדר את פרמטרי הזרימה בהתאם לניסוי. עבור שני המחקרים10,11, השתמש בפרמטרים המתוארים להלן.
    1. בכרטיסיה רכישה , הגדר את הפרמטרים הבאים.
      מצב רכישה: הזרמה ל-RAM
      מספר מסגרות: 480 (ניתן להקטין ל- 240 מסגרות כדי לקצר את זמן ההדמיה)
      פרמטרים של מצלמה: קבל תמונות בקצב פריימים
      מספר (Nb) של מסגרות לדלג: 0
    2. בכרטיסייה פרמטרים של בקר מצלמה דיגיטלית , הגדר את הפרמטרים הבאים.
      מצב מצלמה: HALT
      מצב תריס: פתח לעולם לא
      מצב ברור: נקה רצף מוקדם
      Nb של מסגרות לממוצע: 1
      הערה 1: במצב זרם, לאחר הגדרת זמן החשיפה, משך הסרט נקבע לפי מספר המסגרות. לדוגמה, זמן חשיפה של 500 אלפיות השנייה ו- 480 פריימים יוצרים סרט של 4 דקות. ניתן להציג תצוגה מקדימה במהלך רכישת תמונה.
  7. התאם אזור עניין (ROI) מסביב לאובייקט. מזעור שטח החזר ההשקעה מקצר את זמן הרכישה.
  8. לחץ על רכוש בחלון רכישת זרם כדי להפעיל את הסרט.
  9. שמור סרט כקובץ .tif בתום הרכישה.
    הערה: כדי לעקוב אחר מבנים גרעיניים במהלך סרטים ברזולוציה טמפורלית גבוהה, גשושיות גרעיניות (YFP-Rango ו- SRSF2-GFP) צריכות להיות בעלות יחס אות לרעש גבוה כדי להקל על פילוח האובייקטים במהלך שלבים נוספים של ניתוח תמונה. פרופילי ביטוי אקסוגניים של SRSF2-GFP צריכים להיות דומים לפרופילים חיסוניים של כתמים גרעיניים אנדוגניים (איור 3C-D). שינויים בפרופילי ביטוי SRSF2-GFP ביחס לצביעה אנדוגנית עשויים לשקף מינונים גבוהים של הזרקת cRNA ותרגום26 (איור 3C-D).

4. ניתוח תמונה: ערבוב ציטופלזמי

הערה: הערבוב הציטופלזמי המשקף את עוצמת הפעילות הציטו-שלדית מבוססת האקטין בביציות נקבע על ידי ניתוח מתאם תמונה באמצעות תוכנה מפרסום קודם של מעבדה9 וזמיןב-27. התוכנה מודדת כמה עוצמות פיקסלים נשמרות בין תמונות עוקבות. הפלט הוא אובדן המתאם בין תמונות בזמן, החל מ-1 ויורד אקספוננציאלית עם הזמן, כמוב-9.

  1. יישר תמונות גולמיות עם קיטועי זמן (Δt=0.5 שניות) באמצעות תוסף Fiji StackReg (Plugins>StackReg). כדי להתקין את התוסף StackReg28, הפעל את אתר העדכון BIG-EPFL29 כדי לקבל גישה לתוסף.
  2. חשב מתאמי תמונה בשדה בהיר ב- 3 עד 4 אזורים ציטופלזמיים של ~300 מיקרומטר2 לפי השלבים הבאים.
    1. חתוך את האזורים ושמור אותם כקובצי סרט נפרדים. פתחו את חלון המסוף.
    2. הקלד ביצית, הקש על מקש הרווח ולאחר מכן הקש Enter. מופיע חלון בשם אות וחריץ. בחר את קובצי הסרט החתוכים שינותחו.
      הערה: ניתן לבחור מספר סרטים בו-זמנית.
  3. היישום מחזיר קבצים באותה תיקייה כמו הסרטים. נוצרים שלושה קבצים שונים עם סיומות .csv, .eps ו- .xls. קובץ .xls מכיל את הנתונים כדי לשרטט את תרשימי המתאם עבור אזור אחד. ערכי מתאם ממוצעים מאזורים שונים בתא.
  4. למטרות בהירות חזותית, המר ערכי מתאם סופיים על-ידי הפחתת הערך של כל נקודת זמן מ- 1 כדי לקבל עקומה מעריכית הפוכה כמו ב- 11.

5. ניתוח תמונות: מפות וקטוריות ציטופלזמיות

הערה: מפות וקטוריות ציטופלזמיות של ביציות עכבר נוצרו על ידי תוסף Spatiotemporal Image Correlation Spectroscopy (STICS)30 שיושם בעבר לאיתור זרימות ציטופלזמיות בביציות עכבר31 בפיג'י 32 וזמין ב-33. המפות מראות את גודל מהירות הזרימה הציטופלזמית ואת כיוונה, כמוב-9 וב-11.

  1. המרת תמונות עם קיטועי זמן של שדה בהיר (Δt=0.5 שניות) לתבנית של 32 סיביות.
  2. יישרו מחדש תמונות עם תוסף Fiji StackReg בתוספים > StackReg ובחרו שינוי צורה של גוף קשיח .
  3. כאשר מחסנית התוספים מחסרת את הממוצע הנע jru v2 (בכלי Detrend של חבילת התוספים STICS), היפטר ממבנים נייחים בסרט על ידי הפחתת התמונה הממוצעת בזמן של הסרט. תיבות הסימון החסר ממוצע סטטי ופלט מחסנית משנה, בחר שמור על ממוצע מרחבי והגדר נקודה על 5.
  4. ציירו החזר השקעה סביב הביצית, למעט קליפת המוח כדי למנוע השפעות גבול של התוסף.
  5. הפעל את תוסף STICS map jru V2 (בכלי ICS), עם תת-אזור בגודל של 32 פיקסלים, גודל צעד של 16 פיקסלים, היסט זמני STICS של 3, היסט X ו- Y של 0, מכפיל מהירות של 8, סף גודל של 0 ותיבות סימון של נרמול אורך וקטורי, וקטורי מרכז, מהירויות פלט ושימוש במסיכת סרט.
    הערה: התוסף מייצר מפה של הביצית בפורמט .tif, המציגה זרימות ציטופלזמיות כווקטורים עם צבעים המציינים אמפליטודות זרימה, כמוב-9 וב-11, וקובץ אקסל עם מהירויות זרימה מדודות.

6. ניתוח תמונות: תנודות בקווי המתאר הגרעיניים

הערה: ניתן לקבוע תנודות בקווי המתאר הגרעיניים המשקפות תסיסה של קרום הגרעין מסרטים של גרעינים המסומנים ב-YFP-Rango (איור 4A,C). ניתוח תמונה עבור תנודות מתאר גרעיני דורש פיג'י והתקנה של תוספים StackReg (לאפשר את עדכון BIG-EPFL אתר29 כדי לקבל גישה תוסף StackReg), PureDenoise34 ו Ovocyte_nucleus. תוסף StackReg מבצע רישום תמונות כדי לתקן תנועה גלובלית אפשרית. תוסף PureDenoise מסיר רעש של תמונות רב-ממדיות שהושחתו על ידי רעש פואסון-גאוס מעורב ומחליק את קווי המתאר הגרעיניים. תוסף Ovocyte_nucleus סף את האות וממלא את החור המתאים לגרעין על מנת ליצור מסיכת גרעין בינארית, ליישר אותה מחדש עם StackRreg ולחשב את המרחק r מהצנטרויד של מסיכת הגרעין להיקף המסכה עבור כל זוויות θ (θ° מ- 0° עד 360° בהפרש קבוע של 1°), כמו באיור 4. כל הקודים עבור תוספים אלה ניתן למצוא ב 35.

  1. בפיג'י, בתפריט Plugins > CIRB > Verlhac , בחר Ovocyte Nucleus Shape.
  2. בתיבת הדו-שיח, בצע את הבחירה הבאה.
    1. בחר את התיקיה המכילה את הסרטים לניתוח.
    2. בחר את זווית θ (ניתן לבחור ערך מ- 1° עד 360° וערך של 1° שימש לרזולוציית מיתאר אופטימלית), השוליים לחיתוך (מומלץ 5 מיקרומטר כדי לשמור על הגרעין כולו).
    3. בחר את כיול XY ואת מרווח הזמן. לחץ על אישור.
      הערה: התוצאות מסופקות כקובצי .xls בתיקיית out בתיקייה המכילה את הסרטים המקוריים. קובץ זה מציג את כל הרדיוסים r הנמדדים עבור כל t ולכל זווית θ. דוגמה לקובץ פלט מופיעה בטבלה משלימה 1. תיקיית החוץ מכילה גם סרט של מסיכת הגרעין.
  3. באמצעות גיליון אלקטרוני, חשב את רדיוס R הממוצע על פני כל נקודות הזמן t עבור כל זווית θ מוגדרת. זה מאפשר לשרטט את הצורה הממוצעת לאורך זמן (איור 4B). ראו דוגמה בטבלה משלימה 2.
  4. עבור כל t ו- θ מחסרים את הרדיוס הממוצע R לאורך זמן מהרדיוס r. השונות (r-R)2 היא מדד לתנודות המעטפת הגרעינית.
  5. חשב את ממוצע התנודות עבור כל נקודות הזמן t וכל הזוויות θ עבור כל גרעין ובסופו של דבר עבור כל הגרעינים מתנאי אחד.
    הערה: כאשר צורת הגרעינים משתנה באופן משמעותי, כמו במקרה של שלד ציטו-שלד משובש, גרעינים המסומנים ב-YFP-Rango מסובבים בפיג'י כדי לכוון את החלק החלק כלפי מעלה ואת הפלישה כלפי מטה, לפני שממשיכים בניתוח תנודות מתאר גרעיניות, כמוב-10.

7. ניתוח תמונה: תנועות גרעין גרעיני (דינמיקה דיפוזית)

הערה: ניתוח תנועת כתמים גרעיניים מאפשר להסיק את סוג הדינמיקה (מונעת, דיפוזית או מוגבלת) של אברונים אלה ממסלוליהם.

  1. בחרו תמונות במצב זרם של ביציות המבטאות טיפות SRSF2-GFP הנעות בעיקר בציר X-Y.
  2. נכון להלבנה של תמונות בהילוך מהיר של ביציות המבטאות SRSF2- GFP בשיטת התאמת ההיסטוגרמה בפיג'י (Image > Adjust > Bleach Correction).
  3. יישר מחדש תמונות עם תוסף Fiji StackReg.
  4. עקוב אחר מרכזי טיפות SRSF2-GFP באמצעות תוסף המעקב הידני של פיג'י (תוספים > מעקב > מעקב ידני). לחץ על הוסף רצועה כדי להתחיל במעקב ולחץ על סיים מסלול בסיום. אל תפעיל תיקון מרכוז.
  5. העתק רצועות לקובץ גיליון אלקטרוני כדי להמשיך בחישובי הזחות ריבועיות ממוצעות זמניות (MSD) כמו ב- 11, וחשב MSD זמניים מכל מסלולי טיפות של 20 שניות.
  6. התאם עקומות (msd(t) = beta x tα) בשיטת Nelder-Mead באמצעות תוכנת R כדי להעריך את מעריכי הדיפוזיה אלפא (α).
  7. מדוד את מקדם הדיפוזיה האפקטיבי כדי להיות מסוגל להשוות בין התנאים השונים מכיוון שהדיפוזיה צפויה להיות חריגה (α< 1).
  8. חשב את מקדם הדיפוזיה האפקטיבי Deff מהתאמה ליניארית (אלפא=1) על 40 הנקודות הראשונות (20 שניות) של עקומת MSD הטמפורלית ונמל לפי גודל הטיפה (Deff במיקרומטר2/s x 3/2 πr במיקרומטר).

8. ניתוח תמונה: תנודות פני השטח של כתמים גרעיניים

הערה: Nuclear speckle contour evolution in time, קריאה של העברת כוח פעיל על אברונים אלה, נמדדה באמצעות תוסף מותאם אישית Radioak36 לשימוש בפיג'י וזמיןב-37. התוסף מחלץ את ערכי הרדיוסים של בחירה נתונה לכל הזוויות סביב מרכז הבחירה. שינוי הצורה לאורך זמן נמדד על ידי השוואת ערך הרדיוס ביחס לערכו הממוצע לכל זווית. התוסף מאפשר לכמת את תנודות הצורה ומציע אפשרות לדמיין דינמיקות אלה. כדי להתקין אותו, הורד את קובץ Radioak_.jar ומקם אותו בתיקיית התוספים של פיג'י. הפעל מחדש את פיג'י. תוסף זה הוא גרסה מעודכנת של התוסף המשמש לניתוח תנודות מתאר גרעיניות לעיל ויישום צינור דומה.

  1. בסרטי הזרמה של טיפות SRSF2-GFP, בחר טיפות גדולות יותר בגדלים דומים (רדיוס ~ 2.5 מיקרומטר).
    הערה: אם הטיפות קטנות מדי, רזולוציה לא מספקת תוביל למדידות חריגות של תנודות פני השטח.
  2. חתוך תמונות קיטועי זמן של טיפות המשתרעות על פני 15 שניות (Δt = 0.5 שניות) על-ידי ציור מלבן מסביב לטיפה ובחר Image > Crop (איור 5).
  3. יישרו מחדש תמונות עם תוסף Fiji StackReg בתוספים > StackReg ובחרו שינוי צורה של גוף קשיח .
  4. החליקו תמונה כדי להסיר רעשים סביב טיפה בעזרת האפשרות ' החלקת פיג'י' תחת 'פרוצס'.
  5. צור מסיכה בינארית של droplet באמצעות האפשרות Convert to Mask בפיג'י תחת Process > Binary. השתמש בשיטת ברירת המחדל ובכהה לרקע (איור 5).
  6. נתח את מסיכת הטיפה הבינארית שנוצרה באמצעות האפשרות נתח חלקיקים בפיג'י תחת נתח, בחר נקה תוצאות והוסף למנהל אפשרויות ושמור את אזור האינטרסים (ROIs) ב- RoiManager (More > Save) בתבנית zip לקריאה על-ידי Radioak. יש לשמור את החזר ההשקעה בתיקייה הנקראת קווי מתאר באותה תיקייה של הסרטים, בקבצים הנקראים imagename_UnetCortex.zip כדי שכל סרט יימצא על ידי רדיואק.
  7. בתפריט Fiji Plugins > CIRB > Radioak , בחר Get Radii כדי לעבד סרט אחד בלבד או Do One Folder כדי לנתח את כל הסרטים מאותה תיקייה.
    הערה: חלון קופץ כדי לבחור את מספר הזווית ואת קנה המידה. רדיואק שוגרה במרווחים של זווית של 1° מ-0° עד 360° (קלט של 360) וערכי הרדיוסים חולצו.
  8. בחר את הסרט או את התיקיה המכילה את הסרטים שברצונך לנתח. התוצאות מסופקות כקובצי .xls (קובץ אחד לכל סרט) בספריית radioakres בתיקייה הכוללת את הסרטים המקוריים. כל קובץ מציג את כל רדיוסי r הנמדדים (במיקרומטר אם פרמטר קנה המידה מולא) לכל פעם t (בפרוסה) ולכל זווית (ברדיאנים; איור 5; ראו דוגמה לתפוקה .xls בטבלה משלימה 3).
  9. בגיליון האלקטרוני, חשב את רדיוס R הממוצע על פני כל נקודות הזמן t עבור כל זווית מוגדרת (ראה דוגמה בטבלה משלימה 4). זה מאפשר להתוות את הצורה הממוצעת לאורך זמן.
  10. התווה את השונות (r-R)2 במיקרומטר2 המתאימה למידת תנודות פני השטח של טיפות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לוחות תמונה באיור 3 מראים דוגמאות של ביצית טיפוסית שגדלה במלואה (איור 3A), הנוקלאופלזמה בביצית בוגרת במלואה המבטאת YFP-Rango (איור 3B), הנוקלאופלזמה בביצית בוגרת במלואה מבטאת נכונות (פאנל שמאלי; איור 3C) או מוגזם (פאנל ימני; איור 3C) מינון של SRSF2-GFP cRNA, וצביעה חיסונית של כתמים גרעיניים בביצית בוגרת במלואה באמצעות נוגדן SC35 (איור 3D). המינ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השלבים העיקריים בפרוטוקול זה כוללים מיקרו-הזרקה נכונה של ביציות מבלי להשפיע על הישרדותן או על תפקודן התקין 9,10,11, כמו גם מיקרו-הזרקה של כמויות מוגדרות מראש של cRNA שיאפשרו הדמיה נכונה של מבנים רלוונטיים, כמו כתמים גרעיניים.

קביעת הקשר בין דינמיקה ציטופלזמית ודינמיקה (תוך) גרעינית חיונית כאשר חוקרים כיצד השלד הציטופלזמה מסעיר את הגרעין או את פנימיותו. פרוטוקול זה, עם שינויים קלים, מאפשר זאת על ידי קו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

תודות

א.א.ג. ומ.א. כתבו במשותף את כתב היד וכל המחברים השותפים העירו על כתב היד. M. A. נתמך על ידי CNRS ו- "Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322).A.A.J. נתמך על ידי Fondation des Treilles, Fonds Saint-Michel ו- Fondation du Collège de France.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אלבומין סרום בקר (BSA)סיגמא A3311
CSU-X1-M1 דיסק מסתובבבמיקרוסקופ
DMI6000B Leica
Femtojet microinjectorEppendorf
פיג'י
פילטר גלגלSutter Instruments Roper Scientific
FluorodishWorld Precision InstrumentsFD35-100
Metamorph software הדמיה אוניברסלית, גרסה 7.7.9.0
שמן מינרליסיגמא אולדריץ'M8410-1L
NanoDrop 2000 עכברי Thermo Scientific
OF1 ו-C57BL/6 של מעבדות
 מצלמת Thermo FisherAM1350
Retiga 3 CCD ערכת QImaging
RNAeasy נוגדן Qiagen74104
SC35Abcamab11826נוגדן כתמים גרעיניים; עכבר IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP פלסמיד   OriGene TechnologiesMG202528NM_011358
חשפנית מיקרופיפטה  XLAB פתרונותמתמחים באיסוף ביציות
T3 mMessage mMachineThermo FisherAM1384 
T7 mMessage mMachine Thermo FisherAM13344
הדמייתחיים תרמוסטטית
Windows ExcelWindows
ערכת זנב פולי (A) צ'ארלס ריברשירות

מקורות

  1. Quinlan, M. E. Cytoplasmic Streaming in the Drosophila Oocyte. Annual Rev Cell Developl Biol. 32, 173-195 (2016).
  2. Goldstein, R. E., van de Meent, J. W. A physical perspective on cytoplasmic streaming. Interface Focus. 5 (4), 20150030(2015).
  3. Gundersen, G. G., Worman, H. J. Nuclear positioning. Cell. 152 (6), 1376-1389 (2013).
  4. Metzger, T. MAP and kinesin-dependent nuclear positioning is required for skeletal muscle function. Nature. 484 (7392), 120-124 (2012).
  5. Roman, W. Muscle repair after physiological damage relies on nuclear migration for cellular reconstruction. Science. 374 (6565), 355-359 (2021).
  6. Almonacid, M., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Control of nucleus positioning in mouse oocytes. Semin Cell Develop Biol. 82, 34-40 (2018).
  7. Brunet, S., Maro, B. Germinal vesicle position and meiotic maturation in mouse oocyte. Reproduction. 133 (6), 1069-1072 (2007).
  8. Levi, M., Ghetler, Y., Shulman, A., Shalgi, R. Morphological and molecular markers are correlated with maturation-competence of human oocytes. Hum Reprod. 28 (9), 2482-2489 (2013).
  9. Almonacid, M., et al. Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nat Cell Biol. 17 (4), 470-479 (2015).
  10. Almonacid, M., et al. Active fluctuations of the nuclear envelope shape the transcriptional dynamics in oocytes. Dev Cell. 51 (2), 145-157 (2019).
  11. Al Jord, A., et al. Cytoplasmic forces functionally reorganize nuclear condensates in oocytes. Nat Commun. 13 (1), 5070(2022).
  12. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), eaaf4382(2017).
  13. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev. Mol Cell Biol. 18 (5), 285-298 (2017).
  14. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  15. Gordon, J. M., Phizicky, D. V., Neugebauer, K. M. Nuclear mechanisms of gene expression control: pre-mRNA splicing as a life or death decision. Curr Opin Genet Dev. 67, 67-76 (2021).
  16. Barutcu, A. R. Systematic mapping of nuclear domain-associated transcripts reveals speckles and lamina as hubs of functionally distinct retained introns. Mol Cell. 82 (5), 1035-1052.e9 (2022).
  17. Guo, M. Probing the stochastic, motor-driven properties of the cytoplasm using force spectrum microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
  18. Verlhac, M. H., Kubiak, J. Z., Clarke, H. J., Maro, B. Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes. Development. 120 (4), 1017-1025 (1994).
  19. Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M., Jones, K. T. APCcdh1 activity in mouse oocytes prevents entry into the first meiotic division. Nat Cell Biol. 8 (5), 539-540 (2006).
  20. El-Hayek, S., Clarke, H. J. Control of oocyte growth and development by intercellular communication within the follicular niche. Results Probl Cell Differ. 58, 191-224 (2016).
  21. Dumont, J. A centriole- and RanGTP-independent spindle assembly pathway in meiosis I of vertebrate oocytes. J Cell Biol. 176 (3), 295-305 (2007).
  22. Kaláb, P., Pralle, A., Isacoff, E. Y., Heald, R., Weis, K. Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells. Nature. 440 (7084), 697-701 (2006).
  23. Lafontaine, D. L. J., Riback, J. A., Bascetin, R., Brangwynne, C. P. The nucleolus as a multiphase liquid condensate. Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 165-182 (2021).
  24. Terret, M. E., et al. DOC1R: a MAP kinase substrate that control microtubule organization of metaphase II mouse oocytes. Development. 130 (21), 5169-5177 (2003).
  25. Dumont, J., Verlhac, M. H. Using FRET to study RanGTP gradients in live mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957, 107-120 (2013).
  26. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Gene Develop. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  27. OOCytes. , https://github.com/Carreau/OOCytes (2014).
  28. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  29. ImageJ. , https://imagej.github.io/update-sites/big-epfl (2023).
  30. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys J. 88 (5), 3601-3614 (2005).
  31. Yi, K., et al. Dynamic maintenance of asymmetric meiotic spindle position through Arp2/3-complex-driven cytoplasmic streaming in mouse oocytes. Nat Cell Biol. 13 (10), 1252-1258 (2011).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  33. Stowers ImageJ Plugins. , https://research.stowers.org/imagejplugins/ (2023).
  34. Luisier, F., Vonesch, C., Blu, T., Unser, M. Fast interscale wavelet denoising of Poisson-corrupted images. Signal Process. 90 (2), 415-427 (2010).
  35. Ovocyte_Nucleus. , https://github.com/orion-cirb/Ovocyte_Nucleus (2023).
  36. Letort, G. gletort/ImageJFiles: GLijplugs_v0.2.0. , doi: 10.5281/zenodo.6854802 (2022).
  37. ImageJFiles. , https://github.com/gletort/ImageJFiles/tree/master/radioak (2023).
  38. Chu, F. Y., Haley, S. C., Zidovska, A. On the origin of shape fluctuations of the cell nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (39), 10338-10343 (2017).
  39. Caragine, C. M., Haley, S. C., Zidovska, A. Surface fluctuations and coalescence of nucleolar droplets in the human cell nucleus. Phys Rev Lett. 121 (14), 148101(2018).
  40. Introini, V., Kidiyoor, G. R., Porcella, G., Cicuta, P., Cosentino Lagomarsino, M. Centripetal nuclear shape fluctuations associate with chromatin condensation in early prophase. Commun Biol. 6 (1), 1-11 (2023).
  41. Boija, A., Klein, I. A., Young, R. A. Biomolecular condensates and cancer. Cancer Cell. 39 (2), 174-192 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

שלד התא של הביציתטלטול גרעיניביציות של עכברכוחות ציטופלזמייםמעבשים ביו-מולקולרייםמכניקה גרעיניתניתוח תמונותדימיון תאים חייםנקראים גרעיניים (Nuclear Speckles)התמרות מכניות
לכידת תסיסה מבוססת שלד של גרעין ביצית העכבר על פני קני מידה מרחביים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.