הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ייצור ואפיון אורגנואידים מסרטן המעי הגס SW1222 בקו תאים במטריצת פפטיד אולטרה-קצרה להרכבה עצמית

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66060

⸱

3 במאי 2024

 ,  , 
1Laboratory for Nanomedicine, Biological & Environmental Science & Engineering, King Abdullah University of Science and Technology, 2Computational Bioscience Research Center, King Abdullah University of Science and Technology, 3Red Sea Research Center, King Abdullah University of Science and Technology

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה נועד להעריך פפטידים ביו-פונקציונליים להרכבה עצמית עבור הידבקות תאים, מורפולוגיה אורגנואידית וביטוי גנים על ידי אימונוסטיין. אנו נשתמש בקו תאי סרטן המעי הגס כדי לספק דרך חסכונית להשגת אורגנואידים לבדיקות אינטנסיביות.

תקציר

פפטידים אולטרה-קצרים להרכבה עצמית (SAPs) יכולים ליצור באופן ספונטני ננו-סיבים הדומים למטריצה חוץ-תאית. סיבים אלה מאפשרים היווצרות של הידרוג'לים תואמים ביולוגית, מתכלים ולא אימונוגניים. הוכחנו בעבר כי SAPs, כאשר הם מתפקדים ביולוגית עם מוטיבים שמקורם בחלבון, יכולים לחקות את מאפייני המטריצה החוץ תאיים התומכים בהיווצרות אורגנואידים במעי הגס. הידרוג'לים פפטידים ביו-פונקציונליים אלה שומרים על התכונות המכניות, יכולת הכוונון ויכולת ההדפסה של פפטיד האב המקורי תוך שילוב רמזים המאפשרים אינטראקציות בין מטריצת התא להגביר את הידבקות התא. מאמר זה מציג את הפרוטוקולים הדרושים כדי להעריך ולאפיין את ההשפעות של הידרוג'לים פפטידים ביו-פונקציונליים שונים על הידבקות תאים והיווצרות לומן באמצעות קו תאים סרטני אדנוקרצינומה המסוגל ליצור אורגנואידים של סרטן המעי הגס בצורה חסכונית. פרוטוקולים אלה יסייעו להעריך את ההשפעות של פפטיד הידרוג'ל ביו-פונקציונלי על הידבקות תאים והיווצרות לומינלית באמצעות צביעה חיסונית וניתוח תמונה פלואורסצנטית. קו התאים ששימש במחקר זה שימש בעבר לייצור אורגנואידים במטריצות שמקורן בבעלי חיים.

מבוא

בשנים האחרונות, פפטידים להרכבה עצמית (SAPs) התגלו כביו-חומרים מבטיחים ליישומי הנדסת רקמות. ל-SAPs תכונות ייחודיות, כולל היווצרות ספונטנית של ננו-סיבים, תאימות ביולוגית, מתכלות ביולוגית ואי-אימונוגניות, מה שהופך אותם למועמדים אטרקטיביים לפיתוח פיגומים1. SAPs שימשו בעבר יחד עם סוגים שונים של תאים, ובעיקר, SAPs אולטרה קצרים דווחו הקלו על אנקפסולציה של תאי גזע תוך שמירה על פלוריפוטנטיות שלהם לאורך תקופות ממושכות הכוללות יותר מ -30 מעברים עם שכיחות מינימלית של סטיות כרומוזומליות 2,3,4. לפיכך, התאמת SAPs לשימוש בהם בתרבות אורגנואידים היוותה צעד רציונלי עוקב.

אורגנואידים הם מבנים תלת-ממדיים מורכבים הנובעים מתאים פלוריפוטנטיים בודדים. מבנים אלה יוצרים סוגי תאים שונים, אשר לאחר מכן מתארגנים בעצמם כדי לשכפל את תהליכי ההתפתחות של גדילת עוברים ורקמות במבחנה5. מסגרת חדשנית זו התפתחה לכלי אדיר לחקירות חוץ גופיות, תוך שימור יעיל של התכונות הגנטיות, הפנוטיפיות וההתנהגותיות המאפיינות איברים in vivo 6. עם זאת, מכשול עיקרי במעבר מהספסל למיטה של ממצאים מבוססי אורגנואידים הוא הצורך בשחזור7. שונות זו בתוצאות מיוחסת בעיקר לקושי בהתמיינות מלאה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לשושלות תאים מתמחים, בנוסף להיעדר ארכיטקטורת רקמות אותנטית ולמורכבות האינהרנטית בה נתקלים במודלים אורגנואידים. לאור העלייה בפופולריות של מחקרים מבוססי תאי גזע ואורגנואידים8, חלה עלייה בביקוש לביו-חומרים בעלי תכונות מכניות דינמיות ואתרי הדבקה דמויי אינטגרין או פיגומים עם יכולת פירוק מבוקרת 7,9. ניתן לכוונן תכונות אלה ביעילות באמצעות ניצול אסטרטגי של SAPs ביו-פונקציונליים.

SAPs הם רצפים קצרים של חומצות אמינו עם היכולת הטבועה להתארגן באופן ספונטני למבנים מוגדרים היטב10. פפטידים אלה מכילים לעתים קרובות שאריות הידרופוביות והידרופיליות לסירוגין, אשר מניעות את הרכבתם העצמית באמצעות אינטראקציות לא קוולנטיות, כולל קשרי מימן, אינטראקציות אלקטרוסטטיות והשפעות הידרופוביות11,12. תהליך ההרכבה העצמית של פפטידים אלה מונע בעיקר על ידי הצורך למזער את האנרגיה החופשית של המערכת. כאשר הם נמצאים בסביבה מימית, השאריות ההידרופוביות נוטות להתקבץ יחד כדי למזער את חשיפתן למים, בעוד שהשאריות ההידרופיליות מתקשרות עם מולקולות המים שמסביב. תופעה זו מובילה להיווצרות ננו-מבנים שונים. במקרה זה, פפטידים אולטרה-קצרים להרכבה עצמית יוצרים ננו-סיבים בעלי מאפיינים התלויים ברצף הפפטיד ובתנאי הסביבה 2,12,13,14,15,16. הפפטידים האלה מאמצים קונפורמציה של β סיבובים, שבה גדילי פפטידים בודדים מתיישרים במקביל או נגד מקבילים זה לזה, ומיוצבים על-ידי קשרי מימן (איור 1). נוכחותם של יונים חיוביים מאיצה את תהליכי ההרכבה העצמית המובילים להיווצרות ננו-סיבים.

ננו-סיבים פפטידים זוהו כבעלי יכולת מולדת ללכוד כמויות משמעותיות של מים. מאפיין זה מאפשר יצירת הידרוג'ל, אשר לאחר מכן מתבטא כחלל תלת מימדי תואם ביולוגית ומתכלה התורם לשגשוג וצמיחה תאית. ננו-סיבים פפטידים אלה בהרכבה עצמית מחקים באופן מורכב את התכונות הטופוגרפיות הטבועות בסביבת המטריצה החוץ-תאית הטבעית (ECM)1. דמיון זה מעניק לתאים סביבה המחקה את סביבת המחיה הפיזיולוגית שלהם, ומקדם עוד יותר פעילות תאית מיטבית17. יתר על כן, הרבגוניות הטבועה בפפטידים אלה מאפשרת מידה ניכרת של כוונון4. יכולת הסתגלות כזו מאפשרת שינויים בתכונות המטריצה, כגון קשיחות, קינטיקה ג'לציונית ונקבוביות. התאמות אלה מושגות באמצעות שינויים ברצף הפפטידים. כתוצאה מכך, פפטידים להרכבה עצמית (SAPs) התגלו כמרכיבים מרכזיים במדע הביו-חומרים העכשווי, בשימוש נרחב כפיגומים להתחדשות רקמות ולתרבית תאית13,17.

אחד היתרונות הקריטיים של פפטידים בהרכבה עצמית הוא יכולתם להיות מסונתזים ומשתנים בקלות ברמה המולקולרית. יתרון זה מאפשר שילוב של קבוצות פונקציונליות ספציפיות או מוטיבים ביו-אקטיביים ברצף הפפטידים, מה שמאפשר תכנון של פפטידים בעלי תכונות ופונקציות מותאמותאישית 18,19,20 (איור 1B). לדוגמה, ניתן לתכנן SAPs ביו-פונקציונליים כך שיחקו את ה-ECM ויקדמו התמיינות באמצעות פפטיד RGD19,21. פפטיד בן-IKVAV דווח גם כמגביר באופן משמעותי את הביטוי של סמנים ספציפיים לנוירונים בשל המוטיטי הספציפי לליגנד22. ניתן גם להנדס פפטידים אלה כך שיציגו מולקולות ביו-אקטיביות, כגון פפטידים קושרי אינטגרין, כדי לשפר את הישרדות התא23. לבסוף, SAPs ביו-פונקציונליים אחרים פותחו כדי לקדם אנגיוגנזה על ידי הכללת המוטיבים IKVAV ו- YIGSR במבנים שלהם24.

SAPs ביו-פונקציונליים שדווחו בפרסום מוקדם יותר מראים כי ניתן לשנות עוד יותר הרכבה עצמית על ידי הכללת הפפטיד הנאיבי שממנו נגזר SAPהביו-פונקציונלי 25. תערובות SAP אלה יכולות גם לספק מגוון רחב של פורמולציות SAP הנבדלות זו מזו בפעילות הביוכימית ובתכונות הפיזיקוכימיות שלהן. לדוגמה, הפפטיד האמפיפילי IIFK הוא SAP אולטרה-קצר שיכול לעמוד בביו-פונקציונליזציה עם מוטיבים שונים, כפי שמודגם על-ידי שילוב מוטיב IKVAV (איור 1B). שני הפפטידים יכולים ליצור ננו-סיבים, גם לבד וגם ביחד. כל נוסחה יוצרת הידרוג'לים בעלי תכונות פיזיקליות שונות (איור 2)

עם זאת, בגלל המגוון הרחב של תמורות פוטנציאליות וחלופות המתקבלות מהביו-פונקציונליזציה של SAPs, יש צורך לספק אפשרות מהירה וחסכונית לבדיקת אורגנואידים. מועמד אחד להערכה אורגנואידית אינטנסיבית וחסכונית כזו הוא קו התאים SW1222, הנגזר מאדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי26,27. לתאי SW1222 יש מאפיינים המאפשרים את צבירתם למבנים תלת-ממדיים הדומים לאורגנואידים, מה שהופך אותם למודל אידיאלי לחקר התפתחות רקמות ויישומי רפואה רגנרטיבית. תאי SW1222 זוהו כמסוגלים לייצר אורגנואידים בשל ביטוי היתר הפנימי שלהם של הגן LGR5 27. יצירת אורגנואידים מתאי גזע בודדים LGR5+ הוצגה באופן משכנע בעבר, כמו גם הנטייה של תאי SW1222 להשיג מאפיינים מורפולוגיים של אורגנואיד סרטן המעי הגס28.

במאמר שיטות זה אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים להערכה ולאפיון ההשפעות של פפטידים ביו-פונקציונליים שונים על הידבקות תאים והיווצרות לומן באמצעות תאי SW1222 (איור 3). על ידי מתן נהלים שלב אחר שלב ושיטות ניתוח הדמיה, אנו מקווים להציע תובנות יקרות ערך לגבי ייצור ביולוגי של אורגנואידים והערכה של מטריצות SAP פשטניות עבור תרבית אורגנואידים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. חיץ והכנת תמיסה

הערה: כל הריכוזים המוצהרים הם ריכוזים סופיים.

  1. הוסף סרום בקר עוברי (FBS) ופניצילין-סטרפטומיצין בריכוז סופי של 10% ו -1%, בהתאמה, כדי להכין את המדיום של Dulbecco של Iscove שונה (IMDM). יש לאחסן בחושך ב-4°C למשך עד חודש אחד.
  2. ערבבו את MgCl2 (3 מילימול), סוכרוז (300 מילימול) וטריטון X-100 (0.5%) במי מלח חוצצי פוספט (PBS) כדי להכין את מאגר החדירות. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.
  3. שלבו אלבומין בסרום בקר (BSA, 1%), גליצין (0.3 M) ו-Tween-20 (0.1%) ב-PBS כדי להכין מאגר חוסם. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.
  4. יש לדלל 10x עד 2x PBS במים טהורים במיוחד בתנאים סטריליים. יש לאחסן תמיסה זו בטמפרטורת החדר למשך למעלה מ-6 חודשים.
  5. יש לעקר 3 מ"ג של אבקת הפפטיד תחת אור אולטרה סגול למשך 30 דקות. הוסף 500 μL של מים טהורים במיוחד כדי להתמוסס באמצעות מערבולת מערבולת.
    הערה: הריכוז הסופי חייב להיות כפול מריכוז היעד, כלומר 6 מ"ג/מ"ל, שכן ריכוז 1x יהיה 3 מ"ג/מ"ל.

2. ייצור אורגנואידים של סרטן המעי הגס מ- SW1222 בפפטיד

  1. הפשירו אליקוט למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C ושמרו אותו בקרח עד לצורך להכנת בקרת מטריצת המרתף.
  2. מניחים טיפה של 10 μL של תמיסת פפטיד 2x במרכז כל באר בצלחת של 24 בארות. מניחים לצלחת לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לחלופין, הפקידו 8-10 טיפות לכל באר בצלחת של 6 בארות.
    הערה: דגימות המיועדות לשימוש במיקרוסקופ קונפוקלי ואלקטרונים נגישות יותר למניפולציה אם הן נזרעות על גבי מכסה סטרילי.
  3. הוסף 10 μL של 2x PBS. ערבבו את תמיסת PBS בעדינות בעזרת הקצה. הניחו לג'לים להתייצב למשך 20 דקות לפחות, וודאו שהטיפות נשארות כמעט שלמות.
    הערה: המטרה של חיבור PBS וערבוב עדין היא לשמור על שלמות הטיפה ולהימנע מפיזור ההידרוג'ל לשכבה.
  4. נתק תאי SW1222 באמצעות תמיסת טריפסין-EDTA 0.125% (5 מ"ל). לדגור על התאים עם טריפסין ב 37 ° C במשך 5-10 דקות עד שהם להתנתק מן הצלוחית. הימנעו מהקשה על הבקבוק כדי למנוע הצטברות תאים.
  5. הוסף 5 מ"ל של מדיום מלא כדי להשבית את הטריפסין. סנן את תרחיף התא באמצעות מסננת תאים בגודל 30 מיקרומטר. לחלופין, השתמש מזרק עם מחט 25 G כדי לשבש את האגרגטים.
  6. הכינו תרחיף תאים של 0.4 × 106 תאים/מ"ל והזריקו 2 מיקרוליטר של תרחיף התא בכל טיפת פפטיד באמצעות מיקרופיפטה של 10 מיקרו-ליטר.
  7. לדגור על הטיפות במשך 30 דקות ב 37 ° C, 5% CO2. הוסף 0.5 מ"ל של תוספת בינונית לכל באר לאחר הדגירה.
  8. בזמן ההמתנה, הכינו את בקרת מטריצת קרום המרתף על ידי דילול המלאי העיקרי (8-12 מ"ג / מ"ל, תלוי במגרש) לריכוז סופי של 3 מ"ג / מ"ל באמצעות המדיום התוסף. הוסף תאים לתמיסה זו (800 תאים לכל 25 μL).
    הערה: מניפולציה של קרום המרתף חייבת להיעשות על קרח בכל עת. יש לשטוף את הטיפים ב-PBS קר כקרח לפני שנוגעים בהידרוג'ל. אחרת, פילמור יתרחש בתוך הקצות.
  9. צלחת 20 μL טיפות של תמיסת קרום המרתף בכל באר. אפשר את הטיפות לג'ל על ידי דגירה במשך 20 דקות ב 37 ° C. לאחר החומר הוא gelled, להוסיף 0.5 מ"ל של מדיום שלם.
  10. שנה את המדיום כל 3-4 ימים. שימו לב לתאים המתארגנים ומראים אותות של היווצרות לומן כבר ביום הרביעי.
  11. תמונה של תאים בשדה בהיר ביום 1, יום 4 ויום 7 כדי להעריך את צמיחת האורגנואידים.

3. כדאיות והתפשטות

  1. הכינו שלוש צלחות באר שחורה לבדיקת הכדאיות ושלוש צלחות באר שחורה לבדיקת ההתפשטות. הוסף 25 μL של 2x תמיסת פפטיד לכל באר וג'לאט באמצעות אותו נפח של 2x PBS. זרעו את התאים כמתואר לעיל.
  2. הכינו שלוש בארות לכל פורמולציה של הידרוג'ל פפטידי שישמשו כחסרים בצלחת ההתפשטות. אין לזרוע תאים על אלה.
  3. מוציאים את המדיום מצלחת באר הכדאיות ושוטפים עם 1x PBS במשך 3 x 5 דקות.
  4. לדלל Calcein-AM ו ethidium homodimer ל 8 μM מן הכדאיות / ציטוטוקסיות ערכת עבור תאי יונקים (ראה טבלה של חומרים) לתוך אותו צינור חרוטי מוגן אור. כדי להכין 2 מ"ל של תמיסה זו ל -2 מ"ל של PBS בצינור חרוטי מוגן אור, הוסף 4 μL של תמיסת מלאי Calcein-AM ו- 8 μL של תמיסת המניות Ethidium homodimer-1.
  5. הוסף את תמיסת ההומודימר calcein/ethidium שהוכנה בשלב 3.4 לצלחת 96 בארות. מוסיפים 100 μL לכל באר. יש להגן מפני אור ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  6. יש לכבס במשך 3 x 5 דקות עם PBS אחד. צייר לפחות שלושה שדות (מרכז, עליון, תחתון) בעת שימוש במטרה 4x או לפחות חמישה שדות (מרכז, שמאל עליון, ימין עליון, שמאל תחתון, ימין תחתון) בעת שימוש במטרה של 10x ו- 20x תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  7. הסר את המדיום מצלחת באר ההתפשטות כדי להבטיח נפח סופי של 90 μL.
  8. הוסיפו 10 μL של תמיסת Alamar Blue (ראו טבלת חומרים) כדי להגיע לריכוז סופי של 10%.
  9. יש להגן מפני אור ולדגור במשך 2-4 שעות ב-37°C, 5% CO2
  10. השתמש בקורא לוחות באר כדי למדוד פלואורסצנטיות (Ex/Em = 530-560/590 ננומטר/ננומטר) או ספיגה (570 ננומטר). ממוצע הערכים המתקבלים עבור החסר וחסר אותם מהערכים מכל באר המכילה תאים.
  11. חשב ערכי התפשטות על-ידי ממוצע האות של כל תנאי וחיסור הממוצע של הערכים הריקים שלהם. צור גרפים על-ידי יצירת תרשים תיבה באינדקס של קליטה/אות פלואורסצנטי יחסי לעומת זמן.

4. בדיקת היצמדות של תאים למטריצה

  1. הכינו 100 μL של הידרוג'לים פפטידים בשתי צלחות עצמאיות של 96 בארות.
  2. זרעו 20,000 תאים בכל באר והוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום. לדגור על הצלחות במשך 90 דקות ב 37 ° C, 5% CO2.
  3. לאחר הדגירה, לקחת רק צלחת אחת בזהירות resuspend את המדיום באמצעות micropipette P200 במשך 20-30 שניות. היזהר לא להפריע הידרוג'ל על ידי שמירה על קצה מן הג'ל. לחלופין, אם התכונות המכניות של ההידרוג'ל מאפשרות זאת (G' > 8,000 Pa), הקש על ארבעת הצדדים של לוח הבאר באמצעות מערבולת נעה.
    הערה: השעיה מחדש של המדיה (או הקשה על לוח הבאר עם המערבולת) תסיר תאים שאינם מחוברים ותאים עם היצמדות רופפת לפני השטח של המטריצה. החיבור התאי יתרחש תוך 90 דקות, אם כי חוזקו של חיבור זה ישתנה בהתאם להידרוג'לים הפפטידים הספציפיים ולתכונות הדבק והקישור שלהם. ידוע כי צמיחת אורגנואידים במעי הגס מועדפת במטריצות עם ערכי קשיחות של מתחת ל-2,000 Pa. לכן, מכיוון שההידרוג'לים המוצגים בפרוטוקול זה רכים ושבירים, אנו מקפידים להשתמש בלחץ מכני עדין.
  4. מוציאים 100 μL של מדיום משתי הצלחות ומוסיפים כביסה פעם אחת עם 1x PBS.
  5. הכינו תמיסת DAPI של 1 מיקרוגרם/מ"ל. הוסף 100 μL של תמיסת DAPI לכל הבארות ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. דמיינו מספר מייצג של שדות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ודא שכל התמונות מתקבלות באותה מטרה כדי לשמור על יחס פיקסלים/מרחק קבוע.
    הערה: תמונה תשעה שדות עבור מטרה של 10x או 15 שדות עם מטרה של 20x.
  7. טען את התמונות הפלואורסצנטיות בתוכנת ניתוח תמונות (למשל, ImageJ) ונתח את החלקיקים על כל התמונות.
    1. בתפריט תמונה , בחר הקלד ולחץ על 8 סיביות.
    2. בתפריט תמונה, בחר התאם ולחץ על בהירות/ניגודיות. לחץ על הלחצן Auto | החל.
    3. בתפריט תמונה , בחר התאם ולחץ על סף. לחץ על כפתור אוטומטי וסגור את החלון.
    4. בתפריט נתח , לחץ על ניתוח חלקיקים. סמן את האפשרות לסיכום ולחץ על אישור.
    5. בחלון סיכום , רחף מעל תפריט קובץ ולחץ על שמור כדי לשמור את ערכי הסיכום.
  8. ייצא את התוצאות עבור כל התמונות לתוכנת סטטיסטיקה סטנדרטית.
  9. חשב את אחוז השטח המכוסה על ידי תאים לפני ואחרי מתח. צור תרשים תיבה באינדקס של אחוז השטח כנגד כל תנאי.

5. Immunostaining של אורגנואידים פפטיד הידרוג'ל

  1. זרעו 800 תאים בטיפות 20 מיקרוליטר של פפטיד הידרוג'ל למשך 4 ימים, כמתואר בשלבים 2.1-2.10.
  2. ביום הרביעי, מוציאים את המדיום ושוטפים כל באר 2x באמצעות 1x PBS.
  3. הוסף 400 μL של תמיסת פורמלדהיד 4%. דוגרים על צלחת הבאר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הסר את תמיסת הפורמלדהיד עם P1000 ושטוף פעם אחת עם PBS אחד.
  5. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ חדירה ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. הסר את מאגר החדירות עם P1000 ושטוף פעם אחת עם PBS אחד.
  7. מוסיפים 0.5 מ"ל של חיץ חוסם ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. הסר את מאגר החסימה עם P1000 ושטוף עם PBS אחד.
  9. לדלל את הנוגדן הראשוני במאגר החוסם בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). הוסף 200 μL לשתי בארות.
  10. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
  11. הסירו את תמיסת הצביעה עם P200 ושטפו פעם אחת עם PBS אחד.
  12. לדלל את הנוגדן המשני בחיץ חוסם, בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). מוסיפים את מצומד הפלואידין ביחס של 1:40 בתמיסת הנוגדנים המשנית.
  13. יש להגן מפני אור ולדגור בטמפרטורת החדר לא יותר מ-3 שעות. הסירו את תמיסת הצביעה עם P200 ושטפו פעם אחת עם PBS אחד.
  14. הכן תמיסת DAPI של 1 מיקרוגרם/מ"ל במאגר החסימה. הוסף 300 μL של תמיסת DAPI לכל באר.
  15. יש להגן מפני אור ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  16. הסירו את תמיסת הצביעה עם P200 ושטפו פעם אחת עם PBS אחד.
  17. יש להגן מפני אור ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 7 ימים.

6. הדמיה וניתוח תמונה של אורגנואידים במטריצה

  1. דמיינו את הדגימות המוכתמות באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי ברזולוציית 10x. השתמש רק בערוצי phalloidin ו- DAPI.
  2. פתח את תוכנת Cellopose והקש ctrl + L כדי לטעון תמונה. מכיוון שלתוכנה תהיה גישה לכל הקבצים במיקום של התמונה שנבחרה, הקפד לשמור את כל התמונות הפלואורסצנטיות במיקום המדויק ללא תיקיות משנה.
  3. הקלד את הקוטר הממוצע של המושבות בחלונית Segmentation ולחץ על ENTER.
  4. בחר מודל מותאם אישית לאורגנואידים של המעי הגס ולחץ על הלחצן הפעל מודל .
    הערה: כאן, אנו ממליצים להשתמש בשני דגמים מאפס ב- Cellpose2.029,30
  5. הקש ctrl + s כדי לשמור את המסיכות כקובץ npy.
  6. השתמש בחצי המקלדת כדי לעבור בין תמונות התיקיה ולהפעיל את המודל של אורגנואידים נקודתיים על כל התמונות בתיקייה.
  7. צור עותק של התיקיה וחזור על שלבים 6.2-6.6 באמצעות מודל עבור לומן אורגנואיד המעי הגס.
  8. פתח את ImageJ ולחץ על תוסף | פקודות מאקרו | רץ... כדי להפעיל את קובץ imagej_roi_converter.py הזמין מאתר Cellpose Github ולהמתין להופעת חלון.
  9. בחרו בקובץ הראשון מתיקיית האורגנואיד של המעי הגס ולחצו על הלחצן 'פתח'.
  10. בחר את הקובץ seg.npy המתאים לקובץ הראשון ולחץ על פתח.
    הערה: ImageJ ימיר את המסכות לאזורים מעניינים ויחפוף אותן לתמונות הפלואורסצנטיות המתאימות.
  11. לחץ על בחר הכל בחלון מנהל החזר ההשקעה ולחץ על מדידה.
  12. לחץ על קובץ | שמור בשם... בחלון תוצאות ושמור את התוצאות.
    הערה: פעולה זו תגרום לקובץ .csv המכיל את כל מאפייני הצורה של כל מושבה בשדה.
  13. חזור על שלבים 6.8-6.12 עבור אותה תמונה בתיקייה עבור לומן אורגנואיד של המעי הגס.
  14. טען את OriginPro והקש ctrl + 3 כדי לפתוח את אשף הייבוא. לחץ על כפתור שלוש הנקודות ובחר את שני קבצי .csv המתאימים לתכונות צורת אורגנואיד ולומן עבור אותה תמונה.
  15. העתק והדבק את התוצאות ממאפייני צורת לומן בעמודה אחת ליד תוצאות המושבה כדי להבטיח שכל מדידת לומן מותאמת למושבה המתאימה לה.
  16. בטור חדש, מחלקים את שטחי הלומן והמושבה כדי להניב את שטח הלומן היחסי של המושבה המכילה אותו.
  17. בחר את העמודה המתאימה למעגליות של כל מושבה ואזור לומן. לחץ על מגרש | דו-ממד בסיסי | להתפזר.
  18. לחץ לחיצה ימנית על חלון העלילה ובחר פרטי העלילה. לחץ על הכרטיסייה Centroid(PRO) וסמן את האפשרויות הקוראות הצג נקודת Centroid עבור תת-קבוצה, התחבר לנקודות נתונים והצג אליפסה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ראשית, הערכנו את התאים שגדלו בצלחת של 24 בארות במשך 7 ימים באמצעות הדמיית שדה בהיר. זיהינו צבירים קטנים של תאים שמתאספים לאורגנואידים במהלך השבוע, כפי שניתן לראות באיור 4. שיטת סריקה מבוקרת יכולה לעקוב אחר ניידות התאים והאורגנואידים בין ימים שונים. באופן כללי, הסתכלנו על האבולוציה של המורפולוגיה של התאים במהלך כל השבוע. אורגנואידים שמקורם ב-SW1222 צריכים להיות בעלי מורפולוגיה עגולה ומראה קל. מראה כהה יותר מצביע על צפיפות תאים גבוהה יותר שאינה רצויה, כפי שניתן לראות בחלק מהמושבות שגודלו בפפטי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפוטנציאל העצום של SAPs במחקר ביו-רפואי מודגש על ידי הגמישות ויכולת ההסתגלות שלהם באמצעות ביו-פונקציונליזציה. עם מערך כה נרחב של תמורות, האתגר מתעורר בבדיקה יעילה ובקביעת התצורות המבטיחות ביותר עבור יישומים ספציפיים, במיוחד במחקר אורגנואידים. פתרון מהיר וחסכוני הוא בעל חשיבות עליונה. קו התאים SW1222, הנגזר מאדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי, מתגלה כמועמד מרכזי להערכה אינטנסיבית כזו. כאן הצגנו שיטה להערכה ואפיון של אורגנואידים הגדלים במטריצה מבוססת פפטידים. פרוטוקול זה מבטיח אסטרטגיה אינטגרטיבית וחסכונית המתמקדת בניטור ונית...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

עבודה זו נתמכה כספית על ידי אוניברסיטת המלך עבדאללה למדע וטכנולוגיה. המחברים מודים למענק קרן הסיד של KAUST ולקרן החדשנות של KAUST שהוענקו על ידי החדשנות והפיתוח הכלכלי של KAUST. המחברים מבקשים להודות למעבדות הליבה של KAUST למדעי הביולוגיה וההדמיה על תמיכתן באפיון ביולוגי ובניתוח מיקרוסקופיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1x PBSGibco14190144
צלחת 6 בארות, תרבית רקמות מטופלתקורנינג07-200-83
10x PBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםגיבקו70011044
16% פורמלדהיד (w/v), ללא מתנולThermo Scientific28906
צלחת 24 בארות, תרבית רקמות מטופלתקורנינג09-761-146
צלחת שחורה 96-באר, תרבית רקמות מטופלתקורנינג07-200-565
alamar מגיב כדאיות תאיםכחולים InvitrogenDAL1025
נוגדן נגד אזרין, ארנב חד שבטיAbcamab40839משני בשימוש: אנטי ארנב Dylight 633
נוגדן Anti-pan Cadherin, ארנב פוליקלונליAbcamab16505משני בשימוש: אנטי ארנב Alexa 488
נוגדן צומת הדוק נגד ZO1, עז פוליקלונלAbcamab190085משני בשימוש: אנטי עז Alexa 488
BSASigma-AldrichA9418
Cellpose 2.0NANAמתקבל
ממיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי https://github.com/MouseLand/cellpose עם AiryscanZEISSLSM 880
DAPIInvitrogenD1306
נוגדן משני נגד עזים IgG (H+L), נוגדן משני Alexa Fluor 488InvitrogenA-11055
GlycineCytivaGE17-1323-01
נוגדן משני נגד ארנב IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
נוגדן משני נגד ארנב IgG (H+L), DyLight 633Invitrogen35562
סרום בקר עוברי מומת בחום (HI FBS)Gibco16140071
ImageJ 1.54fNIHNA
IMDMGibco12440079
LIVE/DEAD כדאיות/ציטוטוקסיות ערכה, לתאי יונקיםInvitrogenL3224
מגנזיום כלוריד, הקסהידראט (MgCl2 6 H2O)Sigma-AldrichM2393
מטריג'ל לתרבית אורגנואידים, קורנינג נטול פנול אדום356255מוזכר בכתב היד כמטריג'ל או מטריצת קרום בסיס.
מיקרוסקופ
, EVOSThermo ScientificEVOS M7000
OriginPro 2023 (64 סיביות) 10.0.0.154OriginLab CorpNA
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)Gibco15140122
פפטיד P (Ac,Ile,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)ניתןבמעבדהבהתאמה אישית על ידי פפטיד יצרנים כמו Bachem.
פפטיד P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)NAתוצרת מעבדהיכול להיות מיוצר בהתאמה אישית על ידי יצרני פפטידים כגון Bachem.
פפטיד P2 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Ile, Lys, Val, Ala, Val, NH2)NAמתוצרת מעבדהיכול להיות מיוצר בהתאמה אישית על ידי יצרני פפטידים כגון Bachem.
Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
תלוש כיסוי עגול, קוטר 10 מ"מVWR631-0170
מיקרוסקופ אלקטרונים סורקתרמו פישר - FEITENEO VS
Sterile 30 μ מסננת mSysmex04-004-2326
סוכרוזSigma-AldrichS1888
SW1222 קו תאיםECACC12022910
Triton x-100Thermo Scientific85111
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco25200056
Tween 20Sigma-AldrichP1379
מים טהורים במיוחדInvitrogen10977015
, מיקרוסקופ בהיר לייצר NA

מקורות

  1. Susapto, H. H., et al. Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs. Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).
  2. Loo, Y., et al. A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells. ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).
  3. Loo, Y., et al. Self-assembled proteins and peptides as scaffolds for tissue regeneration. Advanced Healthcare Materials. 4 (16), 2557-2586 (2015).
  4. Loo, Y., et al. Peptide bioink: self-assembling nanofibrous scaffolds for three-dimensional organotypic cultures. Nano Letters. 15 (10), 6919-6925 (2015).
  5. Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. -S. Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).
  6. Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).
  7. Kim, S., et al. Tissue extracellular matrix hydrogels as alternatives to Matrigel for culturing gastrointestinal organoids. Nature Communications. 13 (1), 1692(2022).
  8. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).
  9. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  10. Hauser, C. A., et al. Natural tri- to hexapeptides self-assemble in water to amyloid beta-type fiber aggregates by unexpected alpha-helical intermediate structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1361-1366 (2011).
  11. Lakshmanan, A., Zhang, S., Hauser, C. A. E. Short self-assembling peptides as building blocks for modern nanodevices. Trends in Biotechnology. 30 (3), 155-165 (2012).
  12. Rauf, S., et al. Self-assembling tetrameric peptides allow in situ 3D bioprinting under physiological conditions. Journal of Materials Chemistry B. 9 (4), 1069-1081 (2021).
  13. Bilalis, P., et al. Dipeptide-based photoreactive instant glue for environmental and biomedical applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (40), 46710-46720 (2023).
  14. Abdelrahman, S., et al. The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds. ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).
  15. Moretti, M., et al. Selectively positioned catechol moiety supports ultrashort self-assembling peptide hydrogel adhesion for coral restoration. Langmuir. 39 (49), 17903-17920 (2023).
  16. Alhattab, D. M., et al. Fabrication of a three-dimensional bone marrow niche-like acute myeloid Leukemia disease model by an automated and controlled process using a robotic multicellular bioprinting system. Biomaterials Research. 27 (1), 111(2023).
  17. Abdelrahman, S., et al. The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds. ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).
  18. Habibi, N., Kamaly, N., Memić, A., Shafiee, H. Self-assembled peptide-based nanostructures: smart nanomaterials toward targeted drug delivery. Nano Today. 11 (1), 41-60 (2016).
  19. Yan, Y., et al. Enhanced osteogenesis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by a functionalized silk fibroin hydrogel for bone defect repair. Advanced Healthcare Materials. 8 (3), 1801043(2018).
  20. Kisiday, J., et al. Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (15), 9996-10001 (2002).
  21. Hogrebe, N. J., et al. Independent control of matrix adhesiveness and stiffness within a 3D self-assembling peptide hydrogel. Acta Biomaterialia. 70, 110-119 (2018).
  22. Wu, F. J., Lin, H. C. Synthesis, self-assembly, and cell responses of aromatic IKVAV peptide amphiphiles. Molecules. 27 (13), 4115(2022).
  23. Cringoli, M. C., et al. Bioadhesive supramolecular hydrogel from unprotected, short d,l-peptides with Phe-Phe and Leu-Asp-Val motifs. Chemical Communications. 56 (20), 3015-3018 (2020).
  24. Pulat, G. O., Gökmen, O., Çevik, Z. B. Y., Karaman, O. Role of functionalized self-assembled peptide hydrogels in in vitro vasculogenesis. Soft Matter. 17 (27), 6616-6626 (2021).
  25. Pérez-Pedroza, R., et al. Fabrication of lumen-forming colorectal cancer organoids using a newly designed laminin-derived bioink. International Journal of Bioprinting. 9 (1), 633(2022).
  26. Ashley, N., Yeung, T. M., Bodmer, W. F. Stem cell differentiation and lumen formation in colorectal cancer cell lines and primary tumors. Cancer Research. 73 (18), 5798-5809 (2013).
  27. Yeung, T. M., Gandhi, S. C., Wilding, J. L., Muschel, R., Bodmer, W. F. Cancer stem cells from colorectal cancer-derived cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3722-3727 (2010).
  28. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  29. Pachitariu, M., Stringer, C. Cellpose 2.0: how to train your own model. Nature Methods. 19 (12), 1634-1641 (2022).
  30. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
  31. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  32. Humphries, M. J. Cell-substrate adhesion assays. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).
  33. Munevar, S., Wang, Y. -l, Dembo, M. Distinct roles of frontal and rear cell-substrate adhesions in fibroblast migration. Molecular Biology of the Cell. 12 (12), 3947-3954 (2001).
  34. Djomehri, S., Burman, B., González, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2018).
  35. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  36. Matthews, J. M., et al. OrganoID: A versatile deep learning platform for tracking and analysis of single-organoid dynamics. PLOS Computational Biology. 18 (11), 1010584(2022).
  37. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR × LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  38. Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319(2018).
  39. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578-100578 (2021).
  40. Yang, Z., Xu, H., Zhao, X. Designer self-assembling peptide hydrogels to engineer 3D cell microenvironments for cell constructs formation and precise oncology remodeling in ovarian cancer. Advanced Science. 7 (9), 1903718(2020).
  41. Yadav, N., et al. Ultrashort peptide-based hydrogel for the healing of critical bone defects in rabbits. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (48), 54111-54126 (2022).
  42. Alshehri, S., Susapto, H. H., Hauser, C. A. E. Scaffolds from self-assembling tetrapeptides support 3D spreading, osteogenic differentiation, and angiogenesis of mesenchymal stem cells. Biomacromolecules. 22 (5), 2094-2106 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

פפטידים בהרכבה עצמיתהידרוג'ל פפטידיתרבית אורגנואידיםהידרוג'לים ביו-פונקציונלייםאנליזת צביעה אימונוהיסטוכימיתמיקרוסקופיית פלואורסצנציההדפסת ביו-תלת-ממדיתאנליזת ImageJ
ייצור ואפיון אורגנואידים מסרטן המעי הגס SW1222 בקו תאים במטריצת פפטיד אולטרה-קצרה להרכבה עצמית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.